CN105200022A - 萤火虫荧光素酶热稳定性改造的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种多核苷酸序列，含有该多核苷酸序列的表达载体pET22b-label？1-linker-fl-linker-label？2，以及含有该表达载体的大肠杆菌。该大肠杆菌可表达萤火虫荧光素酶，该酶的热稳定性较现有萤火虫荧光素酶提高20-30℃，克服了原有酶热耐受性问题。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，涉及采用基因工程的方法提高酶热稳定性的方法，特别涉及利萤火虫荧光素酶热稳定性改造用的方法。
背景技术
荧光素酶(fireflyluciferase,LUC)是生物体内催化荧光素或者脂肪醛氧化发光的一类酶的总称。萤火虫荧光素酶是一种能将化学能转化为光能的高效生物催化剂。早在1884年，Dubois发现将萤火虫研磨后荧光很快会消失，添加萤火虫尾部的新鲜提取物后又能重现荧光。此后，他证实提取物中存在荧光素和荧光素酶的相互作用，并指出在有氧分子、ATP的条件下，虫光素酶可催化荧光素氧化并发出便于灵敏检测的荧光。其化学反应如下：
荧光素+ATP+O2=氧化荧光素+AMP+PPi+CO2+光
在有过量酶和过量底物存在的条件下，发光强度与反应中存在的ATP量成正比。这种发光特性使得萤火虫荧光素酶在各种测定ATP的研究和生产中广泛使用，目前，萤火虫荧光素酶已被用作生物传感器，开发成ATP快速检测试剂盒，用于快速检测血液、奶粉、食品生产线、医疗环境等样本中污染的细菌细胞。目前市场上所售的荧光素酶多从萤火虫尾部提取，易受到地域和季节的限制，且繁殖周期长，养殖成本高，分离纯化复杂。利用基因工程菌发酵生产荧光素酶具有周期短、不受季节、地域影响、成本低、过程易于规范控制等诸多优点，受到了人们的广泛关注。早在1985年，Jeffery等人首次克隆了萤火虫荧光素酶基因，并构建了含虫光素酶基因的重组载体pkw101，在E.coli中成功实现表达，获得了具有活性的荧光素酶。1993年，Lu等人构建了一株可高效分泌荧光素酶的大肠杆菌，从而使得基因工程菌规模化生产荧光素酶成为可能。目前，Promega、Sigma以及沈阳中科靓马公司已相继推出来自于大肠杆菌基因工程菌的荧光素酶。但与来自于萤火虫的荧光素酶相比，利用基因工程的方法生产的荧光素酶存在热稳定性较差等缺陷，严重制约了荧光素酶的应用。
本发明利用基因工程的方法对萤火虫荧光素酶进行改造，通过N、C末端融合表达label1、label2，基于label1、label2共价结合的特性，改变荧光素酶的现有结构，以提高萤火虫荧光素酶的热稳定性。
发明内容
本发明的技术目的之一在于提供一种基因工程的方法，从而解决酶稳定性差的缺陷；
本发明的另一技术目的在于提供一种基因序列，该序列可通过表达载体转入工程菌中，从而表达生成萤火虫荧光素酶，该萤火虫荧光素酶粗酶液热稳定性可明显提高，从而解决萤火虫荧光素酶热稳定性差的缺陷。
进一步的，为了达到本发明的目的，本发明的技术方案为：
一种提高酶热稳定性的方法，包括在现有基因的N端至少连接如lable1所述的序列，且在同一基因的C端至少连接如lable2所述的序列，其中，label1、label2能够共价结合，lable1与lable2的序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示。
一种能够表达合成萤火虫荧光素酶的多核甘酸序列，其序列如SEQIDNO.3所示。
本方案中包含了上述核苷酸序列的重组表达载体。
在一个优选的载体T-label1-linker-fl-linker-label2中，可采用如下步骤构建获得：
（1）以label1基因为模板，设计引物1和引物2，通过PCR的方法获得C端连有linker的label1的PCR产物，命名为label1-linker；
（2）以荧光素酶基因fl为模板，设计引物3和引物4，通过PCR的方法，获得N端连有linker的荧光素酶基因fl的PCR产物，命名为linker-fl；
（3）步骤（1）、（2）获得的PCR产物混合，作为模板，以引物1、4进行PCR获得label1-linker-fl，胶回收PCR产物；
（4）以荧光素酶fl基因为模板，设计引物5和引物6，通过PCR的方法获得C端连有linker的荧光素酶基因fl的PCR产物，命名为fl-linker；
（5）以label2为模板，设计引物7和引物8，通过PCR的方法，获得N端连有linker的label2的PCR产物，命名为linker-label2；
（6）步骤（4）、（5）获得的PCR产物混合，作为模板，以引物5、8进行PCR获得fl-linker-label2，胶回收PCR产物；
（7）步骤（3）、（6）获得的PCR产物混合，作为模板，以引物1、8进行PCR获得label1-linker-fl-linker-label2，胶回收PCR产物；连接PMD19-TVector，得到重组载体T-label1-linker-fl-linker-label2。
其中，上述各步骤引物序列：
引物1序列：GGAATTCCATATGCTTATCAGTTAGTACATGGAAAG，
引物2序列：AATTCAGCTCGCATGGGCTATTACGCCAAAGAATCTTTGCCG；
引物3序列：CTTTGGCGTAATAGCCCATGCGAGCTGAATTATGGAAGACGC；
引物4序列：CAATTTGGACTTGCCGCCTTTTTTA；
引物5序列：ATGGAAGACGCCAAAAATATCAAA，
引物6序列:AATTCAGCTCGCATGGGCTATTACGCCAAAGCAATTTGGACTTG；
引物7序列：CTTTGGCGTAATAGCCCATGCGAGCTGAAT，
引物8序列：CCGCTCGAGGTTTGGTTGTATGATCCTAG。
本发明还提供了含有上述重组表达载体T-label1-linker-fl-linker-label2的大肠杆菌工程菌。
通过现有的发酵方法，可以在发酵培养基中发酵上述大肠杆菌工程菌以获得含有萤火虫荧光素酶的粗酶液。
利用该粗酶液，可以在不超过60℃的温度下，催化荧光素反应产生荧光。
其中，上述发酵培养的培养基为：大豆蛋白胨10~12g/L，葡萄糖10~20g/L，Na2HPO44~6g/L，K2HPO41~3g/L，NH4Cl0.5~1g/L，NaCl0.1~0.5g/L，MgSO4·7H2O0.1~0.5g/L，AMP，1uL/ML。
附图说明
图1label1-linker-fl-linker-label2构建过程。
图2pET22b-label1-linker-fl-linker-label2构建过程。
图3pET22b-label1-linker-fl-linker-label2质粒酶切电泳图。
图4改造前后荧光素酶SDS-PAGE图；
其中，WT：未改造的荧光素酶；label1-fl-lable2：在荧光素酶C端、N端添加lable1、lable2标签；label1-fl-lable-mutant在荧光素酶C端、N端添加lable1、lable2突变后的标签，使得lable1、lable2无法发生共价结合。
图5改造前后的萤火虫荧光素酶热稳定性比较。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域的公知手段。
实施例1萤火虫荧光素酶基因重组载体pET22b-label1-linker-fl-linker-label2的构建过程
label1-linker-fl-linker-label2构建过程的示意图如图1所示，具体的步骤为：
（1）以label1基因为模板，设计引物1和引物2，通过PCR的方法获得C端连有linker的label1的PCR产物，命名为label-linker；
PCR体系为：2×TaqPlusmastermix（Taq酶预混合溶液）12.5uL，模板DNA2uL，引物11uL，引物21uL，ddH2O8.5uL。PCR反应进程为：1）95℃预变性5min；2）94℃预变性30s；3）55℃退火30s；4）72℃延伸1.5min；步骤2）-4）重复29个循环；5）72℃继续延伸30s，冷却至4℃。胶回收PCR产物。
（2）以荧光素酶基因fl为模板，设计引物3和引物4，通过PCR的方法（退火时间按1000bp/min设计，其余同上），获得N端连有linker的荧光素酶基因fl的PCR产物，命名为linker-fl；
（3）步骤（1）、（2）获得的PCR产物混合，作为模板，以引物1、4进行PCR获得label1-linker-fl，胶回收PCR产物；
（4）以荧光素酶fl基因为模板，设计引物5和引物6，通过PCR的方法获得C端连有linker的荧光素酶基因fl的PCR产物，命名为fl-linker；
（5）以label2为模板，设计引物7和引物8，通过PCR的方法，获得N端连有linker的label2的PCR产物，命名为linker-label2；
（6）步骤（4）、（5）获得的PCR产物混合，作为模板，以引物5、8进行PCR获得fl-linker-label2，胶回收PCR产物；
（7）步骤（3）、（6）获得的PCR产物混合，作为模板，以引物1、8进行PCR获得label1-linker-fl-linker-label2，胶回收PCR产物；连接PMD19-TVector，得到重组载体T-label1-linker-fl-linker-label2。
将重组载体T-label1-linker-fl-linker-label2转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株，将原始菌体涂于含有50mg/L氨苄青霉素的LB培养基平皿，分离抗氨苄青霉素的转化体，测序鉴定，测序结果表明获得的核苷酸包括label1-linker-fl-linker-label2，序列如SEQIDNO.3所示。
（8）将重组载体T-label1-linker-fl-linker-label2和pET22b分别进行双酶切，酶切位点为NdeI和XhoI，双酶切反应体系如下：ddH2O30uL，10×M5uL，DNA基因12uL，NdeI1uL，XhoI1uL，37℃反应4小时以上，获得酶切产物1和2。
图3为pET22b-label1-linker-fl-linker-label2质粒酶切电泳图。
（9）用T4DNA连接酶将连接酶切产物1、2，得到重组载体
pET22b-label1-linker-fl-linker-label2（具体获得步骤如图2所示），连接反应体系如下：10×T4DNA连接酶缓冲液2.5uL，DNA片段8uL，载体2uL，T4DNA连接酶1uL，ddH2O11.5uL，16℃过夜反应。然后转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株，涂含有50mg/L氨苄青霉素的LB培养基平皿，分离抗氨苄青霉素的转化体，提质粒，通过质粒大小（2000左右）判断label1-linker-fl-linker-label2是否已连接上pET22b质粒。
实施例2萤火虫荧光素酶萤火虫荧光素酶的诱导表达及纯化
在超净台中挑取原萤火虫荧光素酶菌株（作对照）以及E1菌株的单菌落于加有50uLAMP的50mL的新鲜液体LB培养基，37℃，200rmp，震荡培养14-16h，以此为种子，按5%（体积比）的接种量接到50mL新鲜的LB培养基（加50uLAMP），37℃，200rmp震荡培养至OD值为14~1.5，然后加入终浓度为1mol/L的IPTG100uL，进行诱导7h，收集A、B(对照)、C、D(E1菌株)四管2mL菌液，然后12000rmp离心1min，弃上清，菌泥用2mLpH为7.0的PBS缓冲液重悬，然后在重悬液中各加入10uL溶菌酶和DNA酶；液氮反复冻融5次，破碎菌体，12000rmp离心1min，上清液过镍柱进行纯化。SDS-PAGE电泳显示，链接labelI、label2标签后，荧光素酶的结构发生改变，如图4所示。
实施例3萤火虫荧光素酶的热稳定性比较
对上述4管纯化后的酶分别进行酶活测定，实验设3次重复。将收集液进行SDS-PAGE电泳，并进行灰度扫描定量和计算，酶蛋白的纯度大于98%。将所搜集的四管酶液各取1ml置于60℃水浴锅中，实验结果表明，改造后的萤火虫荧光素酶热稳定性明显高于未经改造的萤火虫荧光素酶的热稳定性，如图5所示。用Promega手持ATP发光记录检测仪记录10秒钟内光的输出量（RLU），用光输出量RLU（Relativelightunit）表示酶活。酶活标准反应条件：2uL酶液，0.15mg/mL的荧光素（Promega），1mMDTT，5mMMgSO4，25mMTricine（pH7.8），10-6MATP，室温下反应10s。
可以知道，上述实施例仅为了说明发明原理而采用的示例性实施方式，然而本发明不仅限于此，本领域技术人员在不脱离本发明实质情况下，可以做出各种改进和变更，这些改进和变更也属于本发明的保护范围。
序列表
<110>南京工业大学
<120>萤火虫荧光素酶热稳定性改造的方法
<130>xb15110301
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cgtaatagcccatgcgagctgaattagggtccagttatctaggatcatacaaccaaac2158
Claims (9)
1.一种提高酶热稳定性的方法，包括在现有基因的N端至少连接如lable1所述的序列，且在同一基因的C端至少连接如lable2所述的序列，其特征在于，lable1与lable2能够共价结合，序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示。
2.一种能够表达合成萤火虫荧光素酶的多核甘酸序列，其特征在于，其序列如SEQIDNO.3所示。
3.含有如权利要求2所述的核苷酸序列的重组表达载体。
4.一种能够表达合成萤火虫荧光素酶的载体T-label1-linker-fl-linker-label2，其特征在于，采用如下步骤构建获得：
（1）以label1基因为模板，设计引物1和引物2，通过PCR的方法获得C端连有linker的label1的PCR产物，命名为label1-linker；
（2）以荧光素酶基因fl为模板，设计引物3和引物4，通过PCR的方法，获得N端连有linker的荧光素酶基因fl的PCR产物，命名为linker-fl；
（3）步骤（1）、（2）获得的PCR产物混合，作为模板，以引物1、4进行PCR获得label1-linker-fl，胶回收PCR产物；
（4）以荧光素酶fl基因为模板，设计引物5和引物6，通过PCR的方法获得C端连有linker的荧光素酶基因fl的PCR产物，命名为fl-linker；
（5）以label2为模板，设计引物7和引物8，通过PCR的方法，获得N端连有linker的label2的PCR产物，命名为linker-label2；
（6）步骤（4）、（5）获得的PCR产物混合，作为模板，以引物5、8进行PCR获得fl-linker-label2，胶回收PCR产物；
（7）步骤（3）、（6）获得的PCR产物混合，作为模板，以引物1、8进行PCR获得label1-linker-fl-linker-label2，胶回收PCR产物；连接PMD19-TVector，得到重组载体T-label1-linker-fl-linker-label2。
5.根据权利要求4所述的载体T-label1-linker-fl-linker-label2，其特征在于，所述引物序列为：
引物1序列：GGAATTCCATATGCTTATCAGTTAGTACATGGAAAG；
引物2序列：AATTCAGCTCGCATGGGCTATTACGCCAAAGAATCTTTGCCG；
引物3序列：CTTTGGCGTAATAGCCCATGCGAGCTGAATTATGGAAGACGC；
引物4序列：CAATTTGGACTTGCCGCCTTTTTTA；
引物5序列：ATGGAAGACGCCAAAAATATCAAA；
引物6序列:AATTCAGCTCGCATGGGCTATTACGCCAAAGCAATTTGGACTTG；
引物7序列：CTTTGGCGTAATAGCCCATGCGAGCTGAAT，
引物8序列：CCGCTCGAGGTTTGGTTGTATGATCCTAG。
6.含有如权利要求4所述重组表达载体的大肠杆菌工程菌。
7.一种含有萤火虫荧光素酶的酶液，其特征在于，由权利要求6所述的大肠杆菌工程菌在发酵培养基中发酵培养表达、纯化获得。
8.根据权利要求7所述的酶液，其特征在于，该粗酶液可以在不超过60℃的温度下，催化荧光素反应产生荧光。
9.根据权利要求7所述的酶液，其特征在于，所述发酵培养的培养基为：大豆蛋白胨10~12g/L，葡萄糖10~20g/L，Na2HPO44~6g/L，K2HPO41~3g/L，NH4Cl0.5~1g/L，NaCl0.1~0.5g/L，MgSO4·7H2O0.1~0.5g/L，AMP，1uL/ML。
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