CN105189741A

CN105189741A - 一种棉花ATP水解酶ATPase-2及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN105189741A
Application number: CN201380074519.8A
Authority: CN
Inventors: 何云蔚; 崔洪志; 王建胜; 田大翠; 梁丽
Original assignee: Genesis Seed Industry Co ltd
Current assignee: Genesis Seed Industry Co ltd
Priority date: 2013-06-24
Filing date: 2013-06-24
Publication date: 2015-12-23
Anticipated expiration: 2033-06-24
Also published as: CN105189741B; WO2014205596A1

Abstract

提供一种植物蛋白质及其编码基因与应用，特别是一个来源于棉花的ATP水解酶及其编码基因，以及其在培育耐盐性提高的转基因植物中的应用。

Description

一种棉花 ATP水解酶 ATPase-2及其编码基因与应用

技术领域本发明涉及植物蛋白及其编码基因与应用，特别是涉及一个来源于棉花的 ATP水解酶 ATPase-2及其编码基因，以及其在培育耐盐性提高的转基因植物中的应用。

背景技术盐胁迫是世界农业生产最重要的非生物逆境危害之一，盐渍土壤通常以钠盐、钙盐或镁盐为主，成为影响植物生长、导致粮食和经济作物减产的主要因素。世界上盐碱土的面积约有 4亿公顷，占灌溉农田的 1/3。盐碱地在中国分布广泛，现有盐碱地面积约 0. 4亿公顷。随着我国人口增加，耕地减少，盐碱地资源的开发利用有着极其重要的现实意义。而植物抗盐碱、耐干旱能力的提高和适宜在盐碱地上生长并具有较高经济和生态价值的植物种或品系的选育，则是利用盐碱地经济、有效的措施。对绝大多数农作物来说，大多数植物对盐碱、干旱的耐受性差，只能生长在氯化钠含量为 0. 3% 以下的土壤上，土壤中过量的 Na⁺会对植物体的正常的生长代谢产生毒害作用。因此如何在盐渍环境下提高作物产量就成为全世界农业生产中十分重要的问题。

植物的耐盐性是一个十分复杂的数量性状，其耐盐机制涉及从植株到器官、组织、生理生化直至分子的各个水平。各国的科学家也为此做了大量的工作，并取得了很多新进展，特别在利用高等模式植物拟南芥来研究植物的耐盐分子机理方面，使该领域的研究有了突破性的进展（Zhu JK. 2002. Salt and drought stress singal transduction in plants. Annu. Rev. Plant Biol. 53 : 1247- 1273 ; Zhang ZL. 201 1. Arabidopsis Floral Initiator SKB 1 Confers High Salt Tolerance by Regulating Transcription and Pre-mRNA Splicing through Altering Histone H4R3 and Small Nuclear Ribonucleoprotein LSM4 Methylation. Plant Cell, 23 : 396-41 1 ) 。高等植物细胞可通过多种途径感受外界环境中物化参数的变化，从而将胞外的信号转化为胞内信号，通过系列的信号传导最后将胁迫信号传递至细胞核内，激活转录因子，而被激活的转录因子再作用于功能基因，启动逆境应答基因的表达从而提高植物的耐逆性。尽管研究者已从不同侧面开展了大量研究，但由于其机制十分复杂，植物抗盐中的许多重要问题仍有待探索。例如，植物抗盐的关键因子仍未找到；植物耐盐的分子机制并不十分清楚 ₍

发明内容本发明人利用 SSH (抑制差减杂交）与 RACE ( cDNA末端快速扩增）相结合的方法克隆了棉花的一个 ATP水解酶（本文命名为 ATPase-2 ) 的编码基因，并测定了其 DNA序列。并且发现通过转基因技术将其导入植株后，可明显改善转基因植株的耐盐性，而且这些性状可稳定遗传。

本发明第一方面提供棉花的一个 ATP水解酶 ATPase-2的编码基因（本文命名为 GhA TPase-2 ) ，其序列为 SEQ ID NO： 2。

本发明第二方面提供一种重组表达载体，其含有本发明第一方面所述的基因，其是通过所述基因插入到一种表达载体而获得的，并且所述基因的核苷酸序列与所述重组表达载体的表达控制序列可操作地连接；优选地，所述表达载体是 pCAMBIA2300 _; 优选地，所述重组表达载体为附图 2所示的 35 S-GhATPase-2-2300载体。

本发明第三方面提供一种重组细胞，其含有本发明第一方面所述的基因或者本发明第二方面所述的重组表达载体；优选地，所述重组细胞为重组农杆菌细胞。

本发明第四方面提供一种改善植物耐盐性的方法，包括：将本发明第一方面所述基因或者本发明第二方面所述的重组表达载体导入植物或植物组织并使所述基因表达；优选地，所述植物是拟南芥。

本发明第五方面提供一种制备转基因植物的方法，包括：在有效产生植物的条件下培养含有本发明第一方面所述基因或者本发明第二方面所述的重组表达载体的植物或植物组织；优选地，所述植物是拟南芥。

本发明第六方面提供本发明第一方面所述的基因、本发明第二方面所述的重组表达载体或者本发明第三方面所述的重组细胞用于改善植物耐盐性以及用于植物育种的用途；优选地，所述植物是拟南芥。

本发明第七方面提供由本发明第一方面所述的基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如 SEQ ID NO : 1所示。附图说明

图 1是 GhATPsae-2基因的植物表达载体（ 35S-GhATPase-2-2300 ) 构建流程（图 la-lb) 。

图 2是 GhATPase-2基因的植物表达载体（35S-GhATPase-2-2300 ) 的质粒图。

图 3是转 GhATPase-2基因的的 T 1代拟南芥植株的耐盐实验结果， Tli5表现出明显的耐盐性， T lil3、 T 1U6的结果与其类似，在此未示出。

图 4 为利用反转录 PCR 对 1\代转基因拟南芥植株和非转基因对照植株中 GhATPase-2 基因的转录水平进行分子水平检测的结果。 M 为 DNA Ladder Marker ( DL2000 ) ， 1-8为耐盐 T1代转基因拟南芥植株（分别属于 Tli5、 Tlil3、 Tlil6三个株系）， 9为质粒 PCR阳性对照（35S-GhATPase-2-2300质粒）， 10-13为非转基因对照拟南芥植株，。

具体实施方式提供以下实施例，以方便本领域技术人员更好地理解本发明。所述实施例仅出于示例性目的，并非意在限制本发明的范围。

下面实施例中提到的未注明来源的限制性内切酶均购自 New England Biolabs公司。实施例 1. 盐胁迫下棉花 SSH文库构建：

具体方法为：

按照 Clontech公司的 PCR-select^TM cDNA Subtraction Kit试剂盒说明书所示的方法通过抑制差减杂交方法构建 SSH文库（抑制差减文库）。在实验过程中以盐处理的棉花根组织中提取的 mRNA作为样本（Tester) , 以未处理的棉花根组织中提取的 mRNA 作为对照（Driver) 。具体步骤如下：

( 1 ) 供试材料：

非洲棉（国家棉花中期库，获取单位中国棉花研究所，统一编号： ZM-06838 ) 播种到灭过菌的蛭石上，在 25 °C、光暗周期 16h/8h条件下培养，每周浇 1/2MS培养基 ( 9. 39 mM KN0₃， 0. 625 mM KH2P0₄， 10. 3 mM NH₄N0₃， 0. 75 mM MgS0₄， 1. 5 mM CaCl₂， 50 μ M KI , 100 μ M H₃B0₃ , 100 μ M MnS0₄， 30 μ M ZnS0₄， 1 μ M Na₂Mo0₄， 0. 1 μ M CoCl₂， 100 μ M Na₂EDTA, 100 μ M FeS0₄) 一次。当苗株长高达 25-30 cm时用于实验。

( 2 ) 材料处理：

将供试幼苗分为 2组，每组 4株。第一组为对照组，在 25 °C、光照下培养，放置到 1/2MS液体培养基中。第二组为处理组， 25 °C、光照下培养，放置到添加有终浓度为 200 mM NaCl的 1/2MS液体培养基中，处理 6小时，处理完毕后及时剪取两组幼苗的根，用液氮迅速冷冻后，于 -70 °C冰箱中保存。

( 3 ) 总 RNA提取：

分别取对照组和盐处理组的棉花根 0.5 g，用植物 RNA 提取试剂盒（购自 Invitrogen)提取总 RNA。用 HITACHI公司的紫外分光光度计 U-2001测定所得总 RNA 在 260 nm和 280 nm的吸光度值， OD₂₆。/OD₂₈。比值为 1.8-2.0，表明总 RNA纯度较高，用 1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测总 RNA的完整性， 28S条带的亮度约为 18S条带的 2倍，表明 RNA的完整性良好。使用 Qiagen公司的 Oligotex mRNA纯化试剂盒（从总 RNA中纯化 polyA+ RNA) 分离 mRNA。

( 4 ) 抑制差减杂交：

按 Clontech公司的 PCR-select^TM cDNA Subtraction Kit试剂盒说明书所示的方法进行抑制差减杂交。先将 Driver mRNA和 Tester mRNA分别反转录，得到双链 cDNA, 再以 2 μ g Tester cDNA和 2 μ g Driver cDNA作为起始材料进行差减杂交。在 37°C水浴下分别将 Tester cDNA和 Driver cDNA用 Rsa I酶切 1.5小时，然后将酶切后的 Tester cDNA分成两等份，连接上不同的接头，而 Driver cDNA不连接头。两种连有不同接头的 Tester cDNA分别与过量的 Driver cDNA混合，进行第一次正向差减杂交。将两种第一次正向差减杂交的产物混合，再与新变性的 Driver cDNA进行第二次正向差减杂交，通过两次抑制性 PCR扩增富集差异表达基因的片段（PCR进行前，第二次正向差减杂交产物进行末端补平）。

( 5 ) 差减文库的构建与初步筛选、克隆、鉴定

依照 pGEM-T Easy试剂盒（购自 Promega) 的说明书，将所述第二次正向差减杂交 cDNA片段的第二次抑制性 PCR扩增产物（使用 QIAquick PCR Purification Kit纯化，购自 Qiagen)与 pGEM-T Easy载体连接，其具体步骤如下：在 200 μ 1 PCR管中依次加入下列成分：纯化的合并后的正向差减杂交 cDNA 片段的第二次抑制性 PCR 产物 3 μ 1、 2 X T4 DNA连接酶缓冲液 5 μ 1、 pGEM-T Easy载体 1 μ 1、 Τ4 DNA连接酶 1 μ 1，于 4°C连接过夜。然后取 10 μ ΐ连接反应产物，加入到 100 μ 1感受态大肠杆菌 JM109感受态细胞（购自 TAKARA) 中，冰浴 30分钟、热休克 60秒、冰浴 2 分钟，然后加入 250 μ 1 LB液体培养基（含有 1%胰蛋白胨（Tryptone,购自 OXOID)、 0.5%酵母提取物（Yeast Extract, 购自 OXOID )禾 P 1% NaCl (购自国药））后置于 37°C 摇床中，以 225 rpm振荡培养 30分钟，然后从中取 200 μ 1菌液接种于含 50 μ g/ml 氨苄青霉素、 40 Qg/mL X-gal ( 5-溴 -4氯 -3-吲哚 - β -D-半乳糖苷）、 24 g/mL IPTG (异丙基 - β -D-硫代吡喃半乳糖苷）（X-gal/IPTG均购自 TAKARA) LB (同上）固体培养板上， 37°C培育 18小时。计数培养板中直径 > 1 mm的清晰白色及蓝色菌落，随机挑取 300 个白色菌落（编号： Gh-S2-001 至 Gh-S2-300 ) 。将所挑取白色菌落分别接种于 96孔细胞培养板（CORNING) 中的含 50 μ g/ml氨苄青霉素的 LB液体培养基（同上）中， 37 °C培养过夜后加甘油至甘油终浓度为 20% (体积比），然后于 - 80°C保存备

>

J •

用。使用巢式 PCR弓 I物 Primer 1和 Primer 2R(来自 Clontech公司的 PCR-select^TM cDNA Subtraction Kit试剂盒）对培养得到的菌液分别进行 PCR扩增验证，共验证 231个阳

>

性克隆，然后将所有阳性克隆送英潍捷基（上海）贸易 r、有限公司测序。

( 6 ) 差异克隆的 cDNA测序分析：

将 DNA测序结果去除载体和不明确序列及冗余的 cDNA后 i.- ，共得到 203个有效表达序列标签 (Expressed sequence tag, EST ) ( Unigene )

i.- 实施例 2棉花 ATP水解酶基因 GhATPase-2的克隆

将所述鉴定的棉花 SSH文库中来自菌落 Gh-S2-176的克隆子去掉冗余 DNA后，序列为 SEQ ID No: 3，序列分析表明该序列编码的蛋白属于 ATP水解酶。本文将 SEQ ID No : 3 序列对应的全长编码基因命名为 GhATPase-2，其对应的蛋白命名为 ATPase-2 o

SEQ ID No: 3

1 ACTGTTTATA AGCCAAACTC TAGATCACTT ΓΡ ΠΑΑΑΤΤΤ CTGGTAGTCC AACTGAGAAA

61 CTTGGGCTGT CTCAGATTTG GGGATGAACC TAGATGACCC AAAGCAAAAC

121 TACGAACTCA TCCAAGTAGA TCAGAGAAGA AGAGGAGTGG AGTTCTGATA

181 GTGAGAGTGG CGGTGCTACA GGA GGGTGC TGCTGAGATG

241 ATCTTGGCCA ATATTATGAT AGAAGTGGTG TAGTT ^GC CATTGACGAG

301 TAGAGATGGG GAGGATATGG CAGCCAAAAG

361 ATAGCATTTG CACACACACA AAATCCAAAA GACAATGAAC GAGTTTTGCA AGA^ GTGGA

421 CTCATCTTGC TAGGGCTGGT AGGTTTGA^A CAGAAAAGCA

481 GTAGAAGGTT GCATAAATGC ATCAAGAT A CAATATCTTC

541 GTATAGCAAG CGAATGAGGA TTTGAGGGAA 601 GCTGTAATAG AAGGTGT

GhATPase-2全长编码基因的克隆

根据已经获得的 SEQ ID No: 3序列，设计如下两条特异性引物，作为 3 ' RACE 的 5 ' 端特异性引物。

GhATPase-2 GSP1 : SEQ ID No: 4：

GTAGAAGCTT GCATAAATGC TG GhATPase-2 GSP2: SEQ ID No: 5：

ACAGCAAAGG CTATAGCAAC TGA

实验步骤按试剂盒说明书操作（ 3 ' RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends试剂盒购自 Invitrogen公司）。

用 SEQ ID NO: 4 与通用引物 AUAP (试剂盒自带），以盐处理组棉花提取的 mRNA反转录得到的 cDNA为模板进行第一轮 PCR扩增。具体步骤如下：

50 μ 1 PCR反应体系： 5 μ 1 ΙΟ Χ Εχ Buffer 3 μ 1 2.5 mM 的 dNTP、 2.0 μ 1 cDNA、 1.0 μ 1 Ex Taq (购自 TAKARA) 、 10 μ M的引物 SEQ ID NO: 4和 AUAP各 2.0 μ ΐ以及 35 μ ΐ 双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5分钟， 33个循环（94°C变性 30秒， 58 °C退火 30秒， 72°C延伸 2分钟）， 72°C延伸 10分钟。

将所得的 PCR产物用双蒸水稀释 50倍后取 2.0 μ ΐ作为模板，用 SEQ ID NO: 5 与通用引物 AUAP进行第二轮 PCR扩增，具体步骤如下：

50 y l PCR反应体系： 5 μ 1 lO X Ex Buffer 3 μ 1 2.5 mM的 dNTP、 2.0 μ 1稀释的第一轮 PCR产物、 1.0 μ 1 Ex Taq 10 μ M的引物 SEQ ID NO: 5禾 P AUAP各 2.0 μ 1以及 35 μ 1的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5分钟， 33个循环（94°C变性 30秒， 58 °C退火 30秒， 72°C延伸 2分钟）， 72°C延伸 10分钟。

回收第二轮 PCR 产物中片段约为 1300 bp 的条带（Gel Extraction Kit 购自 OMEGA)，并将其连接于 pGEM-T Easy载体，然后转化到大肠杆菌 JM109感受态细胞中（具体方法同上），并将转化后的菌液涂布于含 50 g/mL氨苄青霉素、 40 ^glmL X-gaK 24 g/mL IPTG的 LB固体培养基上进行筛选。随机挑取 10个白色菌落分别接种于含有 50 g/ml氨苄青霉素的 LB液体培养基中， 37°C培养过夜后加甘油至甘油终浓度为 20% (体积比）， -80°C保存备用。用 SEQ ID NO: 5与通用引物 AUAP进行菌液 PCR扩增验证，得 4个阳性克隆，将 4个阳性克隆送至英潍捷基（上海）贸易有限公司测序测序，获得该基因的 cDNA的 3 ' 端。

根据已经获得的 GhATPase-2 基因片段，设计如下三条特异性引物，作为 5 ' RACE的 3 ' 端特异性引物。

GhATPase-2 GSP3： SEQ ID No: 6：

ATCATAATAT TGTGAGCACA TG

GhATPase-2GSP4: SEQ ID No: 7：

GGTTCATCCC CAAATCTGAG AC

GhATPase-2 GSP5 : SEQ ID No: 8：

GGACTACCAG AAATTTCAGG AAG 实验步骤按试剂盒说明书操作（ 5 ' RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends试剂盒购自 Invitrogen公司）。

用 SEQ ID NO: 7与通用引物 AAP (试剂盒自带），以盐处理组棉花提取的 mRNA 反转录得到的 cDNA (反转录引物 SEQ ID NO: 6， dCTP加尾）为模板进行第一轮 PCR扩增，具体步骤如下：

50 μ 1 PCR反应体系： 5 μ 1 ΙΟ Χ Εχ Buffer 3 μ 1 2.5 mM 的 dNTP、 2.0 μ 1 cDNA、 1.0 μ 1 Ex Taq (购自 TAKARA) 、 10 μ M的引物 SEQ ID NO: 7和 AAP各 2.0 μ 1以及 35 μ 1的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5分钟， 33个循环（94°C 变性 30秒， 55 °C退火 30秒， 72°C延伸 2分钟）， 72°C延伸 10分钟。

将所得的 PCR产物用双蒸水稀释 50倍后取 2.0 μ ΐ作为模板，用 SEQ ID NO: 8 与引物 AUAP进行第二轮 PCR扩增，具体步骤如下：

50 l PCR反应体系： 5 μ 1 lO X Ex Buffer 3 μ 1 2.5 mM的 dNTP、 2.0 μ 1稀释的第一轮 PCR产物、 1.0 μ 1 Ex Taq 10 μ M的引物 SEQ ID NO: 8禾 P AUAP各 2.0 μ 1以及 35 μ 1的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5分钟， 33个循环（94°C变性 30秒， 58 °C退火 30秒， 72°C延伸 2分钟）， 72°C延伸 10分钟。

回收第二轮 PCR 产物中片段约为 1700 bp 的条带（Gel Extraction Kit 购自 OMEGA) ，并将其连接于 pGEM-T Easy载体，然后转化到大肠杆菌 JM109感受态细胞中（具体方法同上），并将转化后的菌液涂布于含 50 g/mL氨苄青霉素、 40 ^glmL X-gaK 24 g/mL IPTG的 LB固体培养基上进行筛选。随机挑取 10个白色菌落分别接种于含有 50 g/ml氨苄青霉素的 LB 液体培养基中， 37°C培养过夜后加甘油至甘油终浓度为 20% (体积 c比）， -80°C保存备用。用 SEQ ID NO: 8与引物 AUAP进行菌液 PCR 扩增验证（反应体系及反应条件同上），得到 6个阳性克隆，选取其中 4个克隆送至英潍捷基（上海）贸易_) r有限公司测序，获得该基因的 cDNA 的 5 ' 端。所得的

['-- 5 'RACE产物克隆测序后广、，D将其与上述 3'RACE产物测序结果以及 SEQ ID

>

No: 3序列进行拼接，获得 G L JPove-2全长 cDNA序列 SEQ ID No: 9

1 CTTCTTTTAC TTCCTTTCCA TCACTCATAG TTTTAACCCT TCTTTCCTAC CGTTTTA¾CA

61 TGTCGTTAAG ACACCGC^AC ACAGGTTACC TAGAACCAGC 、- GGAG^AGATA

121 CTCCA TAGT GA^ATGCCAG CACCGAAGGT GGCGTTCGGT ATATATTCTG

181 CCAGGATTTT TGTTTCTTTG T oTATCAACAA GAAACAGATA TTGCGTAGTC

['--

241 TTTCCTACAT GTCCATGACA GTGACTCGAG TGATGATCGC

>

301 _Tn-nTGTTGA TCAGAA^ CA >

361 GTAAACTTGG AGGCGTGAAA CAGATTGCTG ¾AGTCTTGA AACTGATAAG AAAGATGGTA

421 TCAGTGCTA TGAAGCTGAT GGGTCAATGT A麵TTCGGTGCC AACAGGTATC

481 AGAAACCACC TA^AAAAAGC TTTT TAGCT TTGTTTATGA AGCTTT ¾AA GATACCACCA

541 TTATCATACT CTTGGTTTGT CTCTGGGCTT TGGCATCAAA CAGCATGGCA

601 TAACGGATGG GGTGGGAGTA GTTGTTGCTG

D

661 AAGCAAAACA GACAATTCGA AAGGAGAGTA

721 GTGATATAAA AGTGGAAGTA GTGAGAGATG A TTA ATCA GTCTTTGAAG

781 TGCTTGAAAA TTGGTGATGA AATTCGAGCG

841 TCT GGA GG AAGGTGGATG AATGTAGCAT GACCGGTGAA ZiGCGACCATG

901 TTGAGATGAA TGGCAGCAAC TTCTTTCTGG TACAAAGGTC ACAAATGGGT

961 TCGGTTCAAT TGAATACGGC A GGGGGGAG ZiTGATGAGTT

1021 CCA A^\CCG GAAGAAACTC TGGCCTCAAG AAGCTGACTT

1081 CTGCAAT GG GAAGA TGGA TCTTGGAGTG CTGCTTATTC

1141 'TGGAAACACA AAAGATGACC AGAATATAT CGAGGCAAGA

CAAAGTT GA CAGCA GATG AACTCAGTCG TGGAGATAAT TTCAGCAGCA AT ACCATCG

1261 AATTCCAGAA GGTCTTCCTT TGGCAGTGAC CCTAACTTTG GCCTATTCTA

1321 TGAAGCAAAT GATGGCTGAT TCAGA kCT TTCAGCTTGC GAGACGATGG

1381 GTTCAGCCAC AACAATCTGC ACAGATAAGA CAGGTACCCT TACTTTA ^A GAAATGAAGG

"ϊ 4 1 TTATGGAGTT TTGGC AGGG AAAGAATTAA TTCCTCAGAA ATAGCACCTA

1501 ATG CCATAA GTTACTGCAA CAAGCGGTTG CTC CAACAC AACCGGTAC GTTTATAAGC

1561 CAAACTC AG ATCAC TCCT GAAATTTCTG GTAGTCCAAC TGAGAAAGCA AT CTCTCTT

1621 GGGCTGTCTC AGATTTGGGG ATGAACCTAG ATGACCCAAA GCAi^-ACTAC GAACTCA CC

1681 AAGTAGAGGC CTTCAATTCA GAGAAGAAGA GGAGTGGAGT TCTGA AAGG AGGAAGAGTG

1741 AGAGTGGCGG TGCTACACAG AGGGTGCTGC TGAGATGATC TTGGCCATGT

1801 GCTCACAATA TTATGATAGA AGTGGTGTAG TTA AGCCAT TGACGAGGA , GAAAGAGTAG 1861 AGATGGGGAA AGTTATTGAG GATATGGCAG GCATTTGCAC

1921 ACACAC A ^ATGAACGAG TTTTG¾AGA AAGTGGACTC ATCTTGCTAG

1981 TTTGAAAGAC CCATGTCGTC CTGGTGTCAG A AAGCAGTA GAAGCTTGCA

2041 TAAATGCTGG AGT^A¾CATC ^AGATTAT^A CTGGAGACAA TATCTTCACA GC AAGGCTA

21 01 TAGCAACTGA ATGTGGCATT TTGC^ACCCA A T GAGGAT T T GAGGGAAGCT GTAATAGAAG

2161 GTGTACAGTT CCG^A¾TTAC TCACCAGAAG A^AGAATGGC TAAGATCAAC AA ATTTGTG

2221 TAATGGCCAG ATCCTCACCT TTTGACA^ C TTCTGATGGT ACAGTGTCTA AAGCAGAATG

2281 GTCATGTTGT AGCAGTCACT GGGGACGGCA CCAATGATGC ACCAGCTTTA AAGGAAGCAG

23 1 ATATTGGACT TTCGATGGGA ATCCAAGGAA CAGAAGTTGC CAAGGAAAGC TCAGACATA

2401 TCATTTTGGA TGATAACTTT ACTTCTGTGG TGACTGTTTT AAGGTGGGGT AGGTGTGTCT

2461 TCAATAACAT TCAGAAATTC ATTCAGTTTC AGCTTACAGT GAATATAGCA GCACTAGTCA

2521 TCAACTTCAT TGCTGCAGTA TCTTCTGGTG A^ATCCCATT GACAGCAGTC CAACTATTGT

2581 GGGTGAACTT AATAATGGAT ACGT TGGGG CTTTAGCTTT GGCCACTGAG CGACCTACCA

2641 ATGATCTCAT GAC¾AAGCCA CCTGTGGGTC GATCCAAGCC CCTCATATCC AACATCATGT

2701 GGAGGAACCT CATTGCTCAA GCCTTGTATC AGGTTGCAGT TCTGCTAACC CTTCAGTTCA

2761 GGGGAAAATT TATCT TGAT GTGGATAAAA AGGTCAATAA CACAC TATT TTGAACACTT

2821 TTG CCTCTG GCAAGTGTT AATGAG'TTCA ATGCCAGAAA A C T T Gi-iAAAG AAGAATA'TAT

2881 TCCAGGGACT ACACAAGAAC AAACTCTTTC T/iGGGATCAT TGCCA AACC ATAATTCTTC

2941 AAG GGTAAT GGTGGAATTC TTGAAGAGGT TTGGTAACAC TGAGAGGCTG AACTGGGGGC

3001 AATGGGG AC TTGTA TGGA AT GCAGCTT TGTCCTGGGC ACTTGGCTGG CTAGTTAAGT

3061 GGA TCCAGC ATGAAAAAAA ATCCTC TCT CGG CACAAG GGTTTTGCA CCAAAAAAAA

3121 T/iCCAGT AG CTCCAATGAG ATGCTCCTTT TCA TTATAT AGAACGTTAG GAATATCAGT

3181 ATA AACCTT GGTACAATT'T CTTTTA TAT TCTAATGCAG TATTTTAAT TCCTTCTGTT

3241 CACTATT AT CTCGG TCTA GT CATTTTA AGAGTTGAAT TTGTAAGCTT CTATGTGAAC

3301 AATGAAGATA GTATGCAT 根据 SEQ ID NO: 9序列设计一对引物如下:

SEQ ID No: 10：

ATGTCGTTAA GACACCGCAA CA SEQ ID No: 11：

TC ATGCTGGA ATCC ACTTAA CTA 通过 SEQ ID NO: 10和 SEQ ID NO: 11来克隆 G/L4 Pa -2全长编码基因。采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶，以上述棉花的 cDNA为模板进行 PCR反应。 50 y l PCR反应体系： 10 y l 5 X PS Buffer、 3 μ 1 2.5 mM的 dNTP、 2.0 μ 1 cDNA 1.0 μ 1 PrimeSTAR HS DNA聚合酶、 10 μ M的引物 SEQ ID NO: 10和 SEQ ID NO: 11各 2.0 μ 1以及 30 μ 1的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5分钟， 33个循环（94°C变性 30秒， 58 °C退火 30秒， 72 °C延伸 3分钟）， 72°C延伸 10 分钟。

PCR扩增产物加 A尾： PCR产物中加入 2.5倍体积的无水乙醇， -20°C放置 10分钟，离心，去上清，晾干，然后用 21 μΐ双蒸水溶解所得沉淀。然后向其中加入 2.5 μ 1 lOXEx Buffer 0.5 μ 15 mM的 dATP、 1.0 lExTaq。反应条件： 70°C反应 30分钟。将得到的约 3000 bp的 DNA片段回收（Omega回收试剂盒），并将其连接至 pGEM T-easy载体上得到 GhATPase-2-pGEM质粒，然后将连接产物转化大肠杆菌 JM109感受态细胞中（方法同上），并将转化后的菌液涂布于含 50 g/mL氨苄青霉素、 40 g/mL X-gaK 24 g/mLIPTG的 LB固体培养基上进行筛选。随机挑取 10个白色菌落分别接种于含有 50 g/ml氨苄青霉素的 LB 液体培养基中， 37°C培养过夜后加甘油至甘油终浓度为 20% (体积比）， -80°C保存备用。用 SEQ ID NO: 10与 SEQ ID NO: 11进行菌液 PCR扩增验证（反应体系及反应条件同上），得到 7个阳性克隆，选取其中 4 个阳性克隆送至英潍捷基（上海）贸易有限公司测序，所得序列为 SEQ ID NO: 2，其编码的蛋白质的氨基酸序列为 SEQ ID NO: 1。

ATPase-2蛋白的氨基酸序列： SEQ ID NO: 1

1 SLRHRNTGY LEPA SDGED

21 TPIVKCQHRR WRSVFAAIYS

41 ARIFVSLYKK IINKKQILRS

61 LSYIALDVHD SDSSDDRLPS

81 LGVDQKTLTE VVREKSLETL

101 SKLGGVKQIA ASLETDKKDG

121 ISANEADLAH RVNVFGANRY

141 QKPPKKSFFS FVYEAFKDTT

161 IIILLVCAVL SLGFGIKQHG

181 ITDGGYDGGS IVIAVFLVVA

201 VSAVSNFKQN RQFEKLSKES

221 SDIKVEVVRD GRRQFISVFE

241 VVVGDVVCLK IGDQIPADGL

261 FLDGHSLKVD ESS TGESDH

281 VEINGSNNPF VLSGTKVTNG

301 FGS LVTSVG NTAWGE S

321 SINRELDEET PLQARLNKLT

341 SAIGKIGLAV AVLVLAVLLI

361 RYFTGNTKDD QGNKEYIRGK

381 TKFDS NSV VEIISAAITI

401 VVVAIPEGLP LAVTLTLAYS 421 MKQMMADHAM VRKLSACETM

441 GSATTICTDK TGTLTLNEMK

461 V EFWLGKEL GSISSEIAP

481 NVHKLLQQAV ALNTTGTVYK

501 PNSRSLPEIS GSPTEKAILS

521 WAVSDLG NL DDPKQNYELI

541 QVEAFNSEKK RSGVLIRRKS

561 ESGGATQVHW KGAAE ILA

581 CSQYYDRSGV VKAIDEEERV

601 E GKVIED A AKSLRCIAFA

621 HTQNPKDNER VLQESGLILL

641 GLVGLKDPCR PGVRKAVEAC

661 INAGVNIKII TGDNIFTAKA

681 IATECGILQP NEDLREAVIE

701 GVQFRNYSPE ER AKINKIC

721 VMARSSPFDK LLMVQCLKQN

741 GHVVAVTGDG TNDAPALKEA

761 DIGLSMGIQG TEVAKESSDI

781 IILDDNFTSV VTVLRWGRCV

Q

801 FNNIQKFIQF QLTVNIAALV

821 INFIAAVSSG EIPLTAVQLL

841 WVNLIMDTFG ALALATERPT

861 NDLMTKPPVG RSKPLISNI

881 WRNLIAQALY QVAVLLTLQF

901 RGKFIFDVDK KVNNTLIFNT >

921 FVLCQVFNEF NARKLEKKNI

941 FQGLHKNKLF LGIIAITIIL

961 QVVMVEFLKR FANTQRLNWG

981 QWGTCIGIAA LSWPLGWLVK

1001 WIPA*

GhATPase-2基因的核苷酸序列 SEQ ID NO: 2

1 ATGTCGTTAA GACACCGCA , CACAGGTTAC CTAGAACCAG CCATGTCTGA TGGAGAAGAT

61 ACTCCAATAG TGAAATGCCA GCACCGAAGG TGGCGTTCGG TTTTTGCAGC CATATATTCT

121 GCCAGGATTT GTAC^AGA^A ATTATCAACA AGA^ACAGAT '. j H '

181 CTTTCCTACA TTGCCCTTGA TGTCCATGAC AGTGACTCGA GTGATGATCG CTTACCTTCT

241 CTCGGTGTTG ATCAGAA^AC ACTCACTGAG GTGGTAAGGG AGAAGAGCCT TGAAACCCTA

301 AGTAAACTTG GAGGCGTGAA GCAAGTCTTG AAACTGATAA GA AGATGGT

361 ATCAGTGCTA ATGAAGCTGA TCTTGCACAT CGGGTCAATG TATTCGGTGC

421 CAGAAACCAC TTTGTTTATG AGATACCACC 481 ATTATCATAC TCTTGGTTTG TGCTGTTCTC TCTCTGGGCT TTGGCATCAA ACAGCATGGC

541 ATA¾CGGATG GAGGGTACGA TGGTGGGAGT ATTGTCATTG CTGTCTTTCT AGTTGTTGCT

601 GTATCTGCTG TCAGTAACTT TA¾GCAAAAC AGACAATTCG AGA^ACTTTC ^ ^GGAGAGT

661 AGTGATATAA AAGTGGAAGT AGTGAGAGAT 、 ^ A¾TTTATATC AGTCTTTGAA

721 GTTGTCGTGG GTGATGTCGT GTGCTTGAi A ATTGGTGATC AAATTCCAGC GGATGGATTG

781 TTCTTGG EATG GACACTCTTT GAAGGTGGAT G^ATCTAGCA TGACCGGTGA AAGCGACCAT

84 1 GTTGAGATCA ATGGCAGCAA CAATCCTTTT GTTCTTTCTG G ACAAAGGT CACA^ATGGG

9

901 TTCGGTTCAA T EHGCTTGTTAC ATGAATACGG CATGGGGGGA GATGATGAGT

961 TCCATAAACC GTGAGTTAGA TGAAGAAACT CCATTACAGG CTCGCCTCAA CAAGCTGACT

TCTG ¾ATTG GGAAGATTGG ATTGGCAGTG GCTGTACTAG

1 081 CGTTACTTCA CTGGAAACAC AAAAGATGAC AAGAATATAT TCGAGGCAAG

1141 ACAGCATGAT H GAACTCAGTC GTGGAGATAA TTTCAGCAGC AATTACCATC

GTGGTdTTG CA TTCCAGA AGGTCT Cn^ TTGGCAGTGA CCCTAACTTT

E

1261 ATGAAGCA^ TGATGGCTGA TCATGCAATG GTCAGAAAAC TTTCAGCTTG

1321 CA CAATCTG CACAGATA G L ACAGGTACCC TTACTTTAAA TGAAATGAAG

] '--

1381 GTTATGGAGT GAAAGAATTA ATGGGCAGTA AA AGCACCT 44 _ L

AATGTCCATA AGTTACTGCA GCTCTCAACA (HU GTAC T '1 ATAAG

1501 GATCAGTTCC TGAAATTTCT GGTAGTC cCAA CTGAGAAAGC

1561 CAGATTTGGG GATGAAGCTA GATGACCCAA AGCAAAACTA

1621 CAAGTAGAGG CCTTCAATTC AGAGAAGAAG AGGAGTGGAG TTCTGATAAG GAGGAAGAGT

1681 GAGAGTGGCG GGTGCAGTGG AAGGGTGCTG CTTGGCCATG

1741 TGCTCACAAT Al'l'ATGATAG AAGTGGTGTA EH AGAAAGAGTA

18 01 GAGATGGGGA AAGTTATTGA GGATATGGCA GCCAA AGCT

1861 CACACACAAA ATCCAAAAGA CAATGAACGA GTTTTGCAAG AAAGTGGACT O O CA CTTGCTA

O

1921 GGGCTGGTAG GTTTGAAAGA CCCATGTCGT GAAAAGCAG AGAAGCT GC

H

1981 ATAAATGCTG GAGTAAACAT CAAGATTATA ACTGGAGACA ATATC TCAC AGCAAA LGGCT

E E

2 041 ATAGCAACTG AATGTGGCA TTTGCAACCC AATGAGGATT TGAGGGAAGC TGTAATAGAA

2101 GGTGTACAGT TCCGAAATTA CTCACCAGAA GAAAG-AATGG CTAAGATCAA CAAAATTTGT

2161 GTAATGGCCA GATCCTCACC TTTTGACAAA CTTCTGATGG TACAGTGTC AAAGCAGAAT

2221 GGTCATG TG TAGCAGTCAC TGGGGACGGC ACCAATGA G CACCAGCTTT AAAGGAAGCA

2281 GATATTGGAC TTCGATGGG AATCCAAGGA ACAGAAGTTG CCAAGGA ^AG CTCAGACATA

ATCATTT GG ATGATAACTT TACTTCTGTG GTGACTGT T TAAGG GGGG TAGGTGTGTC

24 01 TTCAATA¾CA TTCAGA^ATT CATTCAGTTT CAGCTTACAG TGAATATAGC AGCACTAGTC

2461 ATCAACTTCA TTGCTGCAGT ATCTTCTGGT G^A¾TCCCAT TGACAGCAGT CCAACTATTG

TGGGTGA¾CT TAATA¾TGGA GCTTTAGCTT TGGCCACTGA GCGACCTACC

2581 AATGATCTCA TGACAAAGCC ACCTGTGGGT CGATCCAAGC CCCTCATATC CAACATCATG

2641 TGGAGGA¾CC TCATTGCTCA AGCCTTGTAT CAGGTTGCAG TTCTGCTAAC CCTTCAGTTC

2701 AGGGGAAAAT TTATCTTTGA TGTGGATA^A AAGGTCAATA ACACACTTAT TTTCAACACT

2761 TTTGTCCTCT GCC^AGTGTT TA¾TGAGTTC ΑΆ.Τ G C C AG AA AACTTGA^AA GA¾GAATATA

2821 TTCCAGGGAC TACACAAGA , CAAACTCTTT CTAGGGATCA TTGCCAT^AC CATAATTCTT

2881 CAAGTGGTAA TGGTGGAATT CTTGAAGAGG TTTGCT^ACA GA¾CTGGGGG

¾ATGGGGTA TTGTCCTGGC CACTTGGCTG TGGATTCCAG 实施例 3 GhATPase-2基因的植物表达载体的构建

选择植物双元表达载体 pCAMBIA2300 (购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）作为植物表达载体，用 Pnos启动子替换 ΝΡΤΠ基因含双增强子的 35S启动子，以降低 ΝΡΤΠ 蛋白在植物中的表达。选择 35S 启动子及 Tnos 终止子分别作为 G/L4 Pa -2基因的启动子和终止子，构建流程图如图 1所示。

使用引物 SEQ ID NO: 12和 SEQ ID NO: 13，以植物表达载体 pBI121质粒（购自北京华夏远洋科技有限公司）为模板扩增 Pnos，采用 TaKaRa 的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶。 50 l PCR反应体系： 10 l 5 X PS Buffer、 3 μ 1 2.5 mM的 dNTP、 1.0 μ 1 ρΒΙ121质粒、 1.0 μ ΐ PrimeSTAR HS DNA聚合酶、 10 μ M的引物 SEQ ID NO: 12和 SEQ ID NO: 13各 2.0 μ ΐ以及 31 μ 1的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 分钟， 33个循环（94°C变性 30秒， 56°C退火 30秒， 72°C延伸 30秒）， 72 °C延伸 10 分钟。通过 EcoRI、 Bglll酶切将所得的 PCR产物按试剂盒说明（Promega, T4 连接酶试剂盒）连接到 pCAMBIA2300获得 pCAMBIA2300-l。

SEQ ID NO: 12

GCACGAATTC ggcgggaaac gacaatctga

SEQ ID NO: 13

ATCCAGATCTAGATCCGGTGCAGATTATTTG

用引物 SEQ ID NO: 14和 SEQ ID NO: 15以 pBI121质粒为模板扩增 Tnos, 采用 TaKaRa 的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶。 50 μ 1 PCR 反应体系： 10 μ ΐ 5 X PS Buffer 3 μ 1 2.5 mM的 dNTP、 1.0 μ 1 pBI121质粒、 1.0 μ 1 Prime STAR、 10 μ Μ的引物 SEQ ID NO: 14和 SEQ ID NO: 15各 2.0 μ 1以及 31 μ 1的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5分钟， 33个循环（94°C变性 30秒， 58 °C退火 30秒， 72 °C延伸 30 秒）， 72°C延伸 10分钟。通过 Kpnl、 EcoRI酶切将所得的 PCR产物连接（Promega T4 连接酶试剂盒）到 pCAMBIA2300-l获得 pCAMBIA2300-2。

SEQ ID NO: 14：

AAGGGTACCGAATTTCCCCGATCGTTCAAA SEQ ID NO: 15：

TCAGAATTCCCAGTGAATTCCCGATCTAGTA 用引物 SEQIDNO: 16和 SEQIDNO: 17以 pCAMBIA2300质粒为模板扩增 35S 启动子。采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶。 50 μ 1 PCR反应体系： 10 μ 1 5XPS Buffer、 3 μ 1 2.5 mM 的 dNTP、 1.0 μ 1 pCAMBIA2300 质粒、 1.0 μ 1 PrimeSTAR HS DNA聚合酶、 10 μ M的引物 SEQ ID NO: 16禾 P SEQ ID NO: 17各 2.0 μΐ以及 31 μΐ双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5分钟， 33个循环（94°C变性 30秒， 58°C退火 30秒， 72°C延伸 30秒）， 72°C延伸 10分钟。通过 HindIII、 Sail 酶切将所得的 PCR 产物连接（连接方法同上）到 pCAMBIA2300-2 获得 pCAMBIA2300-3。

SEQIDNO: 16：

ACTAAGCTTTAGAGCAGCTTGCCAACATGGTG

SEQIDNO: 17：

TGAGTCGACAGAGATAGATTTGTAGAGAGAGACT 用引物 SEQ ID NO: 18和 SEQ ID NO: 19扩增 G/^ Pa^-2编码基因的全长序列（模板是实施例 2所获得阳性 GhATPase-2-pGEM质粒），采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA 聚合酶。 50 μ 1 PCR 反应体系： 10 μΐ 5XPS Buffer 3 μ 1 2.5 mM 的 dNTP 1.0 μ 1 GhATPase-2-pGEM质粒、 1.0 μ 1 PrimeSTAR HS DNA聚合酶、 10 μ M 的引物 SEQIDNO: 18和 SEQIDNO: 19各 2.0 μ 1以及 31 μ 1双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5分钟， 33个循环（94°C变性 30秒， 58°C退火 30秒， 72°C延伸 3 分钟）， 72°C延伸 10分钟。通过 Sall、 Smal酶切将所得的 PCR产物连接（连接方法同上）到 pCAMBIA2300-3，经验证后获得植物表达载体 35S-GhATPase-2-2300 (图 2) 。

SEQIDNO: 18

ACTGTCGACATGTCGTTAAGACACCGCAACA SEQIDNO: 19

ACTCCCGGGTC ATGCTGGA ATCC ACTTAACTA

实施例 4 35S-GhATPase-2-2300表达载体转化农杆菌

农杆菌 LBA4404 (购自 Biovector Science Lab, Inc) 感受态细胞的制备：将农杆菌 LBA4404在含 50 μ g/ml利福平和 50 μ g/ml链霉素的 LB固体培养基上划单斑接种， 28°C培养 1至 2天。挑取单菌落接种于 5 ml含 50 μ g/ml利福平和 50 μ g/ml链霉素的 LB液体培养基中， 28°C下摇动培养过夜（约 12-16小时）至 OD₆。。值为 0.4，形成种子菌液。取 5 ml培养活化后的菌液（1 :20的比例）接种于 100 ml含 50 μ g/ml 利福平和 50 μ g/ml 链霉素的 LB 液体培养基中， 28 °C摇动培养 2-2.5 小时至 OD_6QQ=0.8。冰浴菌液 10 分钟，每隔 3 分钟摇匀一次，使所述细菌均匀进入休眠状态。于 4°C下 4000 g离心 10分钟，弃上清液；加入 1 ml冰预冷的 10% (体积比）甘油重悬浮菌体， 4°C下 4000 g离心 10分钟，收集沉淀；用冰预冷的 10% (体积比）甘油重复洗 3-4次；然后加入适量冰预冷的 10% (体积比）甘油重新悬浮细菌沉淀，即制得 LBA4404感受态细胞，以 40 μ ΐ/管将其分装，于 -70°C保存备用。

转化农杆菌：在冰上融化所述的 LBA4404感受态细胞，向 40 μ 1的所述感受态细胞中加入 1 μ 1实施例 3获得的质粒 35S-GhATPase-2-2300，混匀后冰浴约 10分钟。将冰浴后的感受态细胞和 35S-GhATPase-2-2300质粒的混合物用微量移液器转移到冰预冷的 0.1cm规格的电击杯（购自 Bio-Rad) 中，轻敲使悬浮液到达电击杯底部，注意不要有气泡。将所述电击杯放到电击室的滑道上，推动滑道将电击杯放至电击室基座电极处。将 MicroPulser (购自 Bio-Rad) 的程序设置为 "Agr" ，电击一次。立即取出电击杯，加入 28°C预热的 200 μ1 ίΒ培养基。快速而轻柔的用微量移液器将感受态细胞打匀。将悬浮液转入 1.5 ml的离心管，在 28°C下 225 rpm摇动培养 1小时。取 100-200 μ ΐ的菌液涂布于相应的抗性筛选培养基平板上（LB固体培养基，含 50 μ g/ml利福平、 50 μ g/ml链霉素、 50 μ g/ml卡那霉素）， 28°C培养。筛选阳性转化克隆，并将其菌液于 -70°C保存备用。实施例 5 受体材料拟南芥培养

选择吸水性好，土质松软的蛭石配合营养土（1 : 1 ) 作为拟南芥种植土壤。直径 9 cm的花盆，每盆播种 20-30颗种子（哥伦比亚型，来自美国俄亥俄州立大学的拟南芥生物资源中心）。播种以后在花盆上罩上薄膜，给植株的生长提供一个湿润的环境。恒温 22°C，光照强度 3500-4000 lx，光照周期为 12小时黑暗、 12小时光照培养，每 7天浇灌一次 1/2MS , 培养 30天后，每盆保留 4-5棵植株，光照周期调整为 8小时黑暗、 16小时光照培养，待大部分植株都抽薹之后，在花序基部剪掉整个主苔，去其顶端优势，约 1周后在腋芽部位长出 4-6 个新生侧苔，待侧苔花序形成花蕾并部分开花或形成 1-2个角果时，便可用于转化。实施例 6 拟南芥花浸转化：

将实施例 4获得的已转化表达载体 35S-GhATPase-2-2300的农杆菌菌液接种至含有 10-50μ₈/ηι1卡那霉素（kan) 的 LB液体培养基中培养过夜，第二天早上按 1:50接种至含有 50μ₈/ηι1卡那霉素的新的 LB培养基（1L) 中，培养约 8 个小时，至农杆菌液 OD600应当在 1.0到 1.2之间。室温 5000 rpm离心 5分钟，弃上清，将农杆菌沉淀悬浮于浸染培养基（ 1/2MS; 5%蔗糖；用 KOH调至 pH5.7; 0.02% Silwet L-77 ) 中，使 OD600在 0.8左右。将实施例 5制备的用于转化的拟南芥的上部缓缓、螺旋式浸入所述含农杆菌的浸染培养基内，轻轻顺时针晃荡，约 2分钟，用透明塑料罩盖严以保持湿度，放入温室过夜。 24小时后移去塑料透明罩，用水浇透。之后 2-3周，保证植株水分充足。当植株停止开花，第一个果荚成熟变黄时，用纸袋套住，当纸袋内的所有果荚变黄后，停止浇水， 1-2周干燥后收取种子，进行转化子筛选，同时取未经转化处理的拟南芥果荚作为对照。实施例 7 拟南芥转基因阳性转化子的筛选

种子消毒：先用 70%乙醇浸泡 10分钟，并不时地使种子悬浮；然后用无菌水洗四次，并不时地使种子悬浮。然后，将处理后的种子均匀涂布在含 50 μ₈/ηι1 卡那霉素的 1/2MS固体筛选培养基表面上春化 2天（一块 150 mm直径的平皿最多播种 1500粒种子）， 4°C春化 2天，然后在恒温 22°C、光照强度 3500-4000 lx、光照周期为 12小时黑暗 /12小时光照的条件下培养 7-10天。。转基因种子在所述筛选培养基（MS+kan) 平板上萌发 2周以后，将能够萌发并正常生长的植株转入土壤继续培养。剪取所述能够在筛选培养基上正常生长的每株植物的 1-2个叶片，提取其 DNA作为模板，用 SEQ ID NO: 18和 SEQ ID NO: 19做 PCR检测（反应体系及条件同上），去除 PCR检测呈阴性的植株，收集 PCR 检测呈阳性的植株的种子，分别标记为 T0il-T0i21。实施例 8 过表达 GhATPase-2的转基因拟南芥 T1代植株的种植选择吸水性好，土质松软的蛭石配合营养土（1:1) 作为拟南芥种植土壤。将 T0il-T0i21的每种转化子及未转基因对照拟南芥种子各播种 2盆，每盆播种 20-30颗种子。播种以后在花盆上罩上薄膜，给植株的生长提供一个湿润的环境。恒温 22°C，光照强度 3500-4000 lx，光照周期为 12小时黑暗、 12小时光照培养，每 7天浇灌一次 1/2MS。培养 25天后，每株转基因拟南芥剪取 1-2个叶片提取 DNA作为模板，用 SEQIDNO: 18和 SEQIDNO: 19作为引物进行 PCR检测 (反应体系及条件同上），去除 PCR检测呈阴性的植株，每盆保留 7-8棵 PCR 检测呈阳性的苗，继续培养 10天后，每盆保留大小较一致的 5-7棵转基因拟南芥苗或对照拟南芥苗进行耐盐实验。实施例 9 过表达 GhATPase-2的转基因拟南芥 T1代植株的耐盐实验将实施例 8中转基因拟南芥、对照拟南芥各保留一盆植株不作处理，正常浇灌 1/2MS, 同时各一盆植株浇灌含有 150mMNaCl的 1/2MS, 在恒温 22°C、光照强度 3500-4000 lx、 12小时光培养 /12小时暗的条件下培养 10天后观察实验结果： T1代转基因植株（TO代转基因植株的种子长成的植株）的耐盐性鉴定表明， T1代转基因植株 Tli5、 Tlil3、 Τ1Ϊ16三个株系表现出明显的耐盐性（见图 3，以 Tli5例， Tlil3、 T1U6的结果与类似，在此未示出）。实施例 10 在转录水平上验证 GhATPase-2基因的表达

将实施例 9中耐盐性好的 T1代转基因植株中随机选取 8棵（分别属于上述 Tli5、 Tlil3、 Tlil6三个耐盐株系），实施例 9中对照植株随机选取 4棵，各剪取盐（150 mM NaCl)处理 14天的叶片 0.05 g，用植物 RNA提取试剂盒（Invitrogen)提取总 RNA。紫外分光光度测定所得总 RNA在 260 nm和 280 nm的吸光度值，计算各个 RNA浓度。依照 Invitrogen反转录试齐 Ll盒 Superscript III Reverse Transcriptase所示方法进行反转录（1 总 RNA作为模板，反转录引物 SEQIDNO: 11)。使用引物 SEQIDNO: 10和 SEQ ID NO: 20 ( SEQ ID NO: 20： CTGAATTGAA GGCCTCTACT TG) 扩增 GhATPase-2片段，检测其转录情况。采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶，以上述反转录得到的 cDNA为模板进行 PCR反应。 50 lPCR反应体系： 10 μ 1 5XPS Buffer, 3 μ 12.5 mM的 dNTP， 2.0 μ 1 cDNA, 1.0 μ 1 PrimeSTAR HS DNA聚合酶、 10 μΜ的引物 SEQIDNO: 10和 SEQIDNO: 20各 2.0 μ1，以及 30 μ 1的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5分钟， 32个循环（94°C变性 30秒， 58°C退火 30 秒， 72°C延伸 2分钟）， 72°C延伸 10分钟。产物电泳结果如图 4所示： M为 DNA Ladder Marker (DL2000, 购自深圳瑞真生物技术有限公司）， 1-8为耐盐 T1代转基因拟南芥植株， 10-13 为非转基因对照拟南芥植株， 9 为质粒 PCR 阳性对照 (35S-GhATPase-2-2300质粒）。图中所示条带大小与阳性对照的大小一致（约为 1600 bp)。结果表明，耐盐 T1代转基因拟南芥植株中 G/^ ¼^-2有显著转录，非转基因对照拟南芥植株中没有 GhATP -2的转录。

Claims

权利要求书

1. 棉花的一个 ATP水解酶，其序列为 SEQ ID N0 : 1。
2. 编码权利要求 1的 ATP水解酶的基因，其序列为 SEQ ID NO : 2。
3. 一种重组表达载体，其是通过将权利要求 2所述的基因插入到一种表达载体而获得的，并且所述基因的核苷酸序列与所述表达载体的表达控制序列可操作地连接，优选地，所述表达载体是 pCAMBIA2300。
4. 权利要求 3所述的载体，其为附图 2所示的 35 S-ThATPase-2-2300载体。
5. 一种重组细胞，其含有权利要求 2所述的基因或者权利要求 3或 4所述的重组表达载体；优选地，所述重组细胞为重组农杆菌细胞。
6. 一种改善植物耐盐性的方法，包括：将权利要求 2所述的基因或者权利要求 3 或 4所述的重组表达载体导入植物或植物组织并使所述基因表达；优选地，所述植物是拟南芥。
7. 一种制备转基因植物的方法，包括：在有效产生植物的条件下培养含有权利要求 2所述的基因或者权利要求 3或 4所述的重组表达载体的植物或植物组织。
8. 权利要求 7所述的方法，其中所述植物是拟南芥。
9. 权利要求 2所述的基因、权利要求 3或 4所述的重组表达载体或者权利要求 5 所述的重组细胞用于改善植物耐盐性以及用于植物育种的用途。
10. 权利要求 9所述的用途，其中所述植物是拟南芥。