CN1051802C - 苏云金杆菌粉剂发酵工艺 - Google Patents

Abstract

本发明涉及苏云金杆菌粉剂发酵工艺，本发酵工艺包括：无菌粉剂发酵培养基和原菌液的制备、接种、粉剂发酵和检验几个主要过程。粉剂发酵温度为28-32℃，时间为24小时。本工艺的优点是投料、灭菌、发酵均在密封的粉剂发酵罐内一次完成，产品含菌量在400亿/克以上。

Description

苏云金杆菌粉剂发酵工艺

本发明涉及一种苏云金杆菌粉剂发酵工艺。

现有苏云金杆菌的发酵到制剂形成，一是液体深层发酵，通过后处理所得，二是固体培养，通过后加工处理所得。现分别对以上两种制作工艺加以说明。

一、液体深层发酵及制剂工艺：

1.菌种的活化及扩大培养：使用前将菌种接种到茄子瓶斜面培养基上，30℃培养72小时。经检查无杂菌，无噬菌斑，90％以上芽孢囊破裂，冰箱内保存一周方可使用。每瓶加无菌水30ml，制成菌悬液，水浴75℃处理15分钟，用于接种。

2.种子罐培养：按种子罐体积的70％配料，可使选择的培养基成份主要有：液体原料是玉米浆，饴糖、废乳清、废椰子乳等，固体原料有：黄豆饼粉、棉籽饼粉、花生饼粉、鱼粉、淀粉、蛋白胨，各种豆类、糊精等；矿质原料有：CaCO₃，MgSO₄，KH₂PO₄，K₂CO₃等，调PH值7.4-8.0，然后在121℃，1.1kg/cm²压力下，灭菌30分钟，再降温至32±1℃接种、培养。当培养至6-10小时。经镜检，种子液无杂菌污染，菌形正常，生长整齐，方可移种。

3.发酵罐培养：按发酵罐体积的70％配料，(发酵罐配料用成份，配比，和PH值，与种子罐相同的培养基)。灭菌、移种，在罐温28-32℃，罐压0.3-0.5kg/cm²，通气量在1∶0.6-1∶1.2之间，搅拌转速在220r/min下培养，当培养至绝大部分芽孢明显形成，20-40％芽孢囊破裂释放出芽孢和伴晶体时放罐(此时一般含菌量为25-47亿/ml，少数能达40-70亿/ml)。

4.浓缩和制剂：浓缩的方法可选择。

(1)板框压滤。根据发酵液含菌量的高低，按比例加入适量的填充剂，(CaCO₃，硅藻土等惰性物质)再经过板框压滤，喷雾干燥，依生产工艺的不同而产品的收率不同，用板框压滤喷雾干燥收率只50-60％，最高达75％，填充剂加入经搅拌充分吸附后，在2.0-2.4kg/cm²的压力下，通过七号滤布过滤。去滤液，滤饼打浆加助剂后喷雾干燥，在喷雾干燥塔进口温度达150℃时，开始喷雾，需控制喷雾流量，使中层保持在70℃，如果温度过高将使伴孢晶体毒素遭到破坏。

(2)离心。离心液可直接经Z₈₀型管柱状离心机离心；用L_AB-102型实心转筒碟片式离心和RCPx-207型间歇流出碟片式离心机分离时，杀虫活性成分的收集量取决于流量。用L_AB-102型离心，流量从12L/小时，增加到14和16L/小时，活性成分分别损失2％和10-11％。当用RCPx-207型离心时，流量从100L/小时增加到200和300L/小时，活性成份损失7-7.2％和12-12.3％，离心的糊状物调PH3.5-4.5并加入金属盐和含油物以形成稳定的苏云金杆菌制剂。与二甲苯或柴油混合，混合物用水和少量乳化剂乳化制备成油水悬液。也可以通过压力环流或真空干燥进行干燥。

(3)减压浓缩。在真空高度730-760mm水银柱，温度55-65℃的条件下，经薄膜浓缩器浓缩，或经刮板浓缩器浓缩。

5.包装：按照所需要求进行分装。

二、固体发酵及制剂工艺

1.菌种的活化及扩大培养：方法和液体深层发酵及制剂工艺1相同。

2.培养基的配制(培养基主要选用小麦麸454g，膨胀的珍珠岩为380g，大豆饼62g，右旋糖38g，NaCl0.9g，CaCl20.29g，水160ml)。

3.培养料的分装，灭菌和接种。将配制好的培养料分装成袋，然后每袋都进行高温(121℃)高压(1.1kg/cm³以上)灭菌40-60分钟，当培养料冷却至28℃时对每袋进行接种。

4.培养：首先要对培养室进行灭菌，然后将已接种的袋装培养基放入无菌室在28-32℃的条件下培养，当培养至绝大部分芽孢明显形成，20-40％芽孢囊破裂释放出芽孢和伴孢晶体时为合格。

5.清洗，加填充剂：将培养好的苏云金杆菌固体，用无菌水清洗过滤，除掉培养基，留下悬浮液，再加填充剂(CaCO₃，硅藻土等惰性物质)吸附。

6.浓缩和制剂：方法和液体深层发酵及制剂工艺中的4相同。

7.包装：按照需求分装。

从以两种苏云金杆菌发酵方式到制剂的形成工艺来看，一是工艺繁杂，费工、费水、费电，操作机械化程度低；二是生产成本高，产品流失量多，质量低，而又易于污染。到目前还没有一种设备达到一次性发酵完成出来的高质量粉剂。

本发明目的是为了寻求一种克服现有苏云金杆菌液体深层发酵工艺固体发酵的不足，提供一种活菌多、毒力强的苏云金杆菌粉剂发酵工艺。

上述目的可以通过以下阐述的苏云金杆菌粉剂发酵工艺实现；

苏云金杆菌粉剂发酵工艺，包括无菌粉剂培养基的制备，原菌种的活化、扩大培养、接种、粉剂发酵、检验、包装等。其粉剂发酵过程：

按发酵罐容积的1/4-1/2加入细度100-200目/英寸以上的苏云金杆菌发酵载体——草碳，按1公斤的载体，加入配制好的营养液0.2-0.6公斤，并加水搅拌，使其含水量为15-25％，并调PH7.2-7.6左右，通入蒸汽加温(121℃)，加压(1.5kg/cm²)进行灭菌30-60分钟，然后降温到28-32℃，此时一般含水量为20-30％，制成无菌的粉剂培养基。然后将培养好的苏云金杆菌原菌液按4×10⁴cfv/g的比例通过接种取样孔接种于粉剂发酵罐内，在28-32℃的条件下，间断或不间断搅拌，培养24小时，经检验、当含菌量达到400亿/克以上，放罐、干燥、粉碎(细度为200目/英寸)、包装。

附图是苏云金杆菌粉剂发酵工艺流程图。

本工艺的显著优点是从粉剂培养料的配制、接种、到发酵的全过程均在粉剂发酵罐内一次完成。从而减少了苏云金杆菌的发酵工艺步骤，防止了杂菌污染，提高了产品质量，菌剂含菌量得到了提高，达到了每克菌剂含菌400亿以上。

下面叙述本发明的实施例：

苏云金杆菌粉剂发酵工艺包括无菌粉剂培养基的制备、原菌种活化、扩大培养、接种、粉剂发酵、检验、包装等工艺过程。其中无菌粉剂培养基的制备，原菌种活化，扩大培养，接种，检验，包装工艺为现有技术。粉剂发酵过程为：

1、将苏云金杆菌载体——草碳粉碎，细度为100-200目/英寸。

2、将载体加入发酵罐内，加入量为发酵罐容积的1/4-1/2，按1公斤的载体，加入配制好的营养液0.2-0.6公斤，并加水搅拌，使其含水量为15-25％，调节PH值为7.2-7.6，通入蒸汽加温至121℃，压力1.5kg/cm²，在此条件下灭菌30-60分钟，随后降温到28-32℃，含水量为20-30％，从而制成无菌粉剂培养基。所用营养液(10kg)的配方是：

硫酸镁               100克

牛肉膏               100克

碳酸钙               1000克

蛋白胨               200克

葡萄糖               500克

磷酸氢二钾           80克

其余为水

3、将原菌种活化，用扁瓶扩大培养，用无菌水刮洗，在无菌条件下，按4×10⁴cfv/g比例通过接种取样孔，接种于发酵罐的粉剂培养基上。

4、保持发酵罐温度28-32℃，间断或不间断搅拌，培养24小时，经检验、当含菌量达到400亿/克以上，放罐、干燥、粉碎(细度为200目/英寸)、包装。活孢数为200亿/克以上。

该苏云金杆菌粉剂是一种杀虫谱较广、毒力强、效果持久、性能稳定。是杀害对农、林经济作物和观赏植物的鳞翅目害虫效果最佳的生物制剂。

上述苏云金杆菌粉剂发酵工艺通过专用发酵设备实现(该专用发酵设备已申请中国专利，专利申请号为：91105478.2)。

Claims (2)

1、一种苏云金杆菌粉剂发酵工艺，包括无菌粉剂培养基的制备、原菌种的活化、扩大培养、接种、粉剂发酵、检验、包装工艺，其特征在于：粉剂发酵是按以下步骤实现的：

(1)按发酵罐容积的1/4-1/2加入细度100-200目/英寸以上的苏云金杆菌发酵载体——草碳，按1公斤的载体，加入配制好的营养液0.2-0.6公斤，并加水搅拌，使其含水量为15-25％，并调节PH值为7.2-7.6，通入蒸汽加温到121℃，加压到1.5kg/cm²进行灭菌30-60分钟，然后降温到28-32℃，此时含水量为20-30％，制成无菌的粉剂培养基；

(2)将培养好的苏云金杆菌原菌液按4×10⁴cfv/g的比例通过接种取样孔接种于粉剂发酵罐内，在28-32℃的条件下，间断或不间断搅拌，培养24小时，经检验，当含菌量达到400亿/克以上时，放罐、干燥、粉碎(细度为200目/英寸)、包装。

2、根据权利要求1所述的粉剂发酵工艺，其特征在于：营养液的配方(10000g)为：牛内膏100克、蛋白胨200克、磷酸二氢钾80克、硫酸镁100克、葡萄糖500克、碳酸钙1000克，其余为水。

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