CN105223142A - 富镁水稻快速筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种富镁水稻快速筛选方法，对待测水稻糙米和标准品水稻糙米分别进行如下步骤：糙米糊化；在糊化物中加入盐酸进行中和；再加入三乙醇胺溶液、聚乙烯醇溶液、盐酸羟胺溶液、达旦黄染色液、氢氧化钠溶液，定容，振荡摇匀后静止8～12min；取上层清液，从而分别得到待测水稻的糙米反应物和标准品水稻的糙米反应物；当待测水稻糙米反应物的颜色深于标准品水稻的糙米反应物颜色时，则说明待测水稻糙米含镁量高于标准品水稻，颜色越深则镁含量越高；当待测水稻糙米反应物的颜色浅于标准品水稻的糙米反应物颜色时，则说明待测水稻糙米含镁量低于标准品水稻，颜色越浅则镁含量越低。

Description

富镁水稻快速筛选方法

技术领域

本发明涉及水稻糙米含镁量的快速筛选方法，主要涉及领域为：农学、育种、水稻。

背景技术

水稻是世界第二大粮食作物，也是我国的主要粮食作物，其营养成分直接关系到消费者的身体健康，但目前生产上推广的许多水稻品种中一些人体所必需的重要矿质元素含量明显不足。镁是维持人体生命活动的必需元素，具有调节神经和肌肉活动、增强耐久力等功能。此外，镁也是高血压、高胆固醇、高血糖的“克星”，有助于防治中风、冠心病和糖尿病。体内缺镁后会引起供应心脏血液和氧气的动脉痉挛，导致心脏骤停而突然死亡。此外，缺镁会导致体内淋巴细胞的活动能力明显下降，机体抵抗力降低，增加癌病的发病率。借助食品添加剂或药物等可以补充人体镁元素，但存在着投资大、费用高、覆盖面小等问题，不能在整体上解决镁营养不良的问题。通过常规育种、诱变育种等生物强化手段，能够有效提高水稻稻米中能为人体吸收利用的镁营养元素含量。培育富含镁营养成分的水稻新品种(系)，需要测定大量种质资源、育种群体或诱变群体的单株稻米镁含量，数量极大。因此，镁营养成分的测定方法和技术是筛选水稻富镁单株、提高稻米镁含量的最重要限制因子，重点及难点在于如何快速、经济和有效地鉴定稻米镁元素的含量。目前稻米中矿物质含量的测定方法一般都需要昂贵的仪器、以及繁琐的样品前处理程序；不但测定费用高，而且不能快速、高效地测定出稻米的镁含量，因而不适合水稻育种过程中的大批量筛选。在水稻育种的早期选择过程中，并不需要很精确地确定水稻单株的稻米镁含量水平，一般只要获得单株间稻米镁含量的相对差异就可达到富镁单株筛选之目的。因此，提出稻米镁含量的简易快速筛选方法，用于水稻育种群体中的富镁单株快速鉴定，可以快速筛选出符合要求的富镁单株。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种富镁水稻的快速筛选方法，该方法可为富镁水稻育种提供快速、经济和有效的单株筛选方法。

为解决富镁水稻育种的筛选技术问题，本发明提供一种富镁单株的快速筛选方法，所用的水稻材料可为不同类型的水稻品种(系)、育种单株和标准对照品种(系)。具体包括如下步骤：

对待测水稻糙米和标准品水稻糙米分别进行如下步骤1)～4)：

1)糙米糊化：

取用水稻糙米4粒，加入质量浓度为4％NaOH溶液0.8～1.2mL，在恒温培养箱中于34.5～35.5℃糊化5.5～6.5h，取出后于振荡器上振荡1.5～2.5min，振荡频率为300～350r/min；

2)在步骤1)的所得物中加入0.4～0.6mL浓度为2M的盐酸进行中和；

3)在步骤2)的所得物中加入质量浓度为20％的三乙醇胺溶液0.4～0.6mL、质量浓度为0.1％的聚乙烯醇溶液0.4～0.6mL、质量浓度为5％的盐酸羟胺溶液0.4～0.6mL、质量浓度为0.05％的达旦黄染色液0.4～0.6mL；

4)在步骤3)的所得物中加入0.9～1.1mL的4M的氢氧化钠溶液，定容(利用蒸馏水进行定容)到10mL，振荡摇匀后静止8～12min；取上层清液，从而分别得到待测水稻的糙米反应物和标准品水稻的糙米反应物；

5)将步骤4)所得待测水稻的糙米反应物和标准品水稻的糙米反应物进行颜色比较；

当待测水稻糙米反应物的颜色比标准品水稻的糙米反应物颜色深时，说明待测水稻糙米的含镁量高于标准品水稻，颜色越深则镁含量越高；

当待测水稻糙米反应物的颜色浅于标准品水稻的糙米反应物颜色时，则说明待测水稻糙米含镁量低于标准品水稻，颜色越浅则镁含量越低。

用上述步骤和方法可以筛选出待测水稻材料中的富镁单株。

备注说明：糙米是稻谷脱去稻壳后，果皮、种皮、珠心层完好的稻米籽粒；浓度M即mol/L。

本发明水稻糙米含镁量快速筛选方法的改进：

所述步骤1)中：NaOH溶液的用量为1mL，在恒温培养箱中于35℃糊化6h，取出后于振荡器上振荡2min。

所述步骤2)中盐酸的用量为0.5mL。

所述步骤3)中三乙醇胺溶液的用量为0.5mL，聚乙烯醇溶液的用量为0.5mL，盐酸羟胺溶液的用量为0.5mL，达旦黄染色液的用量为0.5mL。

所述步骤4)中4M的氢氧化钠溶液的用量为0.5mL。

在本发明中，水稻糙米选择大小基本一致的成熟糙米(稻谷经常规的脱壳处理)；达旦黄染色液，需4℃避光保存；振荡频率一般均指300～350r/min。

本发明的富镁水稻快速筛选方法，上述4个步骤总计时间仅约为6.5小时，操作过程简单。

在本发明中：

1.利用糙米进行检测，可用于富镁水稻材料或单株的大规模快速定性筛选。筛选时可选择大小基本一致的成熟糙米，其重量差别可忽略不计。

2.待测水稻糙米反应物与对照水稻糙米反应物的颜色深度对比，通过简单的目测即可进行，颜色越深其镁含量越高。

本发明用于富镁水稻的定性筛选，主要挑选染色色度“明显”深于对照的样品进行阐述，镁含量相近水稻样品染色后的色度相差不大。

3.本发明采用4％NaOH对水稻糙米于35℃糊化6h，只需糙米粒就可以定性地筛选出镁含量较高的水稻品系。与传统的米粉测定方法相比较，本发明可为育种筛选提供一个更加简单、快速、准确的低成本富镁水稻筛选方法。

4.本发明对微量元素的掩蔽剂组合进行了实验，最终确定的掩蔽剂组合为：0.5mL20％的三乙醇胺溶液、0.5mL质量浓度为0.1％的聚乙烯醇溶液、0.5mL质量浓度为5％的盐酸羟胺溶液。

5.本发明通过对比试验确定：1mL的4M的氢氧化钠溶液，显色灵敏且稳定。

本发明提出的达旦黄染色法不用磨粉，只需糙米就可以定性筛选出镁含量较高的水稻品种(系)或单株，一天内可以完成大量样品的筛选。与传统的米粉测定方法相比较，本发明可为育种工作者提供一个更为简单、快速、经济、有效的富镁水稻单株筛选方法。

下面以普通水稻品种胜泰1号、高镁含量水稻品系浙农35以及对照品种嘉育293为例，阐述本发明的检测过程和具体步骤，并进行多个水稻品种(系)间镁含量高低的定性比较。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为胜泰1号普通水稻品种、高镁含量水稻品系浙农35与对照嘉育293品种的染色比较图。

图2为氢氧化钠加入量对吸光度的影响图。

图3为显色剂用量对吸光度的影响图(pH＝9)。

图4为不同稻米品种镁含量的染色比较图。

具体实施方式

备注说明：

以下实施例中用到的水稻对照品种嘉育293为浙江省嘉兴市农科院以YD4-4为母本与父本嘉籼293-T8杂交，于1994年选育而成的中熟早籼品种。

以下实施例中用到的胜泰1号是广东省农科院水稻所以超高产品种胜优2号为母本与泰国优质软米品种泰引1号杂交育成的优质、超高产抗病新品种。

以下实施例中用到的竹云糯是浙江省杭州市农科所育成的籼型常规稻。

以下实施例中用到的浙农35、浙农37为浙江大学农学系育成的水稻新品系。

实施例1：以胜泰1号成熟水稻品种和浙农35成熟水稻品系为待测材料、嘉育293品种作为对照；将待测水稻和标准品水稻脱壳后，分别获得两者的糙米；取大小基本一致的待测水稻糙米和标准品水稻糙米分别进行如下操作：

1.将4粒水稻糙米装入25mL玻璃试管中，然后加入质量浓度为4％的NaOH溶液1mL，在恒温培养箱中于35℃糊化6h，取出后于振荡器上振荡2min，振荡频率为300～350r/min。

2.在步骤1的所得物中加入0.5mL浓度为2M的盐酸进行中和。

3.在步骤2的所得物中加入质量浓度为20％的三乙醇胺溶液0.5mL、质量浓度为0.1％的聚乙烯醇溶液0.5mL、质量浓度为5％的盐酸羟胺溶液0.5mL、质量浓度为0.05％的达旦黄染色液0.5mL。

4.在步骤3的所得物中加入1mL的4M的氢氧化钠溶液，蒸馏水定容到10mL，振荡摇匀后静止10min。

备注说明：静止后会出现分层，未溶解的部分沉淀下来，本发明对上层的清液进行颜色比较。即，取上层清液，从而分别得待测水稻的糙米反应物和标准品水稻的糙米反应物。

5.将步骤4所得的待测水稻糙米反应物和标准品水稻糙米反应物进行颜色的比较。

高镁含量水稻的待测糙米反应物颜色明显深于标准品水稻(嘉育293)糙米的反应物颜色，如图1所示。高镁含量水稻品系浙农35糙米反应物的颜色明显深于标准品水稻糙米的反应物颜色，而普通品系胜泰1号糙米反应物的颜色则明显比标准品水稻糙米的反应物颜色要浅。在彩色照片中，胜泰1号反应物颜色为浅红棕色，嘉育293反应物颜色为红棕色，浙农35反应物颜色为深红棕色。

备注说明：

利用ICP-MS方法进行胜泰1号、浙农35和对照嘉育293水稻样品镁含量的精确定量测定，结果显示浙农35水稻品系的含镁量为993.2mg/kg，明显高于对照嘉育293的含镁量(776.2mg/kg)；而胜泰1号水稻品种的含镁量为700.7mg/kg，明显低于对照嘉育293。

根据以上结论能证明：本发明的快速筛选方法的结果可以应用到稻米镁含量的快速筛选实践。

对比实验1：将上述实施例1测定步骤---步骤4)中的4M的氢氧化钠溶液改用不同的加入量。

实验研究了不同的氢氧化钠溶液对吸光度的影响，设置了8个梯度(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、1.5、2mL)，结果如图2所示，当反应体系加入0.5～1.0mLNaOH时，吸光度稳定，且达到最大值，本实验选用1mLNaOH。

对比实验2：显色剂的用量会影响吸光度的大小，如图3所示，当0.05％达旦黄溶液用量在0.3-0.6mL时，吸光度稳定，且达到最大值，本实验选用0.5mL达旦黄溶液。

备注说明：由于镁标准溶液与达旦黄溶液反应后在可见分光光度计波长550nm处的吸光度达到最大值，吸光度的大小反映了颜色的深浅及镁含量的高低。不同镁含量之间吸光度差距越大，表明在掩蔽剂存在下，上述水稻糙米中的镁与达旦黄溶液颜色越灵敏，不同镁含量稻米反应物颜色差距越大，即越容易通过简单的目测分辨稻米间镁含量差距。

实施例2：不同镁含量的水稻品种(系)与对照嘉育293糙米的反应物颜色对比验证试验。

按照实施例1所述方法进行检查，不同水稻品种(系)的糙米(胜泰1号、竹云糯、嘉育293、浙农35、浙农37)镁含量的染色比较结果如图4所示。结果表明，胜泰1号/竹云糯、嘉育293、浙农37/浙农35的颜色依次加深。在彩色图中，胜泰1号反应物颜色与竹云糯反应物颜色为浅红棕色，嘉育293反应物颜色为红棕色，浙农35反应物颜色与浙农37反应物颜色为深红棕色。

结果显示：糙米的反应物颜色深浅与米粉镁含量高低成正比，颜色越深其镁含量越高。

备注说明：

利用ICP-MS方法精确测定胜泰1号、竹云糯、嘉育293、浙农37、浙农35等水稻样品的镁含量，分别为700.7、702.5、776.2、966.4和993.2mg/kg。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (2)

1.富镁水稻快速筛选方法，其特征是包括如下步骤：

对待测水稻糙米和标准品水稻糙米分别进行如下步骤1)～4)；

1)糙米糊化：

取用水稻糙米4粒，加入质量浓度为4％NaOH溶液0.8～1.2mL，在恒温培养箱中于34.5～35.5℃糊化5.5～6.5h，取出后于振荡器上振荡1.5～2.5min，振荡频率为300～350r/min；

2)在步骤1)的所得物中加入0.4～0.6mL浓度为2M的盐酸进行中和；

3)在步骤2)的所得物中加入质量浓度为20％的三乙醇胺溶液0.4～0.6mL、质量浓度为0.1％的聚乙烯醇溶液0.4～0.6mL、质量浓度为5％的盐酸羟胺溶液0.4～0.6mL、质量浓度为0.05％的达旦黄染色液0.4～0.6mL；

4)在步骤3)的所得物中加入0.9～1.1mL的4M的氢氧化钠溶液，定容到10mL，振荡摇匀后静止8～12min；取上层清液，从而分别得到待测水稻的糙米反应物和标准品水稻的糙米反应物；

5)将步骤4)所得待测水稻的糙米反应物和标准品水稻的糙米反应物进行颜色比较；

当待测水稻糙米反应物的颜色深于标准品水稻的糙米反应物颜色时，则说明待测水稻糙米含镁量高于标准品水稻，颜色越深则镁含量越高；

当待测水稻糙米反应物的颜色浅于标准品水稻的糙米反应物颜色时，则说明待测水稻糙米含镁量低于标准品水稻，颜色越浅则镁含量越低。

2.根据权利要求1所述的富镁水稻快速筛选方法，其特征是：

所述步骤1)中：NaOH溶液的用量为1mL，在恒温培养箱中于35℃糊化6h，取出后于振荡器上振荡2min；

所述步骤2)中盐酸的用量为0.5mL；

所述步骤3)中三乙醇胺溶液的用量为0.5mL，聚乙烯醇溶液的用量为0.5mL，盐酸羟胺溶液的用量为0.5mL，达旦黄染色液的用量为0.5mL；

所述步骤4)中4M的氢氧化钠溶液的用量为0.5mL。