CN105177063A - 一种利用甘蔗渣生产富马酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用甘蔗渣生产富马酸的方法，将甘蔗渣粉碎，经过40目筛分后，将甘蔗渣加入至稀酸中进行超声处理，超声时间为2～3h，超声温度为25～40℃，超声频率为80-150赫兹，然后再在微波500W加热0.5-1L后经抽滤得到甘蔗渣水解液；将米根霉的孢子悬浮液接种于将种子培养基中进行种子培养，然后种到发酵培养基中进行发酵培养，其中种子培养基包括甘蔗渣水解液和其他的氮源和无机盐，发酵培养基包括甘蔗渣水解液和其他和无机盐，无需另外加入氮源，本发明利用超声-微波相联合的方法对甘蔗渣进行水解，然后直接利用其水解液发酵制备富马酸的方法，除降低富马酸的制备成本外，还实现了废物利用。

Description

一种利用甘蔗渣生产富马酸的方法
技术领域
本发明属于生物工程领域，涉及一种利用甘蔗渣生产富马酸的方法。
背景技术
富马酸（Fumaricacid）作为一种重要的有机基本化工原料和大宗化工产品，广泛应用于涂料、树脂、医药、增塑剂、食品添加剂等领域，具有重要的市场价值。同时，以富马酸为原料可以进一步合成多种高价值衍生物，如富马酸二甲酯（DMF）、富马酸亚铁等。另外，富马酸作为一种重要的四碳平台化合物，还可以通过酶催化转化、酯化、加氢等工艺生产L-天冬氨酸、苹果酸、琥珀酸、马来酸、1,4-丁二醇、γ-丁内酯和四氢呋喃等四碳化合物。
在粮食短缺的威胁下，探索木质纤维素原料生产富马酸成为化工原料发展战略的重要组成，也是研究的热点。木质纤维素原料是自然界分布最广、含量最多、价格低廉，而又未得到充分利用的可再生资源。甘蔗渣作为制糖工业的副产品，是通过不同方法将糖汁提取后剩余的纤维性残渣，其组成以纤维素(43.6％)、半纤维素(21.5％)和木质素(26.4％)为主利用蔗渣纤维原料生产富马酸，可大大缓解蔗渣原料浪费的局面。
在利用微生物进行富马酸发酵生产的过程中，碳源作为原料中的主要成分对微生物的生长代谢起到了至关重要的作用，几乎参与微生物代谢的各个方面。而碳源成本在发酵成本中占据着举足轻重的地位，如何降低碳源的成本，也是微生物发酵领域密切关注的焦点。蔗渣中含有30%～35%的半纤维素成分，将此成分通过水解，可转化为被微生物利用的碳源，传统富马酸发酵所用的主要原料是淀粉类，成本较高，而且大规模工业化生产会消耗大量粮食，加剧粮食与饲料资源的紧张状况。而以甘蔗渣为原料生产乳酸，不仅能大大拓展其生产原料的来源、降低原料成本，而且对解决粮食危机和减少环境污染有积极意义。
发明内容
本发明提供一种利用甘蔗渣生产富马酸的方法，利用超声-微波相联合的方法对甘蔗渣进行水解，然后直接利用其水解液发酵制备富马酸酸的方法，降低富马酸的制备成本外，还实现了废物利用。
为了解决上述问题，本发明采用的技术方案是这样的：一种利用甘蔗渣生产富马酸的方法，包括如下步骤：
1）将甘蔗渣粉碎，过20-40目筛后，将甘蔗渣加入至稀酸中进行超声处理，超声时间为2～3h，超声温度为25～40℃，超声频率为80-150赫兹，其中，甘蔗渣在烯酸中的浓度为200-300g/L；
2）将步骤1）得到的料液在微波功率为500W下，加热0.5-1h后经抽滤得到甘蔗渣水解液；
3）将米根霉的孢子悬浮液接种于将种子培养基中进行种子培养，其中，种子培养基为：甘蔗渣水解液10-15ml，H2O30-40ml，尿素0.04-0.0.06g，KH2PO40.024-0.028g，MgSO4·7H2O:0.02-0.025g，ZnSO40.044-0.05g，FeSO4·7H2O0.036-0.042g，pH2.5-4，在115～121℃条件下灭菌15～20min；
4）经步骤3）所培养的种子液接种到发酵培养基中进行发酵培养，其中发酵培养基为：甘蔗渣水解液40-60ml，H2O20-40ml，KH2PO40.024-0.028g，MgSO4·7H2O0.02-0.025g，ZnSO40.044-0.05g，FeSO4·7H2O0.036-0.042g，CaCO30.32-0.4g，pH6-7，在115～121℃条件下灭菌15～20min。
所述的稀酸为稀硫酸或稀柠檬酸,稀酸的摩尔浓度为0.5-1mol/L。经试验验证，当稀酸选为稀柠檬酸时，得到甘蔗渣水解液中还原糖得率更高。
所述的孢子悬浮液是经斜面培养6～7天的米根霉用无菌水洗下孢子而制成，孢子悬浮液中孢子浓度为5-6×107个/mL，孢子悬浮液接种于种子培养基中的接种量为2.5-5%。
优选地，种子培养用摇瓶进行培养，培养条件为在30～40℃条件下培养28～32h，摇床的转速为200-250rpm。
优选地，发酵培养用摇瓶进行培养，培养的条件为在30～40℃下培养60～85h，摇床的转速为200-250rpm。
优选地，种子液接种到发酵培养基中的接种量为5%～10%。
有益效果：
1、本发明将蔗渣通过超声和微波相结合对用稀酸溶解的甘蔗渣进行水解处理，无需另外加商品的纤维素水解酶，得到了含有多组分的糖液，而该糖液不需要经过脱毒处理，进行灭菌后可直接作为碳源来对米根霉进行培养身产富马酸，简化了传统水解糖分作为碳源需要脱毒的复杂的工艺手续和成本。
2、甘蔗渣中除含有丰富的纤维素和半纤维素，并含有一定量的蛋白质，因此其水解液发酵制备富马酸时，无需另外添加氮源，进一步节省了原料成本。
具体实施方式
为了加深对本发明的理解，下面将结合实施例对本发明作进一步详述，这些实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明保护范围的限定。
斜面培养基：PDA培养基；
富马酸的HPCL的测定方法：富马酸是采用DIONEXsummitP680高效液相色谱仪测定。色谱柱为AminexHPX-87H柱（Bio-Rad），柱温：65℃紫外检测波长210nm，流动相为5mmol/LH2SO4，流速为0.8mL/min，进样量为20μL。
实施例1
一种利用甘蔗渣生产富马酸的方法，包括如下步骤：
1）将甘蔗渣粉碎，过20-40目筛后，将200g甘蔗渣加入至1L稀硫酸中进行超声处理，稀硫酸稀酸的摩尔浓度为0.5mol/L，超声时间为2h，超声温度为30℃，超声频率为80赫兹；
2）将步骤1）得到的料液置于微波炉中，在微波功率为500W下加热1h，经抽滤得到甘蔗渣水解液，经测定，水解液中的总还原糖的浓度为87.6g/L;
3）经斜面培养6～7天的米根霉用无菌水洗下孢子配成孢子悬浮液，孢子悬浮液中孢子浓度为6×107个/Ml，取1.2mL接种于种子培养基中，在35℃、200rpm条件下进行种子培养30h；其中，种子培养基为：甘蔗渣水解液15ml，H2O30mL，氮源0.08g，KH2PO40.024g，MgSO4·7H2O0.02g，ZnSO40.044g，FeSO4·7H2O0.036g，pH2.5，在115～121℃条件下灭菌15～20min;
4）取经步骤3）所培养的种子液6mL接种到发酵培养基中，在35℃、200rpm条件下进行发酵培养60h，发酵结束后，测其富马酸的产量为32g/L，其中发酵培养基：甘蔗渣水解液60mL，H2O20mL，KH2PO40.024g，MgSO4·7H2O:0.02g，ZnSO40.044g，FeSO4·7H2O0.036gCaCO30.32g，pH6，在115～121℃条件下灭菌15～20min。
实施例2
一种利用甘蔗渣生产富马酸的方法，包括如下步骤：
1）将甘蔗渣粉碎，过20-40目筛后，将300g甘蔗渣加入至1L稀柠檬酸中进行超声处理，稀硫酸稀酸的摩尔浓度为1mol/L，超声时间为3h，超声温度为40℃，超声频率为150赫兹；
2）将步骤1）得到的料液置于微波炉中，在微波功率为500W下加热0.5h，经抽滤得到甘蔗渣水解液；经测定，水解液中的总还原糖的浓度为140.7g/L;
3）经斜面培养6～7天的米根霉用无菌水洗下孢子配成孢子悬浮液，孢子悬浮液中孢子浓度为5×107个，取2mL接种于将种子培养基中，在35℃、250rpm条件下进行种子培养32h；其中，种子培养基为：甘蔗渣水解液10mL，H2O40mL，氮源0.10g，KH2PO40.028g，MgSO4·7H2O:0.025g，ZnSO40.005g，FeSO4·7H2O0.042g，pH2.5，在115～121℃条件下灭菌15～20min。
4）取经步骤3）所培养的种子液4mL接种到发酵培养基中，在40℃、250rpm条件下进行发酵培养85h，发酵结束后，测其富马酸的产量为40g/L，其中发酵培养基：甘蔗渣水解液40mL，H2O40ml，KH2PO40.028g，MgSO4·7H2O0.025g，ZnSO40.005g，FeSO4·7H2O0.042g，pH2.5，在115～121℃条件下灭菌15～20min。
实施例3
一种利用甘蔗渣生产富马酸的方法，包括如下步骤：
1）将甘蔗渣粉碎，过20-40目筛后，将250g甘蔗渣加入至1L稀柠檬酸中进行超声处理，稀硫酸稀酸的摩尔浓度为0.8mol/L，超声时间为2.5h，超声温度为30℃，超声频率为120赫兹；
2）将步骤1）得到的料液置于微波炉中，在微波功率为500W下加热0.8h，经抽滤得到甘蔗渣水解液，经测定，水解液中的总还原糖的浓度为115.5g/L;
3）经斜面培养6～7天的米根霉用无菌水洗下孢子配成孢子悬浮液，孢子悬浮液中孢子浓度为5×107个，取2mL接种于将种子培养基中，在40℃、220rpm条件下进行种子培养30h；其中，种子培养基为：甘蔗渣水解液12mL，H2O35mL，氮源0.09g，KH2PO40.026g，MgSO4·7H2O0.022g，ZnSO40.048g，FeSO4·7H2O0.04g，pH3，在115～121℃条件下灭菌15～20min。
4）经步骤3）所培养的种子液8mL接种到发酵培养基中，在40℃、220rpm条件下进行发酵培养80h，发酵结束后，测其富马酸的产量为39.6g/L，其中发酵培养基：甘蔗渣水解液50mL，H2O30mL，，KH2PO40.026g，MgSO4·7H2O0.022g，ZnSO40.048g，FeSO4·7H2O0.04g，在115～121℃条件下灭菌15～20min。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种利用甘蔗渣生产富马酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）将甘蔗渣粉碎，过20-40目筛后，将甘蔗渣加入至稀酸中进行超声处理，超声时间为2～3h，超声温度为25～40℃，超声频率为80-150赫兹，其中，甘蔗渣在烯酸中的浓度为200-300g/L；
2）将步骤1）得到的料液在微波功率为500W下，加热0.5-1h后经抽滤得到甘蔗渣水解液；
3）将米根霉的孢子悬浮液接种于将种子培养基中进行种子培养，其中，种子培养基为：甘蔗渣水解液10-15ml，H2O30-40ml，尿素0.04-0.0.06g，KH2PO40.024-0.028g，MgSO4·7H2O:0.02-0.025g，ZnSO40.044-0.05g，FeSO4·7H2O0.036-0.042g，pH2.5-4，在115～121℃条件下灭菌15～20min；
4）经步骤3）所培养的种子液接种到发酵培养基中进行发酵培养，其中发酵培养基为：甘蔗渣水解液40-60ml，H2O20-40ml，KH2PO40.024-0.028g，MgSO4·7H2O0.02-0.025g，ZnSO40.044-0.05g，FeSO4·7H2O0.036-0.042g，CaCO30.32-0.4g，pH6-7，在115～121℃条件下灭菌15～20min。
2.根据权利要求1所述的一种利用甘蔗渣生产富马酸的方法，其特征在于，稀酸为稀硫酸或稀柠檬酸，稀酸的摩尔浓度为0.5-1mol/L。
3.根据权利要求2所述的一种利用甘蔗渣生产富马酸的方法，其特征在于，稀酸优选为稀柠檬酸。
4.根据权利要求1所述的一种利用甘蔗渣生产富马酸的方法，其特征在于，所述的孢子悬浮液是经斜面培养6～7天的米根霉用无菌水洗下孢子而制成，孢子悬浮液中孢子浓度为5-6×107个/mL。
5.根据权利要求4所述的一种利用甘蔗渣生产富马酸的方法，其特征在于，孢子悬浮液接种于种子培养基中的接种量为2.5-5%。
6.根据权利要求1所述的一种利用甘蔗渣生产富马酸的方法，其特征在于，种子培养用摇瓶进行培养，培养条件为在30～40℃条件下培养28～32h，摇床的转速为200-250rpm。
7.根据权利要求1所述的一种利用甘蔗渣生产富马酸的方法，其特征在于，发酵培养用摇瓶进行培养，培养的条件为在30～40℃下培养60～85h，摇床的转速为200-250rpm。
8.根据权利要求1所述的一种利用甘蔗渣生产富马酸的方法，其特征在于，种子液接种到发酵培养基中的接种量为5%～10%。
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