CN105223191A - 富钙水稻快速筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种富钙水稻快速筛选方法，包括如下步骤：对待测水稻糙米和标准品水稻糙米分别进行如下步骤：糙米糊化，在糊化物中加入盐酸进行中和，再加入三乙醇胺溶液、8-羟基喹啉-5-磺酸、pH＝8的Tris-HCl缓冲溶液、偶氮胂Ⅲ染色液，定容，振荡摇匀后静止；取上层清液，从而分别得到待测水稻的糙米反应物和标准品水稻的糙米反应物；当待测水稻糙米反应物的颜色深于标准品水稻的糙米反应物颜色时，则说明待测水稻糙米含钙量高于标准品水稻，颜色越深则钙含量越高；反之，当待测水稻糙米反应物的颜色浅于标准品水稻的糙米反应物颜色时，则说明待测水稻糙米含钙量低于标准品水稻，颜色越浅则钙含量越低。

Description

富钙水稻快速筛选方法

技术领域

本发明涉及水稻糙米含钙量的快速筛选方法，主要涉及领域为：农学、育种、水稻。

背景技术

水稻是世界第二大粮食作物，也是我国的主要粮食作物，其营养成分直接关系到消费者的身体健康，但目前推广种植的许多水稻品种中一些人体所必需的重要矿质元素含量明显不足。钙是人体必需矿质元素之一，其含量不但关系人体的骨骼生长，而且与细胞神经兴奋、神经系统传导、血液凝固、肌肉收缩等生理活动密切相关。钙营养缺乏是影响人类健康的国际性重大问题之一。在中国，钙是居民营养素缺乏排在第一位的元素，全国人均每天摄入量，仅有RDA(Remotedataaccess每日建议营养素摄取量)要求量的50.63％，缺钙人数高达12亿。借助食品添加剂或药物等可以补充人体钙元素，但存在投资大、费用高、覆盖面小等问题，不能在整体上解决钙营养不良的问题。通过常规育种、诱变育种等生物强化手段，能够有效提高水稻稻米中能为人体吸收利用的钙营养元素的含量。但在培育富含钙营养成分的水稻新品种(系)的过程中，需要测定大量种质资源、育种群体或诱变群体等单株的稻米钙含量，数量极大。因此，钙营养成分的测定方法和技术是筛选水稻富钙单株、提高稻米钙含量的最重要限制因子，重点及难点在于如何快速、经济和有效地鉴定稻米钙元素的含量。目前稻米中矿物质含量的测定方法一般都需要昂贵的仪器、以及繁琐的样品前处理程序；不但测定费用高，而且不能快速、高效地测定出稻米的钙含量，因而不适合于水稻育种过程中的大批量筛选。在水稻育种的早期选择过程中，并不需要精确确定水稻单株的稻米钙含量水平，一般只要获得单株间稻米钙含量的相对差异就可达到富钙单株筛选之目的。因此，提出稻米钙含量的简易快速筛选方法，用于水稻育种群体中的富钙单株快速鉴定，可以快速筛选出符合要求的富钙单株。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种富钙水稻快速筛选方法，该方法可为富钙水稻育种提供快速、经济和有效的单株筛选方法。

为解决富钙水稻育种的筛选技术问题，本发明提供一种富钙单株的快速筛选方法，所用的水稻材料可为不同类型的水稻品种(系)、育种单株和标准对照品种(系)。具体包括如下步骤：

对待测水稻糙米和标准品水稻糙米分别进行如下步骤1)～4)：

1)糙米糊化：

取用水稻糙米8粒，加入质量浓度为4％NaOH溶液0.8～1.2mL，在恒温培养箱中于34.5～35.5℃糊化5.5～6.5h，取出后于振荡器上振荡1.5～2.5min，振荡频率为300～350r/min；

2)在步骤1)的所得物中加入0.4～0.6mL浓度为2M的盐酸进行中和；

3)在步骤2)的所得物中加入质量浓度为20％的三乙醇胺溶液0.4～0.6mL、10mmol/L的8-羟基喹啉-5-磺酸0.9～1.1mL、pH＝8的Tris-HCl缓冲溶液1.4～1.6mL；

4)在步骤3)的所得物中加入1.6～2.0mL质量浓度为0.06％的偶氮胂Ⅲ染色液，定容(利用蒸馏水进行定容)到15mL，振荡摇匀后静止8～12min；取上层清液，从而分别得到待测水稻的糙米反应物和标准品水稻的糙米反应物；

所述质量浓度为0.06％的偶氮胂Ⅲ染色液可用5％的碳酸钠溶液配制而成；

5)将步骤4)所得待测水稻的糙米反应物和标准品水稻的糙米反应物进行颜色比较；

当待测水稻糙米反应物的颜色比标准品水稻的糙米反应物颜色深时，说明待测水稻糙米含钙量高于标准品水稻，颜色越深则钙含量越高；反之，当待测水稻糙米反应物的颜色浅于标准品水稻的糙米反应物颜色时，则说明待测水稻糙米含钙量低于标准品水稻，颜色越浅则钙含量越低。

用上述步骤和方法可以筛选出待测水稻材料中的富钙单株。

备注说明：糙米是稻谷脱去稻壳后，果皮、种皮、珠心层完好的稻米籽粒；浓度M即mol/L。

本发明水稻糙米含钙量快速筛选方法的改进：

所述步骤1)中：NaOH溶液的用量为1mL，在恒温培养箱中于35℃糊化6h后，取出在振荡器上振荡2min。

所述步骤2)中盐酸的用量为0.5mL。

所述步骤3)中三乙醇胺溶液的用量为0.5mL，10mmol/L的8-羟基喹啉-5-磺酸用量为1mL，pH＝8的Tris-HCl缓冲溶液的用量为1.5mL。

所述步骤4)中质量浓度为0.06％的偶氮胂Ⅲ染色液的用量为1.8mL。

在本发明中，水稻糙米选择大小基本一致的成熟糙米(稻谷经常规的脱壳处理)；偶氮胂Ⅲ染色液，需4℃避光保存；振荡频率一般均指300～350r/min。

本发明的富钙水稻快速筛选方法，上述4个步骤总计时间仅约为6.5小时，操作过程简单。

在本发明中：

1.利用糙米进行检测，可用于富钙水稻材料或单株的大规模快速定性筛选。筛选时可选择大小基本一致的成熟糙米，其重量差别可忽略不计。

2.待测水稻糙米反应物与对照水稻糙米反应物的颜色深度对比，通过简单的目测即能进行，颜色越深其钙含量越高。

本发明用于富钙水稻的定性筛选，主要挑选染色色度“明显”深于对照的样品进行阐述，钙含量相近的水稻样品染色后其色度相差不大。

3.本发明采用4％NaOH对水稻糙米于35℃糊化6h，只需糙米粒就可以定性地筛选出钙含量较高的水稻材料。与传统的米粉测定方法相比较，本发明可为育种筛选提供一个更加简单、快速、准确的低成本富钙水稻筛选方法。

4.本发明对微量元素的掩蔽剂组合进行了实验，最终确定掩蔽剂组合为：0.5mL20％三乙醇胺溶液、1mL10mmol/L的8-羟基喹啉-5-磺酸。

5.本发明通过对比试验确定：选用1.5mLpH＝8的Tris-HCl缓冲溶液时，显色灵敏且稳定。

本发明提出的偶氮胂Ⅲ染色法不用磨粉，只需糙米就可以定性筛选出钙含量较高的水稻品种(系)或单株，一天内可以完成大量样品的筛选。与传统的米粉测定方法相比较，本发明可为育种工作者提供一个更为简单、快速、经济、有效的富钙水稻单株筛选方法。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1是浙温1号(普通)水稻、金中1号(高钙)水稻与嘉育293(对照)的染色比较图。

图2是缓冲液用量对吸光度的影响。

图3是显色剂用量对吸光度的影响图。

图4是不同钙含量水稻品种(系)的糙米染色比较。

具体实施方式

下面以普通水稻品系浙温1号、高钙含量水稻品系金中1号以及对照品种嘉育293为例，阐述本发明的检测过程和具体步骤，并进行多个水稻品种(系)间钙含量高低的定性比较。

备注说明：

以下实施例中用到的水稻对照品种嘉育293为浙江省嘉兴市农科院以YD4-4为母本与父本嘉籼293-T8杂交，于1994年选育而成的中熟早籼品种。

以下实施例中用到的舟7、浙辐11水稻品种分别为浙江省舟山农科院和浙江大学核农所育成的水稻新品系。

以下实施例中用到的浙温1号、金中1号等水稻品系为浙江大学农学系育成的水稻新品系。

实施例1：以浙温1号成熟水稻品系和金中1号成熟水稻品系为待测材料、嘉育293品种作为对照；将待测水稻和标准品水稻材料脱壳后，分别获得相应的糙米；取大小基本一致的待测水稻糙米和标准品水稻糙米分别进行如下操作：

1.将8粒水稻糙米装入25mL玻璃试管中，然后加入质量浓度为4％的NaOH溶液1mL，在恒温培养箱中于35℃糊化6h，取出后于振荡器上振荡2min，振荡频率为300～350r/min。

2.在步骤1的所得物中加入0.5mL浓度为2M的盐酸进行中和。

3.在步骤2的所得物中加入质量浓度为20％的三乙醇胺溶液0.5mL、10mmol/L的8-羟基喹啉-5-磺酸1mL、pH＝8Tris-HCl缓冲溶液1.5mL。

4.在步骤3的所得物中加入1.8mL的质量浓度为0.06％的偶氮胂Ⅲ染色液，蒸馏水定容到15mL，振荡摇匀后静止10min。

上述质量浓度为0.06％的偶氮胂Ⅲ染色液用质量浓度5％的碳酸钠溶液配制而成。

备注说明：静止后出现分层，未溶解的部分会沉淀下来，本发明对上层的清液进行颜色比较。即，取上层清液，从而分别得待测水稻的糙米反应物和标准品水稻的糙米反应物。

5.将步骤4所得的待测水稻糙米反应物和标准品水稻糙米反应物进行颜色比较。

高钙含量水稻的待测糙米反应物颜色会明显深于标准品水稻糙米的反应物颜色，如图1所示。高钙含量水稻品系金中1号糙米反应物的颜色明显深于标准品水稻(嘉育293)糙米的反应物颜色，而普通品系浙温1号糙米反应物的颜色则明显比标准品水稻糙米的反应物颜色要浅。在彩色照片中，浙温1号反应物颜色为浅紫色，嘉育293反应物颜色为紫色，金中1号反应物颜色为深紫色。

备注说明：

利用ICP-MS方法进行浙温1号、金中1号和对照嘉育293水稻样品钙含量的精确定量测定，结果显示金中1号水稻品系的含钙量为55.0mg/kg，明显高于对照嘉育293的含钙量(37.9mg/kg)；而浙温1号水稻品种的含钙量为26.0mg/kg，明显低于对照嘉育293。

根据以上结论能证明：本发明的快速筛选方法的结果可以用于稻米钙含量的快速筛选。

对比实验1：将上述实施例1所对应的测定步骤中的Tris-HCl缓冲溶液改用不同的用量。

结果表明；实验研究了不同的缓冲液用量对吸光度的影响，结果如图2所示，缓冲液用量在1.5mL时，实验体系的pH值达到8，并且此时的吸光度最大。因此，本实验确定最佳缓冲液用量为1.5mL。

对比实验2：显色剂的用量会影响吸光度的大小，如图3所示。当0.06％的偶氮胂Ⅲ染色液用量在1.8mL时，吸光度稳定，且达到最大值，本实验选用1.8mL偶氮胂Ⅲ染色液。

备注说明：由于钙标准溶液与偶氮胂Ⅲ溶液反应后反应液由紫红色变为蓝色，在可见分光光度计波长650nm处的吸光度达到最大值，吸光度的大小反映了钙含量的高低。不同钙含量之间吸光度差距越大，表明在掩蔽剂存在下，上述水稻糙米中的钙与偶氮胂Ⅲ溶液颜色越灵敏，不同钙含量稻米反应物颜色差距越大，即越容易通过简单的目测分辨出稻米间的钙含量差异。

实施例2：不同钙含量的水稻品种(系)与对照嘉育293糙米的反应物颜色对比验证试验。

按照实施例1所述方法进行检查，对不同水稻品种(系)的糙米(浙温1号、浙辐11、嘉育293、金中1号、舟7)钙含量的染色比较结果如图4所示。结果表明，浙温1号、浙辐11、嘉育293、舟7、金中1号的颜色依次加深。在彩色图中，浙温1号与浙辐11反应物颜色为浅紫色，嘉育293反应物颜色为紫色，舟7和金中1号反应物颜色为深紫色。

结果显示：糙米的反应物颜色深浅与米粉钙含量高低成正比，颜色越深其钙含量越高。

备注说明：利用ICP-MS方法精确测定浙温1号、浙辐11、嘉育293、舟7、金中1号等水稻样品的钙含量，分别为26.0、32.0、37.9、44.7和55.0mg/kg。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (2)

1.富钙水稻快速筛选方法，其特征是包括如下步骤：

对待测水稻糙米和标准品水稻糙米分别进行如下步骤1)～4)；

1)糙米糊化：

取用水稻糙米8粒，加入质量浓度为4％NaOH溶液0.8～1.2mL，在恒温培养箱中于34.5～35.5℃糊化5.5～6.5h，取出后于振荡器上振荡1.5～2.5min，振荡频率为300～350r/min；

2)在步骤1)的所得物中加入0.4～0.6mL浓度为2M的盐酸进行中和；

3)在步骤2)的所得物中加入质量浓度为20％的三乙醇胺溶液0.4～0.6mL、10mmol/L的8-羟基喹啉-5-磺酸0.9～1.1mL、pH＝8的Tris-HCl缓冲溶液1.4～1.6mL；

4)在步骤3)的所得物中加入1.6～2.0mL质量浓度为0.06％的偶氮胂Ⅲ染色液，定容到15mL，振荡摇匀后静止8～12min；取上层清液，从而分别得到待测水稻的糙米反应物和标准品水稻的糙米反应物；

所述质量浓度为0.06％的偶氮胂Ⅲ染色液用质量浓度5％的碳酸钠溶液配制而成；

5)将步骤4)所得待测水稻的糙米反应物和标准品水稻的糙米反应物进行颜色比较；

当待测水稻糙米反应物的颜色深于标准品水稻的糙米反应物颜色时，则说明待测水稻糙米含钙量高于标准品水稻，颜色越深则钙含量越高；反之，当待测水稻糙米反应物的颜色浅于标准品水稻的糙米反应物颜色时，则说明待测水稻糙米含钙量低于标准品水稻，颜色越浅则钙含量越低。

2.根据权利要求1所述的富钙水稻快速筛选方法，其特征是：

所述步骤1)中：NaOH溶液的用量为1mL，在恒温培养箱中于35℃糊化6h，取出后于振荡器上振荡2min。

所述步骤2)中盐酸的用量为0.5mL；

所述步骤3)中三乙醇胺溶液的用量为0.5mL，10mmol/L的8-羟基喹啉-5-磺酸的用量为1mL，pH＝8的Tris-HCl缓冲溶液的用量为1.5mL；

所述步骤4)中质量浓度为0.06％的偶氮胂Ⅲ染色液的用量为1.8mL。