CN105168196A - (4-羟基-3-甲氧基苯基)乳酸在治疗心血管疾病中的应用 - Google Patents
(4-羟基-3-甲氧基苯基)乳酸在治疗心血管疾病中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)乳酸在治疗心血管疾病中的应用，本发明通过对3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)乳酸在心血管系统方面的药效活性进行研究，发现其对大鼠急性心肌缺血具有拮抗作用、还具有清除DPPH自由基作用，表明3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)乳酸在降低心肌梗塞发生率、抗急性心肌缺血、清除DPPH自由基(DPPH·)的作用和清除超氧阴离子自由基(02 -.)作用方面均优于丹参素。
Description
技术领域：
本发明涉及一种药物新用途，特别涉及3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)乳酸及其对映异构体在治疗心血管疾病中的应用。
背景技术：
心血管疾病又称为循环系统疾病，心血管疾病已成为影响人类健康的主要疾病之一。循环系统指人体内运送血液的器官和组织，主要包括心脏、血管(动脉、静脉、微血管)，可以细分为急性和慢性，一般都是与动脉硬化有关。其常见病种有冠心病、高血压、运动猝死、心绞痛、急性心肌梗死、冠心病、高血脂。心肌梗塞即急性心肌梗死。急性心肌梗死是冠状动脉急性、持续性缺血缺氧所引起的心肌坏死。临床上多有剧烈而持久的胸骨后疼痛，休息及硝酸酯类药物不能完全缓解，伴有血清心肌酶活性增高及进行性心电图变化，可并发心律失常、休克或心力衰竭，常可危及生命。本病在欧美最常见，美国每年约有150万人发生心肌梗死。中国近年来呈明显上升趋势，每年新发至少50万，现患至少200万。
心血管系统疾病与自由基产生、能量代谢障碍以及钙超载等因素之间有密切关系。首先,心血管疾病发生时大量钙离子内流是一种能量依赖过程,而自由基产生也与能量代谢异常密切相关。线粒体是心肌能量代谢的主要细胞器,也是自由基产生的重要场所。其次,能量代谢障碍和自由基损伤是互为因果的两大因素,能量代谢障碍是自由基产生的基础,自由基可加重能量代谢障碍,能量代谢障碍是再灌注损伤的始动环节,自由基是直接引起损伤的主要因素。再次,钙超载和自由基损伤也是互成因果的两大因素,钙超载后细胞膜结构的变化使其对氧自由基损伤的敏感性增加,大量氧自由基对膜结构的破坏作用是引起钙超载的因素之一。最后,自由基产生、能量代谢障碍及钙超载的结果,必将引发机体自体活性物质如炎性细胞因子的反应,炎性细胞因子的过度表达,必将导致心血管系统结构和功能的病变。
丹参素(化学结构式如下)
丹参素是唇形科植物丹参和甘西鼠尾草根的水溶性药用成分，属于酚性芳香酸类化合物，近几十年来对丹参素的药理学研究表明，丹参素通过钙拮抗、清除自由基、保护线粒体以及抗氧化等诸多方面的机制起到保护心肌作用；丹参素还具有抗血栓形成、抑制血小板凝集、降血脂、保护肝脏、抗炎、抗肿瘤等作用。
由于丹参的来源有限，丹参中丹参素的含量又较低，从丹参植物中提取、分离和纯化丹参素步骤较繁杂(张德成,吴伟良,刘星堦，等:丹参水溶性有效成分的研究II·D(+)β-(3,4-(二羟基苯基)乳酸的结构[J].中成药，1982,5(1):11.)，而且它在丹参中的含量仅为1％左右；同时丹参素为邻二酚及羧羟基结构，化学性质极不稳定，给临床医师和医药工作者带来了诸多不便；虽然丹参素人工合成已经取得了成功，但存在着成本高、产物纯度和收率低的缺点。所以丹参素应用于工业生产有相当的局限性，限制了丹参素的推广应用。
丹参素在体内的代谢产物不包括原型还有五种代谢产物，这五种其中有四种是甲基化产物，一种是羟基化产物(文献：Zi-chuanZhang,ManXu,Shi-fengSun,etal.JournalofChromatographyB[J],871(2008)7–14)，可见丹参素的代谢产物主要是甲基化代谢产物，但是在体内主要起活性作用的物质目前并不知道是丹参素本身还是它的代谢产物。鉴于丹参素在多方面都具有非常好的药效作用，而且由于丹参素本身化学性质极不稳定，以及在分离和合成方面的诸多缺点，到目前为止还不能单独成药，所以本发明寻找一种丹参素的代谢产物，通过研究其药物结构以及药理活性，从而开发出一种有效的新药物。
本发明以丹参素作为对照药物，对以下化合物进行了研究。
3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)乳酸(化学结构如下)CAS:2475-56-1
3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)乳酸为丹参素体内代谢产物，可以通过分离丹参素在大鼠尿液中的代谢产物得到，也可以采用文献报道的方法(童元峰等，中国药物化学杂志，2007，92-94)进行合成。该化合物在文献(丹参素类似物的合成及抗缺氧活性研究，孙举，2009，延边大学硕士学位论文)中曾有报道，具有抗缺氧的活性。该化合物可以通过供应商UniversidadAutonomadeMadrid/LumilaResearchGroup购买得到。
发明内容：
本发明提供了丹参素体内代谢产物3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)乳酸及其对映异构体的医药用途，本发明所述医药用途是提供3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)乳酸及其对映异构体或其药学上可接受的盐在制备治疗心血管疾病的药物中的应用。
其中，所述的心血管疾病为急性心肌梗塞。本发明发现，3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)乳酸能够降低心肌梗塞率。
其中，所述的心血管疾病为急性心肌缺血。本发明发现3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)乳酸能够抵抗急性心肌缺血，保护心肌。
其中，所述的心血管疾病是由自由基过量导致的，自由基具有直接或间接地发挥强氧化作用，广泛地参与机体的生理与病理过程。机体自由基过量时，能通过氧化作用损伤机体。本发明发现3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)乳酸可清除过量自由基。上述所述的清除过量自由基优选自由基为DPPH自由基。所述的3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)乳酸清除DPPH自由基清除率呈剂量依赖性增强。优选清除自由基为超氧阴离子自由基。所述的3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)乳酸清除超氧阴离子自由基的清除率呈剂量依赖性增强。
以下为本发明的名词解释
1、二苯三硝基苯麟(DPPH)：本身为一种带有不配对电子的稳定自由基。在化学试管实验中常用它检测其它化学物质(特别是黄酮类化合物)清除自由基的作用。
2、超氧阴离子(02 -.)：氧分子受单一电子还原的产物称为超氧阴离子O2+e→O2。O2是阴离子，又是自由基，性质活泼，具有很强的氧化性和还原性，既是氧化剂，又是还原剂，过量生成可致组织损伤。人体内有一定数量的存在，不发生化学变化对人体无害，但与羟基(-OH)结合后的产物会导致细胞DNA损坏，破坏人类机体功能。
本发明所述3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)乳酸及其对映异构体药学上可接受的盐可以包括碱金属或碱土金属的盐，如钾盐，钠盐，钙盐，镁盐等，优选钾盐和钠盐。为将3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)乳酸及其对映异构体或其药学上可接受的盐制备成可供服用的药物，本发明还包括将其制备成适宜的药物组合物的形式。这类组合物可以以常规方式与一种或多种生理上可接受的载体或赋形剂混合使用。若有可能在治疗上将3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)乳酸及其对映异构体或其药学上可接受的盐作为原料药给药。
本发明的药物组合物，在使用时可以根据需要制备成药物制剂形式，如口服制剂形式，注射剂形式，阴道或肛门栓剂形式等。
本发明的药物组合物在制备成药物制剂时，根据需要可以加入要学上可接受的载体。
本发明的药物组合物，根据需要可以含有药物可接受的载体，其中3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)乳酸及其对映异构体或其药学上可接受的盐作为药物活性成分，其在制剂中所占重量百分比可以是0.01-99.99％，其余为药物可接受的载体。本发明的药物制剂，以单位剂量形式存在，所述单位剂量形式是指制剂的单位，如片剂的每片，胶囊的每粒胶囊，口服液的每瓶，颗粒剂每袋，注射剂的每支等。
本发明的药物组合物可以是任何可药用的剂型，这些剂型包括：片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注射剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂、滴剂、滴丸剂、贴剂。
本发明的药物组合物，其口服给药的制剂可含有常用的赋形剂，诸如粘合剂、填充剂、稀释剂、压片剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、调味剂和湿润剂，必要时可对片剂进行包衣。
适用的填充剂包括纤维素、甘露糖醇、乳糖和其它类似的填充剂。适宜的崩解剂包括淀粉、聚乙烯吡咯烷酮和淀粉衍生物，例如羟基乙酸淀粉钠。适宜的润滑剂包括，例如硬脂酸镁。适宜的药物可接受的湿润剂包括十二烷基硫酸钠。
可通过混合，填充，压片等常用的方法制备固体口服组合物。进行反复混合可使活性物质分布在整个使用大量填充剂的那些组合物中。
口服液体制剂的形式例如可以是水性或油性悬浮液、溶液、乳剂、糖浆剂或酏剂，或者可以是一种在使用前可用水或其它适宜的载体复配的干燥产品。这种液体制剂可含有常规的添加剂，诸如悬浮剂，例如山梨醇、糖浆、甲基纤维素、明胶、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、硬脂酸铝凝胶或氢化食用脂肪，乳化剂，例如卵磷脂、脱水山梨醇一油酸酯或阿拉伯胶；非水性载体(它们可以包括食用油)，例如杏仁油、分馏椰子油、诸如甘油的酯的油性酯、丙二醇或乙醇；防腐剂，例如对羟基苯甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸，并且如果需要，可含有常规的香味剂或着色剂。
对于注射剂，制备的液体单位剂型含有本发明的活性物质和无菌载体。根据载体和浓度，可以将此化合物悬浮或者溶解。溶液的制备通常是通过将活性物质溶解在一种载体中，在将其装入一种适宜的小瓶或安瓿前过滤消毒，然后密封。辅料例如一种局部麻醉剂、防腐剂和缓冲剂也可以溶解在这种载体中。为了提高其稳定性，可在装入小瓶以后将这种组合物冰冻，并在真空下将水除去。
本发明的药物组合物，在制备成药剂时可选择性的加入适合的药物可接受的载体，所述药物可接受的载体选自：甘露醇、山梨醇、焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、盐酸半胱氨酸、巯基乙酸、蛋氨酸、维生素C、EDTA二钠、EDTA钙钠，一价碱金属的碳酸盐、醋酸盐、磷酸盐或其水溶液、盐酸、醋酸、硫酸、磷酸、氨基酸、氯化钠、氯化钾、乳酸钠、木糖醇、麦芽糖、葡萄糖、果糖、右旋糖苷、甘氨酸、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、硅衍生物、纤维素及其衍生物、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、土温80、琼脂、碳酸钙、碳酸氢钙、表面活性剂、聚乙二醇、环糊精、β－环糊精、磷脂类材料、高岭土、滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁等。
本发明的药物制剂在使用时根据病人的情况确定用法用量，可每日服三次，每次1-20剂，如：1-20袋或粒或片，每剂1mg-1000mg。
本发明提供的药物在用于疾病的治疗时，用于成人治疗的剂量通常将在0.02-5000mg每天的范围，优选1-1500mg每天。所需剂量可以是单一的剂量或多次的计量，按适当的间隔给药，例如每天两次、三次、四次或更多。根据本发明的制剂可以含有0.1-99％的活性成分，对片剂和胶囊剂优选30-95％，液体制剂优选3-50％。
本发明在于首次发现3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)乳酸及其对映异构体或其药学上可接受的盐具有药物用途，该发现是通过丹参素代谢产物的研究及大量药效学试验筛选得到的：通过下述试验例证明本发明的有益效果。
实验一、丹参素在大鼠体内代谢研究
1仪器与材料
1.1仪器
Agilent1260型高效液相色谱仪(Agilent美国)，Agilent光电二级管阵列检测器(Agilent,美国)，TSQQuantumDiscovery三重四级杆串联质谱仪,配备电喷雾电源(ESI源)及Xcalibar1.4软件(Thermo,美国)，Vortex-Genie2微型涡旋混合仪，MilliQ-water纯水系统(Milli-pore,美国)，MS204S电子天平(MettlerToledo公司)，HN-132型氮吹仪，NMR核磁仪(Bruker,德国)，
1.2试剂
丹参素钠(SodiumDanshensu),纯度≥98％，甲醇(色谱级，Merck,德国),盐酸、甲酸、乙酸乙酯均为分析纯。
1.3实验动物
SPF级Wistar雌雄大鼠10只，体质量(300±10)g,购于北京维通利华动物中心(动物合格证号：SCXK(京)2012-0001)。大鼠实验前12h禁食不禁水。
2方法
2.1色谱及质谱条件
Hypersolgolden色谱柱(150mm×2.1mm,3μm),流动相：甲醇-0.2％甲酸水(15:85)，体积流量：0.2mL/min,柱温：30℃。质谱采用ESI负离子扫描方式进行监测，ESI源电压为3KV，毛细管温度为350℃，鞘气(N2)体积流量为25.0arb,辅助气(N2)流量为10.0arb，碰撞气为1.5mTorr,碰撞能为20ev；扫描方式为FullScan和Product扫描，扫描时间为0.5s。
2.2样品处理方法
取尿样300μL,加入100μL盐酸(2mol/L)涡旋混合30s后再加入3mL乙酸乙酯，涡旋3min,离心(4500r.min-1)10min,取上清液于40℃水浴下N2吹干，残渣用流动相溶解，高速离心3min(12000r.min-1)，取上清液进样进行分析。
2.3提取回收率
取低、中、高三个浓度丹参素标准品进行提取回收率实验，操作步骤按2.2，测得提取回收率为(70.65±4.12)％。
2.4样品采集
取Wistar大鼠10只，♀♂兼用，体重为(300±10)g，分成两组，置于大鼠代谢笼中，分别按(50mg/kg)剂量iv和ig给予丹参素钠，收集6h的尿样，将收集的尿样进行离心出去残渣，冰箱中冷冻保存，待分析和制备分离使用。
2.5代谢产物的制备
将收集的尿样加盐酸溶液(2mol/L)调pH至3，加入3倍量得乙酸乙酯进行液液萃取，提取两次，合并提取液，将提取液用旋转蒸发仪挥干，将得到的产物用流动相复溶后利用制备液相进行制备分离得到丹参素在大鼠尿液中的代谢产物，将得到的代谢产物进行核磁分析。
3结果
3.1尿液样品总离子流(TIC)
空白大鼠尿样、灌胃给药大鼠尿样、静脉注射给药大鼠尿样总离子流图见图1-3。通过与空白尿样的TIC图(1)比较在ig给药大鼠尿样TIC图(2)中发现准分子离子m/z为197、m/z211、m/z277、m/z213、m/z254的离子，初步推断m/z197为丹参素原型(M0)，m/z277为单硫酸化代谢产物(M1)，m/z213为但单羟基化代谢产物[2](M2)，m/z211为单甲基化代谢产物(M3、M4、M5)，m/z254为单甘氨酸代谢产物(M6)，详细信息见表一。iv给药组大鼠尿样总离子流图中除M5没有检测到，其它的代谢产物同灌胃给药相同，各产物与给药量的质量百分比分别为(M0)56.03％、(M1)0.41％、(M2)0.27％、(M3)15.03％、(M4)0.64％、(M5)0.67％、(M6)0.25％，6个产物之和与给药量质量百分比为73.3％，其中(M0)、(M3)的比例非常高，是丹参素在大鼠体内经尿液排泄的主要产物。
表一、Ⅱ相代谢反应类型
ig:灌胃；iv：静脉；+：有；—：无；
3.2核磁共振(NMR)鉴定M3化学结构
通过收集尿液制备代谢产物的方法得到了代谢产物M3，将制备得到的代谢产物M3将进行NMR核磁分析[4,5]，根据1H-NMR、13C-NMR、COSY、DEPT135、HMBC、HSQC等谱信号，并参考文献，最终确定代谢产物M3的结构为3位甲基化-丹参素，结构如下，
3.3其它代谢产物化学结构和代谢途径推测
为了对M4、M5结构进行进一步的确认，对M3、M4、M5进行二级质谱扫描分析。M3和M4的主要碎片离子均m/z193[M-H-H2O]-,m/z134[M-H-H2O-CO2-CH3]-,m/z178[M-H-H2O-CH3]-，M5主要碎片离子m/z165[M-H-H2O-CO]-,m/z134[M-H-H2O-CO2-CH3]-，根据M3化学结构推测M4、M5的化学结构，推测M2为单羟基化反应代谢物，M6为单甘氨酸化反应代谢物，M1m/z为277，推测是单硫酸酯结合物[3]，由于酯化反应醇为亲核试剂，丹参素分子中的醇羟基受邻位羰基碳的吸电子作用影响，亲核性很弱，其活泼性低于酚羟基，不易发生酯化反应，根据相关文献[6]推测丹参素的代谢途径如下：
3讨论
丹参素在大鼠体内主要以Ⅱ相代谢反应为主，发生了单甲基化结合反应、单硫酸结合反应、单甘氨酸结合反应和单羟基化反应，其中以单甲基化结合反应为主要代谢反应，其代谢产物中尤以M3的含量最高，与丹参素给药量的质量百分比达到了15.03％，丹参素通过尿液以原型的形式排泄的量也高达56.03％，非常值得关注。
长期以来，P450酶被认为是参与外源性化合物代谢最主要的代谢酶。因此，大部分的代谢研究均集中于P450酶所催化的Ⅰ相代谢反应。近年来，Ⅱ相代谢酶在外源性化合物代谢中的贡献越来越引起人们的关注，许多药物并不经过Ⅰ相代谢酶代谢而是直接通过Ⅱ相代谢酶代谢，对于代谢酶的研究也有助于对潜在药物相互作用进行预测。本文研究表明丹参素主要通过Ⅱ相代谢酶进行代谢，大鼠尿液中总的Ⅱ相代谢产物量占给药量的73.3％，剩余的部分可能存在于其它组织器官和排泄物中，还可以进一步考察查胆汁、血液和粪便中丹参素代谢和排泄情况。
实验二、3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)乳酸抗冠脉结扎急性心肌梗塞作用
实验材料
1.受试物及试剂
3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)乳酸，丹参素由天士力研究院提供。0.9％氯化钠注射液：规格：500mL，南京小营药业集团有限公司，批号：2012051205。水合氯醛：A.R，国药集团化学试剂有限公司，批号：20121211。红四氮唑(TTC)，国药集团化学试剂公司，批号：F20040308。肌酸激酶(CK)测定试剂盒，批号：20130917；乳酸脱氢酶(LDH)测定试剂盒，批号：20130919；丙二醛(MDA)测定试剂盒，批号：20130919；超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒，批号：20130918；肌酸激酶同工酶(CK-MB)测定试剂盒，批号：20130922，均由南京建成生物工程研究所提供。
2.主要仪器
HX-300呼吸机：成都泰盟科技有限公司。ECG-6511心电图机：上海光电医用电子仪器有限公司。HH-2数显恒温水浴锅：国华电器有限公司产品。BS224s型电子天平：北京赛多利斯仪器系统有限公司产品。BS110s型电子天平：北京赛多利斯仪器系统有限公司产品。
3.实验动物
SD大鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物合格证号：SCXK(京)2007-0001
实验方法及结果
1.剂量设计：
3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)乳酸(HMPLA)剂量：15mg/kg、30mg/kg。丹参素30mg/kg。
2.实验方法
取清洁级雄性SD大鼠，按体重随机分组，分别为假手术组(蒸馏水)，模型组(蒸馏水)，丹参素组，HMPLA低组，HMPLA高组，每组10只。各组大鼠每天尾静脉给药一次，连续给药7天。于末次给药后0.5h，腹腔注射水合氯醛300mg/kg麻醉，仰位固定，手术切口部位先后用碘酒和酒精消毒，之后在第三、四根肋骨开胸，并进行人工呼吸，暴露心脏，用医用无损伤缝合针5/0结扎冠脉左前降支，迅速关闭胸腔并常规消毒，手术操作过程不超过30s，术后继续人工呼吸1～2min，肌注(i.m)20万单位青霉素预防感染。手术开始前5min、结扎后0s、1min、5min、30min、1h、2h分别记录标准II导联心电图，考察心电图J点变化。
试验结束后，取血后立即取出心脏，用生理盐水洗去血液，剪去心房及心底部血管，称心室重量，将心室沿房室沟平均切成5片放入1％TTC溶液内，在37℃恒温水浴染色5min，取出后分离未染色部分(即梗塞部分)并称重计算其占整个心室重量的百分率(心肌梗塞百分率)，并与缺血模型组进行组间t检验。计算梗塞百分率公式如下：梗塞百分率(％)＝苍白区重量/(心室重量)×100全血采用2000rpm速度离心25min分离出血清，按试剂盒方法测定血清肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)。结果见表1、表2、表3。
表1.3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)乳酸对冠脉结扎所致心肌梗塞大鼠J点变化(mv)的影响
*P<0.05，造模后各时间点与造模前进行自身前后比较；#P<0.05，与模型组比较，&P<0.05，与丹参素比较。
由表1可见，各组大鼠冠脉结扎手术后心电图J点显著高于手术前(P<0.05)，说明造模成功。与模型组比较，术后5min丹参素、3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)乳酸低、高剂量均能能显著抑制J点的抬高(P<0.05)，且3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)乳酸高剂量组与丹参素组比较具有统计学显著性差异(P<0.05)。
表2.(4-羟基-3-甲氧基苯基)乳酸对大鼠冠脉结扎所致心肌梗塞的影响
| 组别 | 剂量(mg/kg) | 梗塞率(％) |
| 假手术组 | 0 | |
| 模型组 | 38.2±5.2* | |
| 丹参素组 | 30 | 25.3±6.5*# |
| HMPLA低 | 15 | 22.2±5.3*# |
| HMPLA高 | 30 | 12.4±3.6*#& |
*P<0.05，与假手术组比较；#P<0.05，与模型组比较；&P<0.05，与丹参素组比较。
由表2可见，模型组及各给药组心肌梗塞率均显著高于假手术组(P<0.05)，表明造模成功。与模型组相比，丹参素、3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)乳酸低、高组均能显著降低心肌梗塞率(P<0.05)，且3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)乳酸高剂量组与丹参素比较具有统计学显著性差异(P<0.05)。
表3.3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)乳酸对冠脉结扎所致心肌梗塞大鼠血液生化指标的影响
*P<0.05，，与假手术组比较；#P<0.05，与模型组比较；
由表3可见，模型组血清MDA、LDH、CK、CK-MB水平显著高于假手术组(P<0.05)，而SOD活力显著低于假手术组(P<0.05)，表明造模成功。与模型组相比，丹参素、3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)乳酸低、3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)乳酸高可显著降低心肌缺血大鼠血清MDA及LDH含量(P<0.05)；丹参素、3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)乳酸高可显著升高心肌缺血大鼠血清SOD活性(P<0.05)；丹参素、3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)乳酸低、3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)乳酸高可显著降低心肌缺血大鼠血清CK、CK-MB的活力(P<0.05)。
实验三、3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)乳酸对大鼠实验性急性心肌缺血的保护作用研究
实验材料
1.受试物及试剂
垂体后叶素(Pit)注射液，南京新百药业有限公司生产，批号：121012：生理盐水，天津天安药业股份有限公司生产，规格500ml/瓶，批号：201209231。
2.主要仪器
MedLab八道生理记录仪：南京美易科技公司。
3.实验动物
SD大鼠，体重200±20g，雌雄兼用，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证：SCXK(京)2007-0001。饲养在动物饲养室中，室温20-25℃，照明时间12h，食用鼠专用饲料(北京科澳协力饲料有限公司生产)，饮用自来水。
实验方法
1.剂量设计
丹参素30mg/kg，3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)乳酸30mg/kg。
2.实验动物
2.1动物筛选
于正式实验前分别给大鼠尾静脉注射垂体后叶素(Pit)(IΜ/kg)，描记正常及注射后5min心电图，观察J点抬高、T波异常的情况，将未注射前就出现异常心电图者以及对Pit不敏感者剔除。
2.2动物分组
入选大鼠随机分为3组，分别为模型组、丹参素组、(4-羟基-3-甲氧基苯基)乳酸组；
3.实验方法
SD大鼠，雌雄各半，随机分组，每组10只。模型对照组的大鼠每日灌胃等容积的生理盐水，给药组每日灌服不同样品的水悬液，全部动物均连续给药7天。末次给药后30min，麻醉大鼠，连接仪器，描记II导联正常心电图。由大鼠尾静脉恒速推注垂体后叶素(Pit)，推注时间控制在10s左右，描记给药后0s、15s、30s、45s及1min、5min、10min心电图变化，比较各组注射Pit前后以及给药组与模型对照组的差异，分析J点、T波的变化。结果用t检验进行数据统计分析。实验结果
1.对于J点的影响
结果表明，在本实验条件下，对于垂体后叶素造成的急性心肌缺血，3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)乳酸高剂量组在15s、30s、45s时，ECG的J点升高幅度小于模型对照组，且差异有统计学意义(P<0.05)。
表4对急性心肌缺血的中J点的变化的影响
*：P<0.05，与模型组进行比较。
结果表明，在本实验条件下，3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)乳酸高剂量组在15s、30s时，ECG的T波升高幅度小于模型组，且差异有统计学意义(p<0.05)。
表5对急性心肌缺血的中T波的变化的影响
*：P<0.05，与模型组进行比较。
实验结论
3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)乳酸高剂量组在15s、30s时，ECG的J点和T波升高幅度小于模型对照组，且差异有统计学意义(P<0.05)。结果表明：在本实验条件下，3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)乳酸(10mg/kg)有抗急性心肌缺血作用。
实验四、清除DPPH自由基(DPPH·)的作用
自由基具有直接或间接地发挥强氧化作用，广泛地参与机体的生理与病理过程。机体自由基过量时，能通过氧化作用损伤机体。丹酚酸类化合物是酚羟基的供体，具有抗氧化活性的结构基础。本药效实验采用1,1-二苯基-2-苦肼基(1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl，DPPH)自由基清除反应模型观察(4-羟基-3-甲氧基苯基)乳酸对自由基的清除效力。
1.试剂和仪器
丹参素、3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)乳酸，纯度95％以上，由天津天士力集团研究院提供。维生素C和DPPH均购于SIGMA公司。可见分光光度计V-1800，购于北京瑞利分析仪器公司
2.实验方法
反应总体积为2ml，取1ml不同浓度样品80％甲醇溶液加入100μMDPPH甲醇溶液中，混匀后在暗处25℃下反应20min，测定反应液在517nm处的吸光度。实验中采用维生素C作为阳性比较。自由基清除率采用下述公式计算：清除率(％)＝[(A0-A1)/A0]X100。A0为未加样品的阴性对照吸光值，A1为试样管吸光值
3.实验结果
表6.清除DPPH自由基(DPPH·)的作用
本实验对丹参素在不同浓度时DPPH自由基(DPPH·)的作用进行检测，并与同浓度的VC和丹参素进行比较。结果显示，它们对DPPH的清除能力由大到小依次为3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)乳酸、丹参素，维生素C，而且随浓度的增大而增强。在5μg/ml以上浓度时，3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)乳酸时清除能力显著强于丹参素和维生素C。
实验五、清除(02 -.)作用
1.试剂和仪器
丹参素、3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)乳酸，纯度95％以上，由天津天士力集团研究院提供。双氧水，国产试剂。维生素C购于Sigma公司。可见分光光度计V-1800，购于北京瑞利分析仪器公司。冷冻离心机：Z323K，德国。氮蓝四唑(NBT)，还原型辅酶(NADH)，吩嗪硫酸甲酯(PMS)均购自德国Appliehem公司。
2.实验方法
02 -.由NADH-PMS-NBT系统产生，采用比色法测定对02 -.的清除能力。02 -.可还原硝基四氮唑蓝(NBT)，反应式为：NBT+02 -.formazane+02。若受试物能与02 -.反应则可降低NBT的还原程度，用比色法测NBT含量的变化，可测定受试物清除02 -.的能力。用蒸馏水分别配制0.078mol/LNBT、0.468mol/LNADH和0.06mol/LPMS溶液。依次向各试管中加入1mLNBT、1mLNADH和1mL不同浓度的待测液，最后加入0.4mL的PMS启动反应，混匀后室温静置smin，于560nm处测定吸光度A1(0.4mL蒸馏水代替PMS调零)，同时测定用1mL蒸馏水代替待测液时的吸光度A0作为阴性对照，以Vc作阳性对照，根据下列公式计算清除率:
清除率(％)＝[(A0-A1)/A0]X100。A0为未加样品的阴性对照吸光值，A1为试样管吸光值。
3、实验结果
表7(4-羟基-3-甲氧基苯基)乳酸02 -.的清除能力
| 样品(mg/ml) | 0.025 | 0.050 | 0.100 | 0.200 | 0.400 |
| 维生素C | 36.8±1.9 | 58.2±2.8 | 72.6±3.2 | 73.6±1.9 | 84.2±2.3 |
| 丹参素 | 42.5±2.9 | 53.6±5.1 | 70.5±4.1 | 76.5±3.8 | 85.0±2.5 |
| HMPLA | 45.2±3.4 | 60.5±2.5 | 80.6±3.5 | 85.6±4.8 | 93.3±3.6 |
本实验对丹参素在不同浓度时对02 -.的清除作用进行检测，并与同浓度的VC和丹参素进行比较。结果见表所示，在所有被检测的浓度中丹参素对02 -.具有较强的清除作用，清除率一直高于VC和丹参素，呈较好的量效关系，它们都表现出一定的浓度依赖性。
五、结论
1、结论：本发明通过以丹参素作为对照药的四个药效学实验，证实3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)乳酸具有抗大鼠冠脉结扎急性心肌梗塞作用，可以显著性抑制心电图J点的抬高，显著性降低心肌梗塞率，且作用强于丹参素；对心肌梗塞大鼠血清中MDA、LDH、CK酶的增加有抑制作用，对血清SOD活力有显著提升作用；本发明的3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)乳酸对垂体后叶素引发的大鼠急性心肌缺血也有拮抗作用；另外本发明的(4-羟基-3-甲氧基苯基)乳酸还具有清除DPPH自由基(DPPH·)的作用和清除超氧阴离子自由基(02 -.)作用，且清除作用强于丹参素。可见，3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)乳酸在治疗心血管疾病方面优于丹参素
2、本发明3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)乳酸是丹参素代谢产物中含量比丹参素低，但是药效作用却比丹参素高，是非显而易见的。
附图说明：
图1为空白大鼠尿样总离子流图。
图2为灌胃给药大鼠尿样总离子流图。
图3为静脉注射给药大鼠尿样总离子流图。
图4为3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)乳酸得合成路线图。
具体实施方式：
以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。
实施例1：3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)乳酸的制备
(1)、3-甲氧基-4-苄氧基苯甲醛(2)的制备
3L的三口瓶中加入香草醛1(100g，0.658mol)、碳酸钾(110g，0.789mol)和1.0LDMF，室温搅拌，并慢慢向反应瓶中滴加溴化苄(112g，0.658mol)，继续室温搅拌16h。TLC检测显示香草醛反应完全后，停止搅拌。反应液中加入2L水，并用乙酸乙酯萃取(1.0L×3次)。合并有机相，经无水硫酸钠干燥后，浓缩出去乙酸乙酯得粗产物。粗产物经硅胶柱纯化后(PE/EtOAc＝5：1～2；1)得白色固体3-甲氧基-4-苄氧基苯甲醛(2)(140g，88.1％)。
(2)、3-(3-甲氧基-4-苄氧基苯基)环氧丙酸甲酯(3)的制备
3L三口瓶中加入甲醇钠(48g，0.9mol)和1L甲醇，冰浴冷却下搅拌。将3-甲氧基-4-苄氧基苯甲醛(2)(108g,0.446mol)和氯乙酸甲酯(68.1g，0.625mol)溶于500mlDCM中，并慢慢滴加至反应瓶中，控制反应温度低于5℃。滴加完毕后，撤去冰浴升至室温继续搅拌反应16h。TLC检测显示原料反应完全后，停止搅拌。过滤，滤饼经500ml甲醇淋洗得白色固体3-(3-甲氧基-4-苄氧基苯基)环氧丙酸甲酯(3)(105g，75.0％)。
(3)、3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)乳酸甲酯消旋体(4)及对映异构体(5)的制备
3-(3-甲氧基-4-苄氧基苯基)环氧丙酸甲酯(3)(105g，0.334mol)溶于1.0L甲醇中，分批加入5％Pd/C(18g)，氢气气氛下室温反应16h。TLC检测显示原料反应完全后，停止搅拌。反应液经硅藻土过滤，滤饼用1.0L甲醇淋洗。合并滤液，浓缩后得化合物4的粗产物，硅胶柱纯(PE/EtOAc＝3:1～1:1)后得黄色油状物3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)乳酸甲酯消旋体(4)(46g，60.9％)。
3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)乳酸甲酯消旋体(4)经超临界流体色谱进行手性分离，分别得到2R-3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)乳酸甲酯(5-R)(21.4g)和2S-3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)乳酸甲酯(5-S)(20.0g)。
(4)、3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)乳酸消旋体(6)的制备
3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)乳酸甲酯消旋体(4)(10.4g，0.045mol)溶于30ml2N氢氧化钠水溶液中，室温搅拌24h。TLC检测显示原料反应完全后，停止搅拌。用2N盐酸溶液中和至pH为4.0，乙酸乙酯萃取(200ml×2)，合并有机相，无水硫酸钠干燥，浓缩后得白色固体3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)乳酸消旋体(6)(6.0g，63％)。
(5)、2R-3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)乳酸(6-R)的制备
2R-3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)乳酸甲酯(5-R)(20.4g，0.0903mol)溶于50ml2N氢氧化钠水溶液中，室温搅拌24h。TLC检测显示原料反应完全后，停止搅拌。用2N盐酸溶液中和至pH为4.0，乙酸乙酯萃取(200ml×2)，合并有机相，无水硫酸钠干燥，浓缩后得白色固体2R-3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)乳酸(6-R)(13.7g，71.7％)。1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ2.60-2.66(1H,m),2.78-2.84(1H,m),3.70(3H,s),4.03-4.07(1H,m),6.55-6.63(2H,m),6.75(1H,d,J＝1.6Hz),8.69(1H,s)；[α]20＝19.00°±0.22°.
(6)、2S-3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)乳酸(6-S)的制备
2R-3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)乳酸甲酯(5-S)(20.0g，0.0885mol)溶于50ml2N氢氧化钠水溶液中，室温搅拌24h。TLC检测显示原料反应完全后，停止搅拌。用2N盐酸溶液中和至pH为4.0，乙酸乙酯萃取(200ml×2)，合并有机相，无水硫酸钠干燥，浓缩后得白色固体2S-3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)乳酸(6-S)(10.0g，53.3％)。1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ2.60-2.66(1H,m),2.78-2.83(1H,m),3.70(3H,s),4.03-4.07(1H,m),6.55-6.63(2H,m),6.75(1H,d,J＝1.6Hz),8.69(1H,s)；[α]20＝-20.93°±0.20°.
实施例2：3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)乳酸钠盐的制备
3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)乳酸10g，加入100ml乙醇，滴加饱和Na2CO3水溶液，使溶液的Ph值为6.8，溶液浑浊，低温放置后过滤，得3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)乳酸钠粗品，用乙醇重结晶后得3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)乳酸钠6.5g，收率58.5％。
实施例3：3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)乳酸钾盐的制备
3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)乳酸10g，加入100ml乙醇，滴加饱和K2CO3水溶液，使溶液的Ph值为6.8，溶液浑浊，低温放置后过滤，得3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)乳酸钾粗品，用乙醇重结晶后得3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)乳酸钾7.4g，收率63.2％。
实施例4：3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)乳酸钙盐的制备
3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)乳酸钠5g，加入50ml水，搅拌至完全溶解。慢慢滴加100ml饱和0.5mol/L的CaCl2水溶液，溶液中析出沉淀，滴加完毕后继续搅拌2h。低温放置后过滤，得3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)乳酸钙粗品，用乙醇重结晶后得3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)乳酸钙4.0g，收率81.2％。
实施例5：3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)乳酸及其碱金属/碱土金属盐片剂的制备
取3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)乳酸及其碱金属/碱土金属盐，按公知片剂制备方法，加入淀粉、糊精、微晶纤维素、硬脂酸镁等，混合制成湿粒，机器冲压成片，包衣得到包衣片，每片含3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)乳酸20mg。
实施例6：3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)乳酸及其碱金属/碱土金属盐胶囊剂的制备
将3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)乳酸及其碱金属/碱土金属盐、乳糖、羟丙纤维素过60目筛混匀，加入适量的聚山梨酯80，加入3％羟丙甲基纤维素水溶液，过20目筛。烘箱鼓风干燥，加入适量滑石粉，混合均匀，灌装胶囊，每粒含3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)乳酸20mg。
实施例7：3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)乳酸及其碱金属/碱土金属盐注射剂制备
将3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)乳酸及其碱金属/碱土金属盐100g溶于10L注射用普糖糖水溶液中，连续搅拌5小时使药物溶解，过滤、除菌，即得到本发明的含有3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)乳酸的注射液。
本发明在制药领域中的应用完全不局限于此，原料药还可以是权利要求1-2中所述任何一项化合物或其可药用酸加成盐。
本发明的药物剂型不完全局限于此，它可以制备成更多的剂型，如滴丸、缓释制剂、口服液等任何可服用的药物形式。
Claims (11)
1.3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)乳酸及其对映异构体或其药学上可接受的盐在制备治疗心血管疾病的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述，其中，3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)乳酸的对映异构体分别为2R-3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)乳酸和2S-3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)乳酸。
3.根据权利要求1所述的应用，其中，所述的心血管疾病为急性心肌梗塞。
4.根据权利要求1所述的应用，其中，所述的心血管疾病为急性心肌缺血。
5.根据权利要求1所述的应用，其中，所述的心血管疾病是由自由基过量导致的。
6.根据权利要求1所述的应用，其中，所述治疗心血管疾病是3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)乳酸及其对映异构体可清除过量自由基。
7.根据权利要求5所述的应用，其中，自由基为DPPH自由基。
8.根据权利要求6所述的应用，其中，所述清除DPPH自由基，清除率呈剂量依赖性增强。
9.根据权利要求6所述的应用，其中，所述自由基为超氧阴离子自由基。
10.根据权利要求8所述的应用，其中，所述清除超氧阴离子自由基，清除率呈剂量依赖性增强。
11.根据权利要求1所述的应用，其中，所述的3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)乳酸及其对映异构体药学上可接受的盐可以包括碱金属或碱土金属的盐。
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