CN105158241B - 富锌水稻快速筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种富锌水稻快速筛选方法，对待测水稻糙米和标准品水稻糙米分别进行如下步骤1)～4)；1)、糙米糊化；2)、在步骤1)的所得物中加入盐酸进行中和；3)、在步骤2)的所得物中加入三乙醇胺溶液、二乙基二硫代氨基甲酸钠溶液、盐酸羟胺溶液、乳化剂OP水溶液、Tris‑HCl缓冲溶液，摇匀后静止；4)、在步骤3)的所得物中加入5‑Br‑PADAP染色液，摇匀后静止，取上层清液；5)、将步骤4)所得待测水稻的糙米反应物和标准品水稻的糙米反应物进行颜色比较；当待测水稻糙米反应物的颜色比标准品水稻的糙米反应物颜色深时，则说明待测水稻糙米含锌量高于标准品水稻，颜色越深则锌含量越高。

Description

富锌水稻快速筛选方法

技术领域

本发明涉及水稻糙米含锌量的快速筛选方法，主要涉及领域为：农学、育种、水稻。

背景技术

水稻是世界第二大粮食作物，也是我国的主要粮食作物，其营养成分直接关系到消费者的身体健康，但目前生产上推广的许多水稻品种中一些人体所必需的重要矿质元素含量明显不足。中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所的调查结果表明，中国少儿的缺锌率高达60％，这些儿童每日锌摄入量不足世卫组织推荐量的一半。锌是人体必需的微量元素之一，在人体生长发育过程中起着极其重要的作用，对促进身体发育、增强食欲、增进智力和提高机体免疫力等有着重要作用，被消费者誉为“生命之花”和“智力之源”。缺锌会引起厌食、异食和贫血等症状，儿童缺锌会导致生长发育减缓、身体矮小、智力发育不良；孕妇缺锌，影响胎儿发育，可导致畸形和引起某些妇科并发症等。借助食品添加剂或药物等补充人体锌元素，存在投资大、费用高、覆盖面小等问题，不能在整体上解决锌营养不良的问题。通过常规育种、诱变育种等生物强化手段，可以有效提高水稻稻米中能为人体吸收利用的锌营养元素含量。但培育富含锌营养成分的水稻新品种(系)，需要测定大量种质资源、育种群体或诱变群体等单株的稻米锌含量，数量极大。因此，锌营养成分的测定方法和技术是筛选水稻富锌单株、提高稻米锌含量的最重要限制因子，重点及难点在于如何快速、经济和有效地鉴定稻米锌元素的含量。目前稻米中矿物质含量的测定方法一般都需要昂贵的仪器、以及繁琐的样品前处理程序；不但测定费用高，而且不能快速、高效地测定出稻米的锌含量，因而不适合于水稻育种过程中的大批量筛选。在水稻育种的早期选择过程中，并不需要很精确地确定水稻单株的稻米锌含量水平，一般只要获得单株间稻米锌含量的相对差异就可达到富锌单株筛选之目的。因此，提出稻米锌含量的简易快速筛选方法，用于水稻育种群体中的富锌单株快速鉴定，可以快速筛选出符合要求的富锌单株。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种富锌水稻快速筛选方法，该方法可为富锌水稻育种提供快速、经济和有效的单株筛选方法。

为解决富锌水稻育种的筛选技术问题，本发明提供一种富锌单株的快速筛选方法，所用的水稻材料可为不同类型的水稻品种(系)、育种单株和标准对照品种(系)；具体包括如下步骤：

对待测水稻糙米和标准品水稻糙米分别进行如下步骤1)～4)；

1)、糙米糊化：

取用水稻糙米4粒，加入质量浓度为4％NaOH溶液0.8～1.2mL，在恒温培养箱中于34.5～35.5℃糊化5.5～6.5h，取出后于振荡器上震荡1.5～2.5min，振荡频率为300～350r/min；

2)、在步骤1)的所得物中加入0.4～0.6mL浓度为2M的盐酸进行中和；

3)、在步骤2)的所得物中加入质量浓度为20％的三乙醇胺溶液0.4～0.6mL、质量浓度为0.1％的二乙基二硫代氨基甲酸钠(作为铜试剂)溶液0.9～1.1mL、质量浓度为0.05％的盐酸羟胺溶液0.9～1.1mL、质量浓度为20％的乳化剂OP水溶液0.4～0.6mL、pH＝9的Tris-HCl缓冲溶液(浓度为1M)1.4～1.6mL；振荡摇匀后静止8～12min；

4)、在步骤3)的所得物中加入0.6～0.9mL的2-(5-嗅-2-吡啶偶氮)-5-二乙氨基酚(5-Br-PADAP)染色液，振荡摇匀后静止8～20min；取上层清液，从而分别得待测水稻的糙米反应物和标准品水稻的糙米反应物；

该2-(5-嗅-2-吡啶偶氮)-5-二乙氨基酚(5-Br-PADAP)染色液是2-(5-嗅-2-吡啶偶氮)-5-二乙氨基酚(5-Br-PADAP)的质量浓度为0.1％的乙醇溶液；

5)、将步骤4)所得待测水稻的糙米反应物和标准品水稻的糙米反应物进行颜色比较；

当待测水稻糙米反应物的颜色比标准品水稻的糙米反应物颜色深时，则说明待测水稻糙米含锌量高于标准品水稻，颜色越深则锌含量越高。

用上述步骤和方法可以筛选出待测水稻材料中的富锌单株。

备注说明：糙米是稻谷脱去稻壳后，果皮、种皮、珠心层完好的稻米籽粒；浓度M即mol/L。

作为本发明水稻糙米含锌量的快速筛选方法的改进：

乳化剂OP为乳化剂OP-10。

作为本发明水稻糙米含锌量的快速筛选方法的进一步改进：

所述步骤1)中：NaOH溶液的用量为1mL，在恒温培养箱中于35℃糊化6h，取出后于振荡器上震荡2min；

所述步骤2)中盐酸的用量为0.5mL；

所述步骤3)中三乙醇胺溶液的用量为0.5mL，二乙基二硫代氨基甲酸钠溶液的用量为1mL，盐酸羟胺溶液的用量为1mL，乳化剂OP水溶液的用量为0.5mL；pH＝9的Tris-HCl缓冲溶液1.5mL；

所述步骤4)中5-Br-PADAP染色液的用量为0.6mL。

在本发明中：水稻糙米选择大小基本一致的成熟糙米(稻谷经常规的脱壳处理)；5-Br-PADAP染色液，需4℃避光保存；振荡频率一般均指300～350r/min。

本发明的富锌水稻快速筛选方法，上述4个步骤总计时间仅约为6.5小时，操作过程简单。

在本发明中：

1、本发明利用糙米进行检测，可用于富锌水稻材料或单株的大规模快速定性筛选。筛选时可选择大小基本一致的成熟糙米，其重量差别可忽略不计。

2、待测水稻糙米反应物与对照水稻糙米反应物的颜色深度对比，通过简单的目测即能获得，颜色越深其锌含量越高。

本发明主要用于富锌水稻的定性筛选，主要挑选染色色度“明显”深于对照的样品进行阐述，锌含量相近水稻样品染色后的色度相差不大。

3、本发明采用4％的NaOH对水稻糙米于35℃糊化6h，只需糙米粒就可以定性地筛选出锌含量较高的水稻品系。与传统的米粉测定方法相比较，本发明可为育种筛选提供一个更加简单、快速、准确的低成本富锌水稻筛选方法。

4、本发明对微量元素的掩蔽剂组合进行了实验，去除了柠檬酸铵、偏磷酸钠等对锌元素显色有一定影响的掩蔽剂，及氟化钠等剧毒物质，从而确定了掩蔽剂组合为：1mL质量浓度为0.1％的铜试剂(二乙基二硫代氨基甲酸钠)、质量浓度为20％的三乙醇胺溶液0.5mL、质量浓度为0.05％的盐酸羟胺溶液1mL。

5、本发明通过对比试验确定：0.5mL乳化剂OP水溶液作为表面活性剂，1.5mL pH＝9的Tris-HCl作为缓冲溶液，5-Br-PADAP染色液的用量为0.6mL时，显色灵敏且稳定。

本发明提出的5-Br-PADAP染色法不用磨粉，只需糙米就可以定性筛选出锌含量较高的水稻品种(系)或单株，一天内可以完成大量样品的筛选。与传统的米粉测定方法相比较，本发明可为育种工作者提供一个更为简单、快速、经济、有效的富锌水稻单株筛选方法。

下面以普通水稻品系浙农934、高锌含量水稻品系富锌3号以及对照品种嘉育293为例，阐述本发明的检测过程和具体步骤，并进行各品种(系)间锌含量高低的定性比较。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为水稻浙农934(普通水稻品系)、富锌3号(高锌含量水稻品系)与嘉育293(对照)的糙米染色比较图。

图2为显色剂用量对吸光度的影响图。

图3为缓冲液用量对吸光度的影响(pH＝9)。

图4为缓冲液pH对吸光度的影响图。

图5为乳化剂OP用量对吸光度的影响图。

图6为不同锌含量水稻品种(系)的糙米染色比较图。

具体实施方式

备注说明：

以下实施例中用到的水稻对照品种嘉育293为浙江省嘉兴市农科院以YD4-4与嘉籼293-T8杂交，于1994年选育而成的中熟早籼品种。

以下实施例中用到的胜泰1号是广东省农科院水稻所以超高产品种胜优2号为母本与泰国优质软米品种泰引1号杂交育成的优质、超高产抗病新品种。

以下实施例中用到的浙农934、浙农35、富锌3号水稻品系为浙江大学农学院农学系育成的水稻新品系。

实施例1：以浙农934和富锌3号成熟水稻品系为待测材料、嘉育293品种作为对照；将待测水稻和标准品水稻脱壳后，分别获得相应的糙米；取大小基本一致的待测水稻糙米和标准品水稻糙米分别进行如下操作：

1.将4粒水稻糙米装入10mL玻璃试管中，然后加入质量浓度为4％的NaOH溶液1mL，在恒温培养箱中于35℃糊化6h，取出后于振荡器上震荡2min，振荡频率为300～350r/min。

2.在步骤1的所得物中加入0.5mL浓度为2M的盐酸进行中和。

3.在步骤2的所得物中加入质量浓度为20％的三乙醇胺溶液0.5mL、质量分数为0.1％的二乙基二硫代氨基甲酸钠(铜试剂)溶液1mL、质量分数为0.05％的盐酸羟胺溶液1mL、质量浓度为20％的乳化剂OP-10水溶液0.5mL；pH＝9的Tris-HCl缓冲溶液(浓度为1M)1.5mL；振荡摇匀后静止10min。

4.在步骤3的所得物中加入0.6mL质量浓度为0.1％的2-(5-嗅-2-吡啶偶氮)-5-二乙氨基酚(5-Br-PADAP)染色液，振荡摇匀后静止20min。

该5-Br-PADAP染色液是5-Br-PADAP的质量浓度为0.1％的乙醇溶液；

备注说明：静止后会出现分层，未溶解的部分沉淀下来，本发明对上层的清液进行颜色比较。即，以上层的清液作为待测水稻的糙米反应物和标准品水稻的糙米反应物。

5.将步骤4所得的待测水稻的糙米反应物和标准品水稻的糙米反应物进行颜色的比较。

高锌含量水稻的待测糙米反应物颜色明显深于标准品水稻糙米的反应物颜色，如图1所示。待测水稻富锌3号糙米反应物的颜色明显比标准品水稻糙米的反应物颜色要深；普通品系浙农934糙米反应物的颜色则明显比标准品水稻糙米的反应物颜色要浅。在彩色照片下，浙农934反应物颜色为浅红棕色，嘉育293反应物颜色为红棕色，富锌3号反应物颜色为深红棕色。

备注说明：

利用ICP-MS方法进行浙农934、富锌3号和对照嘉育293水稻样品锌含量的精确定量测定，结果显示富锌3号水稻品系的含锌量为35.87mg/kg，明显高于对照嘉育293的含锌量(25.56mg/kg)；而浙农934水稻品系的含锌量为20.45mg/kg，明显低于对照嘉育293。

根据以上结论能证明：本发明的快速筛选方法的结果可以应用到稻米锌含量的快速筛选实践。

对比实验1：将上述实施例1测定步骤中的Tris-HCl缓冲溶液改用不同的pH、用量。

结果表明；实验研究了不同的缓冲液用量及pH值对吸光度的影响，结果如图3、4所示。缓冲液pH为9，用量在1.5mL时，标准溶液显色的吸光度最大。因此，本发明选用pH为9的缓冲液1.5mL。

对比实验2：显色剂的用量会影响吸光度的大小，设置了7个梯度(0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9mL)的5-Br-PADAP乙醇溶液用量，研究了对吸光度的影响。

实验表明；当0.1％的5-Br-PADAP乙醇溶液用量在0.6-0.9mL时，吸光度稳定，且达到最大值(如图2所示)。

对比实验3：乳化剂OP的用量会影响吸光度的大小，将上述实施例1测定步骤中的乳化剂OP改用不同的含量，研究了对吸光度的影响。

实验表明；当20％的乳化剂OP用量在0.5mL时，吸光度稳定，且达到最大值(如图5所示)。

备注说明：由于锌标准溶液与5-Br-PADAP乙醇溶液反应后在可见分光光度计波长555nm处的吸光度达到最大值，吸光度的大小反映了颜色的深浅及锌含量的高低，不同锌含量之间吸光度差距越大，表明在掩蔽剂存在下，上述水稻糙米中的锌与5-Br-PADAP乙醇溶液颜色越灵敏，不同锌含量稻米反应物颜色差距越大，即越容易通过简单的目测分辨稻米间锌含量差距。

实施例2：不同锌含量的水稻品种(系)与对照嘉育293糙米的反应物颜色对比验证试验。

按照实施例1所述方法进行检查，不同水稻品种(系)的糙米(浙农934、浙农35、嘉育293、胜泰1号、富锌3号)锌含量的染色比较图结果如图6所示。结果表明，浙农934、浙农35、嘉育293、胜泰1号、富锌3号的颜色依次加深。在彩色图中，浙农934反应物颜色为浅红棕色，浙农35反应物颜色为较浅红棕色，嘉育293反应物颜色为红棕色，胜泰1号反应物颜色为较深红棕色，富锌3号反应物颜色为深红棕色。

结果显示：糙米的反应物颜色深浅与米粉锌含量高低成正比，颜色越深其锌含量越高。

备注说明：

利用ICP-MS方法精确测定浙农934、浙农35、富锌3号、嘉育293、胜泰1号等水稻样品的锌含量，分别为20.45、22.58、25.56、31.23、35.87mg/kg。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (1)

1.富锌水稻快速筛选方法，其特征是包括如下步骤：

对待测水稻糙米和标准品水稻糙米分别进行如下步骤1)～4)；

1)、糙米糊化：

取用水稻糙米4粒，加入质量浓度为4％NaOH溶液1mL，在恒温培养箱中于35℃糊化6h，取出后于振荡器上震荡2min，振荡频率为300～350r/min；

2)、在步骤1)的所得物中加入0.5mL浓度为2M的盐酸进行中和；

3)、在步骤2)的所得物中加入质量浓度为20％的三乙醇胺溶液0.5mL、质量浓度为0.1％的二乙基二硫代氨基甲酸钠溶液1mL、质量浓度为0.05％的盐酸羟胺溶液1mL、质量浓度为20％的乳化剂OP水溶液0.5mL、pH＝9的Tris-HCl缓冲溶液1.5mL；振荡摇匀后静止8～12min；

乳化剂OP为乳化剂OP-10；

4)、在步骤3)的所得物中加入0.6mL的2-(5-嗅-2-吡啶偶氮)-5-二乙氨基酚染色液，振荡摇匀后静止8～20min；取上层清液，从而分别得待测水稻的糙米反应物和标准品水稻的糙米反应物；

该2-(5-嗅-2-吡啶偶氮)-5-二乙氨基酚染色液是2-(5-嗅-2-吡啶偶氮)-5-二乙氨基酚的质量浓度为0.1％的乙醇溶液；

5)、将步骤4)所得待测水稻的糙米反应物和标准品水稻的糙米反应物进行颜色比较；

当待测水稻糙米反应物的颜色比标准品水稻的糙米反应物颜色深时，则说明待测水稻糙米含锌量高于标准品水稻，颜色越深则锌含量越高。