CN105181865B - 一种同步测定油脂类食品中六溴环十二烷异构体和四溴双酚a含量的方法 - Google Patents

Abstract

一种同步测定油脂类食品中六溴环十二烷异构体和四溴双酚A含量的方法，其特征在于主要包括样品提取、提取液净化和测定；提取液净化采用介孔二氧化锆杂化柱作为固相萃取柱；自下而上依次为无水硫酸钠层、介孔二氧化锆微球层、酸化硅胶层、介孔二氧化锆微球层和无水硫酸钠层，植物性油脂、鱼、肉、蛋、奶等油脂类食品样品中六溴环十二烷异构体和四溴双酚A回收率达87.5%‑114.4%。通过制备可重复使用的介孔二氧化锆微球，优化了前处理技术，节省了大量的溶剂，其检测限、定量限，方法的回收率和精密度均能满足分析实际样品的要求；并通过国际比对中的标准物质验证了方法的可靠性和结果的准确性。

Description

一种同步测定油脂类食品中六溴环十二烷异构体和四溴双酚 A含量的方法

技术领域

本发明涉及一种检测方法，具体涉及一种同步测定油脂类食品中六溴环十二烷异构体和四溴双酚A含量的方法。

背景技术

六溴环十二烷(Hexabromocyclododecanes，HBCDs)：1,2,5,6,9,10-Hexabro，CAS号：3194-55-6，分子量：641.70，分子式：C₁₂H₁₈Br₆。

四溴双酚A(Tetrabromobisphenol A，TBBPA)：3,3,5,5-Tetrabromobi，CAS号：79-94-7，分子量：543.87，分子式：C₁₅H₁₂Br₄O₂。

六溴环十二烷和四溴双酚A是世界上消费量最大的两种溴系阻燃剂，广泛应用于聚合物生产、印刷电路板阻燃、建筑隔热板材、软垫家具、室内装潢纺织品等领域。2010年全球HBCDs的生产量为23000吨，2004年TBBPA的全球生产量为170000吨。HBCDs具有肝脏毒性、神经毒性和内分泌毒性，可导致老鼠肝脏增重、甲状腺增大等，而TBBPA是一种潜在的内分泌干扰物。

2001年5月联合国环境规划署（United Nations Environment Programme，简称UNEP）在斯德哥尔摩签署了具有划时代的意义关于持久性有机污染物(POPs)的国际公约《斯德哥尔摩公约》，是人类保护环境的一个里程碑。作为阻燃剂市场上最常见的溴系阻燃剂首当其充与POPs公约相关联。2013年5月，联合国《关于持久性有机污染物的斯德哥尔摩公约》（POPs）投票一致通过一项禁令：在全球范围内禁止生产和使用六溴环十二烷（HBCD）。这标志着六溴环十二烷成为继四溴联苯醚和五溴联苯醚之后，又一个列入《公约》禁用化学制品黑名单的溴系阻燃剂[4]。潜在的POPs还包括，四溴双酚A(TBBPA)、短链氯化石蜡(SCCPs)、溴代二噁英、多氯代萘(PCNs)、德克隆(DP)等。

HBCDs是含有六个溴原子的环状化合物，有多种异构体。HBCDs熔点在160～190之间，具有对热和紫外光的稳定性好、用量低、阻燃效果好和对材料物理性能影响小等特点；是一种添加型阻燃剂，可以通过生产、使用和产品的废弃而进入到环境中，被广泛用作多溴联苯醚(PBDEs)的替代品。欧洲主要用于EPS、XPS、HIPS等及纺织品涂层阻燃处理上。我国主要用于发泡聚苯乙烯、聚丙烯纤维、苯乙烯树脂、聚乙烯、聚碳酸酯等的阻燃添加剂，及对织物、粘合剂、涂料及不饱和聚酯树脂进行阻燃处理等。研究表明HBCDs具有很强的生物蓄积性和持久性，被认为是一种新型的环境持久有机污染物，已经受到了国际社会的广泛关注。HBCDs可导致血清甲状腺激素浓度下降、抑制神经递质正常吸收、引起肝组织病理学改变等生物毒性，欧盟在《关于限制在电子电器设备中使用某些有害成分的指令》（Restrictionof Hazardous Substances，简称RoHS）中将其定为管控物质，欧洲化学品管理局（EuropeanChemicals Agency，简称ECHA）将其归类为高关注度物质，同时持久性有机污染物审查委员会已将其列入《关于持久性有机污染物的斯德哥尔摩公约》。HBCDs普遍存在于环境中，生长在格兰陵(Greenland)和斯瓦尔巴特群岛(Savalbard)的北极熊、海鸟及海豹身上均可检测到HBCDs。

商品HBCDs由3种非对映异构体(α，β，γ-HBCD )组成，结构式见图1。其中γ-HBCD的含量最高，为75%～89%，α-HBCD的含量为10%～13%，β-HBCD的含量为0.5%～12%。同时发现在环境样品(土壤、污泥、污水等样品)中HBCD的主要成分是γ-HBCD，占总HBCD 的60%以上；在空气中的HBCD 主要为α-HBCD 和γ-HBCD，β-HBCD含量很少；而在水生生物和鸟类体内组织里α-HBCD占HBCD总量的80%以上。可见对HBCDs的危险性评价需要对3种异构体分别进行精确定量。

TBBPA结构中有两个活泼的酚羟基，呈强极性，结构式见图2。TBBPA是目前使用量最大的一种溴系阻燃剂，其总用量约占全球阻燃剂用量的1/3，年消耗量达120000 T。它被广泛应用于电子电机设备中，如印刷电路版和塑料零件中，以强化阻燃防火的功能，全球有超过70％的电子电机设备含有TBBPA。尽管它是反应型阻燃剂，但是在产品中仍然有大量的非聚合的TBBP-A存在，并且有可能释放、污染环境。由于TBBPA与甲状腺荷尔蒙(thyroxin，T4)的结构相似，现阶段被认为是一种潜在的内分泌干扰物。有研究表明，TBBPA能够与人类的转甲状腺素蛋白(transthyretin) (前白蛋白)紧密结合,是一种免疫毒素。

2007年6月，挪威污染控制管理局向世界贸易组织（WTO）通报提议，一旦产品中某些特定物质的含量大于或等于最高限量时应严格控制该类消费产品的生产、进口、出口和销售。挪威污染控制管理局发布了《消费性产品中禁用特定有害物质》禁令，即PoHS（Prohibition on Certain Hazardous Substances in Consumer Products）指令，该指令于2007年12月15日通过，2008年1月1日生效。规定建议限制的18种物质中包括HBCDs和TBBPA，PoHS指令规定HBCDs的限量为0.1％，TBBPA的限量为1％。我国目前没有HBCDs和TBBPA的限量标准。

对于HBCDs和TBBPA这两类物质，由于他们的生物蓄积性和脂溶性，HBCDs和TBBPA随着食物链的延长会产生富集现象，处于食物链较高点的动物和人类体内的富集程度相对环境基质要高，有的甚至高出上千倍。因此，需要建立一个适合各种食品(主要为动物源性食品、油脂类食品)的方便、快捷、安全且高灵敏的提取、净化和检测方法来满足同时对HBCDs和TBBPA这两种物质的分析要求，以便今后对这两种物质的检测与风险水平的评估，保障食品质量安全。TBBPA在针对水体、土壤、空气等环境基质方面有相关的前处理方法报道，如专利文献“复杂样品中PCNs、 HBCDs和TBBPA的选择性分离”（申请号201210103913.7，公布号 CN 103364238 A）以硅胶基质为层析柱填料，实现了对多氯萘、六溴环十二烷和四溴双酚A的选择性分离，但是，该方法只能用于对沉积物、土壤和生物样品中的三类物质进行选择性分离，对于脂肪含量很高的动物性食品或油脂类样品而言，该方法并不适用。

发明内容

针对背景技术中的不足，本发明的目的在于提供一种同步测定油脂类食品中六溴环十二烷异构体和四溴双酚A含量的方法，即在现有的HBCD和TBBPA前处理及分析技术的基础上，采取稳定性同位素稀释技术，在油脂类食品样品中加入¹³C标记的HBCD和TBBPA内标溶液，用索氏提取法提取油脂类食品基质中目标化合物，用自制的介孔二氧化锆杂化柱净化，超高效液相色谱-串联质谱 (UPLC-MS/MS)的多反应离子监测(MRM)模式进行测定，内标法定量，实现了对TBBPA和三种HBCDs(α、β、γ-HBCD)的同时测定。

本发明采用的技术方案如下：

一种同步测定油脂类食品中六溴环十二烷异构体和四溴双酚A含量的方法，其特征在于其主要包括样品提取、提取液净化和测定；

所述的样品提取采用索氏提取法；

所述提取液净化采用介孔二氧化锆杂化柱作为固相萃取柱；

所述测定采用超高效液相色谱-串联质谱法；

所述的介孔二氧化锆杂化柱为底部设有聚四氟乙烯活塞的玻璃层析柱，玻璃层析柱腔体内设有若干层萃取层，即自下而上依次为无水硫酸钠层、介孔二氧化锆微球层、酸化硅胶层、介孔二氧化锆微球层和无水硫酸钠层。

所述的一种同步测定油脂类食品中六溴环十二烷异构体和四溴双酚A含量的方法，其特征在于：所述介孔二氧化锆杂化柱中介孔二氧化锆微球层的材料为ZrO₂/mSiO₂复合材料，其制备方法如下：1）伪晶转化的介孔二氧化硅的合成：取200-300目的层析硅胶，用体积配比浓盐酸：水=1:1的溶液浸泡一晚后，纯水洗涤至中性，160℃烘干，得到活化的硅胶；按照摩尔比SiO₂:NaOH:CTAB:H₂O= 1:0.25:0.1:40的比例，混合反应物后，倒入高压釜中，130℃反应24h后，产物用水和乙醇清洗，放入550 ℃的马弗炉中烧去模板CTAB，得到伪晶转化的介孔二氧化硅；2）ZrO₂/mSiO₂复合材料的制备：取10 g Zr0Cl₂·8H₂O加入到200 mL的水中，搅拌溶解后加入50 g的伪晶转化介孔二氧化硅，在60℃不断搅拌至干燥，然后在100℃下干燥6h；将Zr0Cl₂负载的硅胶放置在14%的氨水溶液中，在60℃的水浴中反应5h，过滤，抽干，放入550 ℃的马弗炉中煅烧8h，即得到ZrO₂/mSiO₂复合材料。

所述的一种同步测定油脂类食品中六溴环十二烷异构体和四溴双酚A含量的方法，其特征在于：所述介孔二氧化锆杂化柱长350mm、内径20mm，其萃取层的填充方法为：依次倒入2cm无水硫酸钠、5g ZrO₂/mSiO₂复合材料、10g 44%酸化硅胶、5gZrO₂/mSiO复合材料、2cm无水硫酸钠。

所述的一种同步测定油脂类食品中六溴环十二烷异构体和四溴双酚A含量的方法，其特征在于：所述酸化硅胶层的材料为44%的酸化硅胶，其制备方法为：将60-200目硅胶依次用甲醇和二氯甲烷淋洗，每次使用的溶剂体积约为硅胶体积的两倍；完成淋洗后将硅胶放置在铝箔上于通风柜中自然风干，然后130 ℃下活化4 h。称取活化好的硅胶逐步加入浓硫酸中，振摇过夜至无块状物，所述硅胶：硫酸的重量配比为44：56。

所述的一种同步测定油脂类食品中六溴环十二烷异构体和四溴双酚A含量的方法，其特征在于所述样品提取方法如下：称取样品置于纤维素套筒中，加入浓度为100 ng/mL的 ¹³C₁₂-六溴环十二烷标准和¹³C₁₂-四溴双酚A混合标准应用溶液200μL和适量无水硫酸钠，用体积比正己烷:丙酮=1:1的混合溶液作为提取剂，在50-70℃的温度下，用索氏提取装置提取18-24h，回流速度控制在4次～6次/h；提取液旋转蒸发后放置过夜，用正己烷复溶，得到提取液。

所述的一种同步测定油脂类食品中六溴环十二烷异构体和四溴双酚A含量的方法，其特征在于：所述超高效液相色谱-串联质谱法参数设置如下：

液相条件：色谱柱选用Waters BEH C18柱；柱温：50 ℃；样品池温度：10 ℃；进样体积：5 μL；流速：0.3 mL/min；流动相A液为体积比甲醇：乙腈=1：1混合液（1：1，），B液为超纯水，等度洗脱，A:B=80:20；

质谱参考条件：离子源为电喷雾电离ESI（-），检测方式为MRM，反吹气温度为325℃；反吹气流量为6 L/min；压力为42 psi；鞘气温度为380 ℃；鞘气流量为11 L/min；毛细管电压为4000 V；喷嘴电压为1500 V。

采用上述的介孔二氧化锆杂化柱在测定动物性食品中六溴环十二烷异构体和四溴双酚A含量的应用。

采用上述的介孔二氧化锆杂化柱测定鱼类、肉类、蛋类、乳类、油脂类、土壤中六溴环十二烷异构体和四溴双酚A含量的应用。

本发明采用适合各种样品中六溴环十二烷（包括α、β和γ-六溴环十二烷）和四溴双酚A的测定，且适用于油脂、肉、蛋、奶等动物源性食品。本方法中六溴环十二烷三种异构体α-HBCD、β-HBCD和γ-HBCD的检测限(定量限)分别为0.030 ng/g (0.100 ng /g)， 0.008ng/g (0.032 ng /g)， 0.016 ng /g (0.053ng /g) (以脂肪计)；四溴双酚A（TBBPA）的检测限(定量限)为0.027 ng /g (0.087 ng /g)。样品的回收率达87.5%-114.4%。通过制备可重复使用的介孔二氧化锆微球，优化了前处理技术，节省了大量的溶剂，同时检测限、定量限，方法的回收率和精密度均能满足分析实际样品的要求；并通过国际比对中的标准物质验证了方法的可靠性和结果的准确性。

附图说明

图1为 α、β、γ-HBCD结构示意图：(a) α-HBCD； (b) β-HBCD；(c) γ-HBCD；

图2为 TBBPA结构示意图；

图3为介孔二氧化锆杂化柱结构示意图；其中1-无水硫酸钠层；2-介孔二氧化锆微球层；3-酸化硅胶层；

图4为挪威鳟鱼样品中HBCD异构体、TBBPA及同位素内标的色谱图；

图5为ZrO₂/mSiO₂复合材料可重复性使用试验结果。

具体实施方式

实施例1

1 材料与试剂：

硅胶：硅胶（Silica Gel）60-200目。将硅胶装入玻璃色谱柱中依次用甲醇和二氯甲烷淋洗一次，每次使用的溶剂体积约为硅胶体积的两倍。完成淋洗后将硅胶放置在铝箔上于通风柜中自然风干，然后130℃下活化4h，完成后装入磨口试剂瓶中，干燥器中保存。

α、β、γ-六溴环十二烷标准溶液：纯度大于99%，均为50μg/mL，溶于甲醇中。

α、β、γ-¹³C₁₂-六溴环十二烷标准溶液：纯度大于98%，均为50μg/mL，溶于甲醇中。

四溴双酚A标准溶液：纯度大于99%，50μg/mL，溶于甲醇中。

¹³C₁₂-四溴双酚A标准溶液：纯度大于99%，50μg/mL，溶于甲醇中。

标准应用溶液：

六溴环十二烷与四溴双酚A混合标准应用溶液A（各化合物浓度1μg/mL）：分别准确量取α-六溴环十二烷，β-六溴环十二烷，γ-六溴环十二烷和四溴双酚A标准溶液各0.20mL,转移至10mL棕色容量瓶中，加甲醇定容至刻度，-4℃冰箱保存。

六溴环十二烷与四溴双酚A混合标准应用溶液B（100ng/mL）：准确量取六溴环十二烷与四溴双酚A混合标准应用液A 1.00mL, 转移至10mL棕色容量瓶中，加甲醇定容至刻度，-4℃ 冰箱保存。

¹³C₁₂-六溴环十二烷和¹³C₁₂-四溴双酚A混合标准应用溶液A（各化合物浓度1μg/mL）：分别准确量取¹³C₁₂-α-六溴环十二烷，¹³C₁₂-β-六溴环十二烷，¹³C₁₂-γ-六溴环十二烷和¹³C₁₂-四溴双酚A标准溶液各0.20mL, 转移至10mL棕色容量瓶中，加甲醇定容至刻度，-4℃冰箱保存。

¹³C₁₂-六溴环十二烷和¹³C₁₂-四溴双酚A混合标准应用溶液B（100ng/mL）：准确量取¹³C₁₂-六溴环十二烷与¹³C₁₂-四溴双酚A混合标准应用溶液A 1.00 mL, 转移至10mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，-4℃ 冰箱保存。

标准系列溶液：吸取0.50mL、1.00mL、5.00mL六溴环十二烷与四溴双酚A混合标准应用溶液B（100ng/mL）和2.50mL、5.00mL六溴环十二烷与四溴双酚A混合标准应用液A（1μg/mL），分别置于10mL容量瓶中，再各加入0.5mL内标混合标准应用液A (1μg/mL)，用甲醇稀释至刻度。标准系列溶液中六溴环十二烷异构体和四溴双酚A的浓度分别为5.0、10.0、50.0、250.0、500.0ng/mL，内标浓度为50.0ng/mL。

2 方法

应用稳定性同位素稀释技术，在试样中加入¹³C₁₂标记的六溴环十二烷异构体和四溴双酚A内标溶液，以正己烷和丙酮（1:1，v/v）为提取溶剂索氏提取18~24h，经介孔二氧化锆杂化柱净化后，以超高效液相色谱-质谱/质谱进行测定，内标法定量。

3分析步骤

3.1 样品提取

鱼类样品：准备新鲜的鱼（淡水鱼或海鱼）可食部分经匀浆机匀浆后转移至培养皿中，于-20℃冰箱中冷冻24h，转移至冷冻干燥机中干燥24h，将干燥后的固体样品切成小块备用。准确称取3g左右(精确到0.001)冷冻干燥鱼肉样品, 置于纤维素套筒中，加入¹³C₁₂-六溴环十二烷和¹³C₁₂-四溴双酚A混合标准应用溶液200μL（100 ng/mL）和适量无水硫酸钠，正己烷:丙酮混合溶液(1:1，v/v)作为提取剂，在50-70℃的温度下，用索氏提取装置提取18-24h，回流速度控制在4次～6次/h。提取液充分旋转蒸发后放置过夜测定脂肪含量。用正己烷复溶，再次浓缩至2~3 mL备用。

肉类样品：准备新肉样（猪肉、牛肉、鸡肉等畜禽肉类）经匀浆机匀浆后转移至培养皿中，于-20℃冰箱中冷冻24h，转移至冷冻干燥机中干燥24h，称取冷冻干燥肉样品3g左右(精确到0.001)，将滤膜放入索氏抽提装置中，放入冷冻干燥肉样品的同时加入¹³C₁₂-六溴环十二烷和¹³C₁₂-四溴双酚A混合标准应用溶液200 μL（100 ng/mL）作为内标，同时加入无水硫酸钠适量。用300mL正己烷和丙酮（1:1，体积比）作为提取剂，在50-70℃的温度下，用索氏提取装置提取18-24 h，回流速度控制在4次～6次/h。用旋转蒸发浓缩提取液至尽干，放置过夜后测定脂肪含量。用正己烷复溶，再次浓缩至2~3mL备用。

蛋类样品：取蛋清蛋黄混合液，转移至培养皿中，于-20℃冰箱中冷冻24h，转移至冷冻干燥机中干燥24h，将干燥后的固体样品。称取冷冻干燥鸡蛋样品3g左右(精确到0.001)，置于纤维素套筒中，加入¹³C₁₂-六溴环十二烷和¹³C₁₂-四溴双酚A混合标准应用溶液200μL（100 ng/mL）和适量无水硫酸钠，正己烷:丙酮混合溶液(1:1，v/v)作为提取剂，在50-70℃的温度下，用索氏提取装置提取18-24 h，回流速度控制在4次～6次/h。提取液充分旋转蒸发后放置过夜测定脂肪含量。用正己烷复溶，再次浓缩至2~3 mL备用。

奶类样品：牛奶 50 mL，转移至培养皿中，于-80℃冰箱中冷冻4 h，转移至冷冻干燥机中干燥24 h得牛奶固体。将滤膜放入索氏抽提装置中，同时将冷冻干燥后得到的牛奶固体研碎并全部转移至玻璃纤维套筒中并加入¹³C₁₂-六溴环十二烷和¹³C₁₂-四溴双酚A混合标准应用溶液200 μL（100 ng/mL），用正己烷和丙酮（1:1，体积比）在50-70℃的温度下，索氏提取20h以上，将提取液旋转蒸发浓缩至尽干，放置过夜后测定脂肪含量，用4 mL正己烷复溶样品。

土壤样品：称取冷土壤样品5g (精确到0.001)，将滤膜放入索氏抽提装置中，，加入¹³C₁₂-六溴环十二烷和¹³C₁₂-四溴双酚A混合标准应用溶液200μL（100 ng/mL）和适量无水硫酸钠，正己烷:丙酮混合溶液(1:1，v/v)作为提取剂，在50-70℃的温度下，用索氏提取装置提取18-24 h，回流速度控制在4次～6次/h。提取液充分旋转浓缩到5 mL备用。

3.2 样品净化

将索氏提取后的溶液转移至圆底烧瓶中，旋蒸提取液至近干并静置过夜；用洗耳球轻震管壁，正己烷倒入管内排除气泡后，用200mL正己烷活化介孔二氧化锆杂化柱。以圆底烧瓶为恒重容器测定脂肪含量后，用2~4mL正己烷复溶样品，滴入活化好的介孔二氧化锆杂化柱上部，如此重复清洗烧瓶3~4次；100mL正己烷淋洗去除多余杂质，100mL正己烷:二氯甲烷混合溶液(1:1，v/v)洗脱，收集洗脱液并旋蒸至近干，再用正己烷复溶，每次2~4mL，重复清洗烧瓶3~4次，转移至10mL试管；氮气吹干后加入200μL甲醇，旋涡振荡1min，经0.2μm有机滤膜过滤后上机测定。

3.3测定

3.3.1测定参数

液相条件：色谱柱选用Waters BEH C18柱（2.1 mm i.d. ×50 mm，1.7 μm）；柱温：50 ℃；样品池温度：10 ℃；进样体积：5 μL；流速：0.3 mL/min；流动相：A液为甲醇-乙腈混合液（1：1，v/v），B液为超纯水，等度洗脱（A:B=80:20）。 质谱参考条件：离子源为电喷雾电离ESI（-）。检测方式为MRM。反吹气温度（Gas Temp）为325 ℃；反吹气流量（Gas Flow）为6L/min；压力（Nebulizer）为42 psi；鞘气温度（Sheath Gas Temp）为380 ℃；鞘气流量（Sheath Gas Flow）为11 L/min；毛细管电压（Capillary）为4000 V；喷嘴电压（NozzleVoltage）为1500 V；监测离子、碰撞能量和锥孔电压（见表1）。

表1 六溴环十二烷和四溴双酚A的多反应离子监测分析参数

3.3.2 标准曲线绘制

吸取标准系列溶液各5μL进样，以标准系列溶液中目标化合物浓度为横坐标，目标化合物与相应内标物峰面积比为纵坐标，绘制标准曲线，并按下式计算平均相对响应因子：

式中：

f- 平均相对响应因子；

m_i- 标准溶液中内标物绝对质量 ng；

m_x- 标准溶液中待测物绝对质量 ng；

A_x- 待测物峰面积；

A_i- 内标物峰面积；

计算结果表示到三位有效数位。

3.3.3 试样测定

吸取油脂类食品净化后试样5 uL进样，记录总离子流图及待测物和内标的峰面积，以保留时间及碎片离子的丰度定性，要求所检测的待测物色谱峰信噪比(S/N)大于3；待测物相应监测离子的丰度偏差不超过标准溶液中相应离子丰度的20%。

4 结果

4.1 计算公式

按下式由内标法计算试样中各待测物的浓度：

式中：

C- 试样中待测物的含量 ng/g（以脂肪计）；

m_i-试样中内标物的绝对质量 ng；

f- 平均相对响应因子；

A_x- 待测物的峰面积；

A_i- 内标峰面积；

m- 所取样品脂肪重量 g；

计算结果表示到三位有效数位。

4.2线性范围

以5.0、10.0、50.0、250.0、500.0 ng/mLHBCDs与TBBPA混合标准溶液进样，根据待测物和内标的峰面积比（y）和对应的标准溶液中待测物的质量（x）进行线性回归，得出线性方程为：TBBPA：y = 0.1014x+0.0937；相关系数：R²= 0.9985；α-HBCD：y = 4.2120x -2.3245；相关系数：R²= 0.9999；β-HBCD：y = 0.4624x - 0.5896；相关系数：R²= 0.9995；γ-HBCD：y = 0.1927x +0.0512；相关系数：R²= 0.9989。

4.3标准曲线的相对响应因子

计算线性曲线图中每个点上的相对响应因子RRF得出平均相对响应因子(见表2)，计算公式如下：

公式中：Cs-定量内标的质量；

Cn-目标化合物的质量；

An-目标化合物的峰面积；

As-定量内标的峰面积。

表2 HBCDs与TBBPA混合标准系列溶液相对响应因子

4.4检出限与定量限

检测限根据对基质空白的测定确定噪声，以3倍噪声峰高对应的浓度为检测限(LOD)。计算公式如下：

式中：N-噪音峰高，本试验N值为1；M_S-加入定量内标的量；

H-定量内标的峰高；S-脂肪重量；

而以10倍噪声峰高对应的浓度为定量限(LOQ)。计算公式如下：

取5g冻干好的肉制样品(经检测确定不含TBBPA和HBCDs的鱼肉样品)作为不含目标物的基质样，加入20 ng内标(同位素内标混合标准应用溶液B 200μL)，按前述3.2样品提取方法提取并净化处理后，上机测定(三组平行，取平均值)。结果如表3所示。确定HBCD三种异构体α-HBCD、β-HBCD和γ-HBCD的检测限和定量限分别为0.030、0.100 ng/g，0.008、0.032 ng/g，0.016、0.053ng/g(以脂肪计)；TBBPA的检测限和定量限分别为0.027、0.087ng/g (以脂肪计)。

表3 检测限和定量限测定结果(ng/g，以脂肪计)

4.5回收率与精密度

采用市售的金龙鱼植物油为空白基质，在样品中添加低、中、高三个不同质量浓度的标准溶液进行UPLC-MS/MS分析，每个添加水平平行测定6次。回收率表示方法的可行性，以相对标准差(RSD)表示方法的重现率即精密度，结果见表4。结果显示三种HBCD与TBBPA的平均回收率在89.4%-113.2%之间，RSD范围为6.02%-11.01%之间。表明该方法可行，且精密度良好。

表4 HBCDs和TBBPA的回收率和精密度

4.6样品验证试验

为了验证方法在实际样品中的可行性，采用建立的方法，在鱼类、肉类、蛋类、乳类这四种实际的空白样品(样品经测定不含目标物)中添加质量浓度为20 ng的标准溶液进行UPLC-MS/MS分析，每个添加水平平行测定6次。以回收率表示方法的可行性，以相对标准差(RSD)表示方法的重现性即精密度，结果见表5。结果显示三种HBCD与TBBPA的平均回收率在87.5%-114.4%之间，RSD范围为4.73%-12.34%之间，表明该方法可行，且精密度良好。

表5 实际样品加标回收结果

采用该方法对湖北地区采集的212份鱼、肉、蛋、奶等油脂类食品样品进行了检测，通过方法空白的质量控制发现，该方法回收率和精密度良好。

国际考核样品验证试验

采用所建立的方法，测定了从挪威采购的鳟鱼肉(trout)样品，并用此方法测得的样品值与2010年挪威公共卫生学院组织的食品中PCBs, PBDEs and HBCD试验室间比对试验得出的均值进行了比对。样品中α，β，γ-HBCD、TBBPA及相应的同位素内标的色谱图如图4所示。检测结果均以湿重计，结果如表6所示。采用本方法分析的结果与国际不同试验室的均值相接近，说明本方法测定结果准确，该分析方法可行。但实测值均低于国际均值，其原因可能是：同时分析两种物质时，前处理方法的目标物损失率较单独分析HBCDs稍高。

表6 本方法实测值与2010年国际比对考核中鳟鱼样品均值的比较

实施例2 不同净化方法的对比试验

以下样品前处理方法和检测方法同实施例1，净化方法如下：

方法1 酸化硅胶柱净化法：于干净的固相萃取玻璃柱底部塞一小撮棉花，从下往上依次倒入1 cm的无水硫酸钠、5 g硅胶、15 g 44%酸化硅胶、5 g硅胶、1 cm的无水硫酸钠。用洗耳球轻震管壁以使填料表面水平，倒入正己烷排尽气泡，再用200 mL正己烷活化柱子备用。

44%酸化硅胶制备方法：称取活化好的硅胶逐步加入浓硫酸(硅胶与硫酸质量比为44/56)，振摇过夜至无块状物。完成后装入磨口试剂瓶中，干燥器中保存。

将提取的样品旋蒸至近干，用正己烷复溶，每次2~4 mL，滴入酸化硅胶柱上部，如此重复清洗烧瓶3~4次，100 mL正己烷淋洗去除多余杂质，250 mL正己烷:二氯甲烷(1:1，v/v)洗脱，收集洗脱液并旋蒸至近干，再用正己烷复溶，每次2~4 mL，重复清洗烧瓶3~4次，转移至10 mL试管，氮气吹干后加入200 μL甲醇，旋涡振荡1 min，经0.2 μm有机滤膜过滤后上机测定。

经3次平行测定知HBCD的绝对回收率可达50%以上，但TBBPA的回收率只有15%~30%（表7），主要原因可能是TBBPA有活泼酚羟基的存在，硅胶会与其牢固结合，导致洗脱液不能将其有效地洗脱下来，因此方法1不能满足分析需要。

方法2 手动填装GPC柱净化法：于烧杯中用甲苯将活化的SX3生物珠混匀震摇至均一的糊状，立即倒入干净的玻璃管(50 mm×50 cm)中，再接着用甲苯将残留的填料混匀倒入玻璃管，如此重复多次，待填料沉淀下来与液相分层后，用环己烷:乙酸乙酯混合溶液(1:1，v/v)置换出甲苯，备用。

将提取好的样品用环己烷:乙酸乙酯混合溶液(1:1，v/v)复溶，每次2-4 mL，滴入GPC柱上部，如此重复清洗烧瓶3-4次，400 mL环己烷:乙酸乙酯(1:1，v/v)洗脱，收集190~350 mL之间的洗脱液(之前的洗脱液中不含目标物)，旋蒸至近干，再用正己烷复溶，每次2~4 mL，重复清洗烧瓶3~4次，转移至10 mL试管，氮气吹干后加入200 μL甲醇，旋涡振荡1min，经0.2 μm有机滤膜过滤后上机测定。

采用该方法时的试验现象为接收液旋蒸后烧瓶内仍有极少量粘稠油分，在氮吹干过后粘稠现象更加明显，该现象表明此方法不能完全除尽脂肪，需要进行进一步净化才能进行后续测定。

方法3 浓硫酸处理净化法：将提取好的样品用正己烷复溶，每次2~4 mL，如此重复清洗烧瓶3~4次，合并至50 mL带刻度具塞离心管中，加入过量的浓硫酸，涡旋震荡1 min，3000 rpm离心5 min，将上层有机层转移至试管中，旋蒸至近干，再用正己烷复溶，每次2~4mL，重复清洗烧瓶3~4次，转移至10 mL试管中，氮气吹干后加入200 μL甲醇，旋涡振荡1min，经0.2 μm有机滤膜过滤后上机测定。

该方法试验现象为加入浓硫酸充分摇匀并离心之后，上清液与浓硫酸层中间会有一层橘黄色的乳状物出现，发现该乳化现象的严重程度与绝对回收率成负相关，采用加盐去乳化处理会与浓酸反应释放气体，导致溶液喷出。分析其原因是由于油分遇到强酸会发生乳化现象，导致部分有机层与浓硫酸层不能有效分离，而加盐会与浓硫酸发生化学反应释放出气体。虽然TBBPA和HBCDs均对酸稳定，能得到较好的回收率(40%~70%)（表7），但需考虑到不同样品基质复杂程度不同，若有些样品遇强酸发生严重的乳化反应，回收率就不一定能满足分析要求了，况且此方法要多次连续的进行液液萃取操作，耗时费力，强酸处理也容易发生危险，所以此方法并不理想。

方法4 结合法：方法2 GPC之后油脂未完全除净，继续采用方法3，直至油脂完全除净。

凝胶色谱分离法与浓硫酸法相结合除脂，先用凝胶色谱除去大量脂肪，接收液再加入浓硫酸去除剩余脂肪，回收率在40%~70%之间（表7），结果较为理想，但操作复杂，费时费力，不便于大量处理样品。

方法5 改进的酸化硅胶净化法：将方法1中的二层硅胶去掉，从下往上依次为1 cm的无水硫酸钠、15 g 44%酸化硅胶、1 cm的无水硫酸钠。装填过程同方法1。该方法借鉴的是地方标准 DBS 42/004-2014《动物性食品中六溴环十二烷和四溴双酚A 的测定》。该方法回收率在58%~73%之间（表7），结果较为理想，但脂肪不能完全去除，有污染超高效液相色谱仪的风险。

方法6介孔二氧化锆杂化柱净化法：将方法1中的酸化硅胶柱替换为介孔二氧化锆杂化柱，装填过程和使用同方法1。

介孔二氧化锆杂化柱制备过程：

伪晶转化的介孔二氧化硅的合成：200-300目的层析硅胶采用浓盐酸/水（体积比1/1）浸泡一晚后，纯水洗涤至中性，160℃烘干，得到活化的硅胶。按照摩尔比SiO₂:NaOH:CTAB:H₂O= 1:0.25:0.1:40的比例，混合反应物后，倒入高压釜中，130℃反应24h后，产物用水和乙醇清洗，放入550 ℃的马弗炉中烧去模板CTAB（十六烷基溴化铵），得到伪晶转化的介孔二氧化硅（mSiO₂）。

ZrO₂/mSiO₂复合材料的制备：10 g的Zr0Cl₂·8H₂O加入到200 mL的水中，搅拌溶解后加入50 g的伪晶转化介孔二氧化硅（mSiO₂），在60℃不断搅拌至干燥，然后在100 ℃下干燥6h。将Zr0Cl₂负载的硅胶放置在14%的氨水溶液中，在60℃的水浴中反应5h，过滤，抽干，放入550 ℃的马弗炉中煅烧8h，即得到二氧化锆涂覆的介孔二氧化硅材料（ZrO₂/mSiO₂）。

44%酸化硅胶的制备：称取活化好的硅胶逐步加入浓硫酸(硅胶与硫酸质量比为44/56)，振摇过夜至无块状物。完成后装入磨口试剂瓶中，干燥器中保存。

介孔二氧化锆杂化柱制备方式：取底部设有聚四氟乙烯活塞的玻璃层析柱，规格为长350mm、内径20mm，先在其底部塞一小撮棉花，然后从下往上依次倒入2cm无水硫酸钠、5g二氧化锆涂覆的介孔二氧化硅材料（ZrO₂/mSiO₂）、10g 44%酸化硅胶、5g二氧化锆涂覆的介孔二氧化硅材料（ZrO₂/mSiO₂）、2cm无水硫酸钠。试验结果证明，采用这个净化方法，最大程度降低仪器被脂肪污染的风险，HBCD和TBBPA也取得了高于其他5种方法的绝对回收率(70%-90%)。

表7 各种净化方法对应的HBCD和TBBPA绝对回收率（单位；%）

对比表7中6种方法的目标化合物回收率，发现方法6简单快捷，油脂可一步且完全去除，能满足后续液质分析的需要，安全性高且目标化合物绝对回收率最高，故采用介孔二氧化锆杂化柱进行净化处理。

实施例3 ZrO₂/mSiO₂复合材料可重复性使用试验

10g二氧化锆涂覆的介孔二氧化硅材料（ZrO₂/mSiO₂）材料依次用20mL丙酮/氨水（体积比95:5）、20mL丙酮、20mL正己烷洗涤后，可重复使用5次，结果见图5。

实施例4 流动相的选择

根据相关资料，选择了Waters BEH C18柱（2.1 mm i.d. ×50 mm，1.7 μm）色谱柱。由于电喷雾质谱的电离是在溶液状态电离，因此流动相的组成和添加剂除了影响目标化合物的保留时间和峰形外，还明显影响到目标化合物的离子化效率。从而影响目标化合物的检测灵敏度。实验在满足较好的色谱分离的同时，比较了甲醇/乙腈(V/V: 1/1)-水、乙腈-水这2种流动相对目标化合物离子化程度的影响。结果表明，当流动相为甲醇/乙腈-水时，响应值明显高于乙腈-水流动相时的响应值(约为2～4倍)。因此，实验选用甲醇/乙腈(V/V: 1/1)-水为流动相进行80-20等度洗脱。

实施例5 质谱条件的优化

分析TBBPA，需要用到多反应监测（MRM）模式。首先，利用流动注射泵连续进样。在正离子和负离子模式下进行全扫描以选择适当的分子离子峰和电离方式。结果表明：在负离子模式下，全扫描的分子离子[M - H ]^- m/z 542.6最理想。因此选用TBBPA的[M -H]^-作碰撞诱导解离的母离子。二级质谱图中，观察到m/z 447.6、417.8等碎片离子峰。其中m/z447.6碎片离子是[M- Br-OH ]^-，m/z 417.8离子是[M-Br-OH-CO ]^-。

分析HBCDS时，同样利用流动注射泵连续进样。在正离子和负离子模式下进行全扫描以选择适当的分子离子峰和电离方式。结果表明：在负离子模式下，同样是全扫描的分子离子[M - H ]^- m/z 640.7最理想，但是对于二级质谱，该化合物只能检测Br^-，所以用选择离子（SIM）模式即可。但是本着高效的原则，希望和四溴双酚A同时检测，所以选择了m/z78.9和m/z 80.9作为其子离子，与四溴双酚A一起使用多反应监测（MRM）模式。

Claims (7)

1.一种同步测定油脂类食品中六溴环十二烷异构体和四溴双酚A含量的方法，其特征在于其主要包括样品提取、提取液净化和测定；

所述的样品提取采用索氏提取法；

所述提取液净化采用介孔二氧化锆杂化柱作为固相萃取柱；

所述测定采用超高效液相色谱-串联质谱法；

所述的介孔二氧化锆杂化柱为底部设有聚四氟乙烯活塞的玻璃层析柱，玻璃层析柱腔体内设有若干层萃取层，即自下而上依次为无水硫酸钠层（1）、介孔二氧化锆微球层（2）、酸化硅胶层（3）、介孔二氧化锆微球层（2）和无水硫酸钠层（1）；

所述介孔二氧化锆杂化柱中介孔二氧化锆微球层的材料为ZrO₂/mSiO₂复合材料，其制备方法如下：1）伪晶转化的介孔二氧化硅的合成：取200-300目的层析硅胶，用体积配比浓盐酸：水=1:1的溶液浸泡一晚后，纯水洗涤至中性，160℃烘干，得到活化的硅胶；按照摩尔比SiO₂:NaOH:CTAB:H₂O= 1:0.25:0.1:40的比例，混合反应物后，倒入高压釜中，130℃反应24h后，产物用水和乙醇清洗，放入550 ℃的马弗炉中烧去模板CTAB，得到伪晶转化的介孔二氧化硅；2）ZrO₂/mSiO₂复合材料的制备：取10 g ZrOCl₂·8H₂O加入到200 mL的水中，搅拌溶解后加入50 g的伪晶转化介孔二氧化硅，在60℃不断搅拌至干燥，然后在100 ℃下干燥6h；将ZrOCl₂负载的硅胶放置在14%的氨水溶液中，在60℃的水浴中反应5h，过滤，抽干，放入550 ℃的马弗炉中煅烧8h，即得到ZrO₂/mSiO₂复合材料。

2.根据权利要求1所述的一种同步测定油脂类食品中六溴环十二烷异构体和四溴双酚A含量的方法，其特征在于：所述介孔二氧化锆杂化柱长350mm、内径20mm，其萃取层的填充方法为：依次倒入2cm无水硫酸钠、5g ZrO₂/mSiO₂复合材料、10g 44%酸化硅胶、5gZrO₂/mSiO₂复合材料、2cm无水硫酸钠。

3.根据权利要求1所述的一种同步测定油脂类食品中六溴环十二烷异构体和四溴双酚A含量的方法，其特征在于：所述酸化硅胶层（3）的材料为44%的酸化硅胶，其制备方法为：将60-200目硅胶依次用甲醇和二氯甲烷淋洗，每次使用的溶剂体积为硅胶体积的两倍；完成淋洗后将硅胶放置在铝箔上于通风柜中自然风干，然后130 ℃下活化4 h；称取活化好的硅胶逐步加入浓硫酸中，振摇过夜至无块状物，所述硅胶：硫酸的重量配比为44：56。

4.根据权利要求1所述的一种同步测定油脂类食品中六溴环十二烷异构体和四溴双酚A含量的方法，其特征在于样品提取方法如下：称取样品置于纤维素套筒中，加入浓度为100ng/mL的 ¹³C₁₂-六溴环十二烷标准和¹³C₁₂-四溴双酚A混合标准应用溶液200μL和适量无水硫酸钠，用体积比正己烷:丙酮=1:1的混合溶液作为提取剂，在50~70℃的温度下，用索氏提取装置提取18~24h，回流速度控制在4次~6次/h；提取液旋转蒸发后放置过夜，用正己烷复溶，得到提取液。

5.根据权利要求1所述的一种同步测定油脂类食品中六溴环十二烷异构体和四溴双酚A含量的方法，其特征在于：所述超高效液相色谱-串联质谱法参数设置如下：

液相条件：色谱柱选用Waters BEH C18柱；柱温：50 ℃；样品池温度：10 ℃；进样体积：5 μL；流速：0.3 mL/min；流动相A液为体积比甲醇：乙腈=1：1混合液，B液为超纯水，等度洗脱，A:B=80:20；

质谱参考条件：离子源为电喷雾电离ESI，负离子模式，检测方式为MRM，反吹气温度为325 ℃；反吹气流量为6 L/min；压力为42 psi；鞘气温度为380 ℃；鞘气流量为11 L/min；毛细管电压为4000 V；喷嘴电压为1500 V。

6.采用如权利要求1或2中所述的介孔二氧化锆杂化柱在测定动物性食品中六溴环十二烷异构体和四溴双酚A含量的应用。

7.采用如权利要求1或2中所述的介孔二氧化锆杂化柱在测定肉类、蛋类、乳类、油脂类、土壤中六溴环十二烷异构体和四溴双酚A含量的应用。