CN101011025B - 一种人工老化筛选耐储藏作物种质的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人工老化筛选耐储藏作物种质的方法，是将将种植栽培、收获条件一致，成熟度一致的对照品种子和待筛选的作物种子水分平衡至同一含水量，检测其发芽率；然后将对照品种子和待筛选的作物种质先后放到同一高温高湿的人工老化条件下人工老化；在检测对照品种子发芽率达到设定目标后，在达到对照品种老化时间后将待筛选作物种质从高温高湿的老化条件下取出；将取出的待筛选作物种质，浸种催芽，对正常出苗的植株进行加代扩繁，成熟后按单株收获，继续进行新的一轮筛选。本发明人工老化条件接近自然老化的外界条件，发芽结果与自然老化的发芽特征类似，可以大量从现有种质资源中筛选耐储藏作物种质，为研究种子衰老、陈化变质机理和遗传提供技术和方法，成本低廉。

Description

一种人工老化筛选耐储藏作物种质的方法

技术领域

本发明涉及一种作物耐储藏特性的快速鉴定筛选方法，该方法可以用于作物种子耐储藏特性的鉴定和筛选耐储藏基因型材料；具体是一种人工老化筛选耐储藏作物种质的方法。

背景技术

我国是人口大国，粮食安全在国民经济中占有举足轻重的地位。粮食安全不但包括粮食的安全生产，还包括粮食的安全储藏。我国主要的作物有水稻、玉米、花生、大豆、油菜等，这些作物的种子寿命差异很大。稻谷不耐储藏，在一般储藏条件下第二年就开始陈化变质；而作为我国面积第三、产量第二的粮食作物玉米，由于水分大，胚呼吸旺盛，胚部脂肪含量高，极易酸败变质；油料作物花生、大豆、油菜等寿命更短，一般储存超过一年的种子就失去种用价值。作物种子的衰老、劣变、陈化变质对种子生产、保存和农产品籽粒储藏带来很大的影响。为此国家储备库采用分散分批、定期推陈储新、轮流更新的方法，耗费了大量的人力、物力和财力。粮食陈化变质过程中，产生大量陈味，导致其食用性差，种子生活力差，发芽率下降等，给人们的生活和生产带来了不利的影响，也严重影响国家储备的能力。因此，加强粮食耐储藏性研究是二十一世纪我国农业发展的重要课题。

延长种子寿命、延缓农产品籽粒的陈化变质，长期以来主要通过工程技术来解决。主要有通风降温降水技术、自然低温储藏技术、机械低温储藏技术、气调储藏技术、化学储藏技术等。但这些都不能从根本上解决种子衰老和陈化变质问题。种子的衰老不但受外界储藏条件的影响还受品种自身遗传因素的作用。研究耐储藏机理，选育耐储藏品种是从根本上解决粮食的安全储藏问题。

耐储藏研究的现状

种子寿命和农产品籽粒的陈化变质是种子自身遗传特性和环境的共同作用结果，种子寿命的长短，不仅在作物间表现很大的差异，就是同一作物不同品种之间，差异也十分显著。种皮的结构和化学成分是受基因控制的遗传性状，并直接影响着种子的寿命和农产品籽粒的陈化变质。一般来说，种皮致密程度、色泽深浅、脂肪含量高低以及种胚的大小都会影响种子寿命和陈化变质。近年来的研究表明，种子的脂肪酶、脂质氧化酶同功酶等酶的活性也是影响种子寿命的重要因素。

关于影响种子寿命和陈化变质的机理，在水稻上有较多的研究，概括起来大致有胞壁、蛋白质变化说，认为米质变化的主要原因在于胞壁和淀粉粒外围蛋白质变化；直链和支链淀粉含量相对变化说；羰基化合物说；游离脂肪酶说；脱支酶说；疏基变化说等，以上学说是建立在大米储藏过程中组织结构和化学成份等方面的变化研究基础上。谷物化学分析表明稻谷储藏的营养以淀粉为主，淀粉含量占60％以上，脂肪含量仅占糙米的2.3％，但是，水稻脂肪的分布具有特殊性，主要分布在胚和糊粉层中，约占脂肪含量的85％。研究表明：水稻种子脂肪降解可能是导致稻谷陈化的最主要原因之一。

脂肪分解代谢过程中脂肪酶(Lipase)和脂肪氧化酶(lipoxygenase，LOX)是两个关键酶。脂肪酶是脂肪分解代谢中第一个参与反应的酶(一般被认为是限速酶)，它对脂肪的转化速率起着调控的作用。脂肪酶广泛分布于水稻种子的种皮、糊粉层和种胚中，其含量和活性均很低，在未萌发的水稻种子中难以检出脂肪酶酶活性。并且脂肪酶和储藏性脂肪在空间分布上由于细胞质膜的分隔而处于不同的区域。所以往往认为只有在细胞破损脂肪酶才能和脂肪接触反应。一旦稻谷中的脂肪和脂肪酶接触，就意味着由脂肪转化为游离脂肪酸的进程的开始；随着游离脂肪酸的增加，亚油酸等多元不饱和脂肪酸大大地激活了脂肪氧化酶的活性，使脂肪进一步氧化分解。

从水稻种子自身的遗传角度研究脂肪代谢关键酶工作始于九十年代，日本科学家铃木保宏发现：脂肪氧化酶广泛存在于谷物的种胚和果皮中，脂质降解是导致谷物贮藏期间品质变劣、产生陈味的根源。LOX促进氧元素与多元不饱和脂肪酸结合，形成氢过氧化物，进而转化成具有挥发性的气体化合物，引发谷物变味变质。脂肪氧化酶缺失可以有效阻断脂质氧化反应，减轻谷物氧化变质程度，不会因陈化变质作用降低谷物品质，并使储藏谷物保持清新气味。现已发现与脂质降解有关的3种脂肪氧化酶同功酶即LOX-1、LOX-2、LOX-3，其中以LOX-3为主，约占80％-90％。利用单克隆抗体技术从几万份水稻种质中筛选出LOX-3缺失的水稻种质材料DawDam，该种质来源于泰国，脂肪氧化酶缺失性状遗传由单隐性基因控制，种子LOX-3缺失不影响水稻生长发育。

耐储藏特性鉴定的主要技术方法和现状

研究作物种子衰老和陈化变质，特别是作物自身遗传控制的耐储藏机理，需要对现有的种质资源根据耐储藏特性进行筛选，对育种中间材料进行耐储藏特性鉴定。耐储藏种质的鉴定和筛选方法是研究耐储藏机理的重要技术平台。

围绕耐储藏种质的筛选已经取得一些重要进展。当前耐储藏种质的筛选方法主要有两类，

一、基于种子衰老的脂肪酶、脂肪氧化酶同功酶酶活性学说的检测方法

1、单克隆抗体技术：利用Elisa检测植物种子(如水稻种子的胚组织)与已知抗原的抗体的结合反应，用抗原抗体的结合体的变化速率代表Lox的活性。优点是灵敏度高，特异性好，缺点是成本较高；

2、分子标记技术：即通过查找和应用作物品种间储藏特性的自然遗传变异对个体、性状和基因在遗传差异的基础上进行鉴别。分子标记技术的优点是针对性强、稳定性好，不随遗传背景改变而改变，缺点是：有时会出现假阳性，需要一定的试验条件、成本也较高。

3、生化检测技术：脂肪氧化酶同功酶检测技术(已申请专利)、脂肪酶检测技术(已申请专利)等。上述两种方法优点是简便快速、成本低，不需要特殊的设备，但脂肪氧化酶、脂肪酶的生化检测受酶液浊度的影响较大，灵敏度不高，只能用于耐储藏材料的粗筛，而且不能把分离群体中耐储藏与不耐储藏的种子区分开并保存下来供下一季种植，这就需要一种能对分离世代进行单粒筛选的技术。

二、实仓实验：

实仓实验是在自然储存或种质库保存条件下，随着种子储藏时间的逐渐延长，其内部生理生化功能逐渐退化、劣变，从而引起种子活力下降，反映的是种子自然的生理生化变化过程。实仓实验是可靠的传统方法，但该方法历时长，难以在品种改良中应用进行耐储藏种质的筛选。

人工加速老化是通过人为创造的逆境高温高湿或者化学试剂如甲醇或者热水处理加速种子的老化，高活力种子经老化处理后仍能正常发芽，低活力种子则产生不正常幼苗或全部死亡。人工加速老化是一种重要的种子活力测定方法。

发明内容

本发明是利用高温、高湿的人工老化技术使农作物种子加速老化、劣变，使种子的储藏性状快速显露出来以利于筛选耐储藏种质。

本发明是通过以下技术方案实现的。

一种人工老化筛选耐储藏作物种质的方法，其特征在于筛选包括以下步骤：

(1)、将种植栽培、收获条件一致，成熟度一致的对照品种子和待筛选的作物种质水分平衡至同一含水量；

(2)、检测对照品种子和待筛选的作物种质的初始发芽率；

(3)、将对照品种子和待筛选作物种质一先一后放入高温高湿的老化条件下进行人工老化；

(4)、检测对照品种子发芽率达到设定目标后，在达到对照品种老化时间后将待筛选作物种质从高温高湿的老化条件下取出；

(5)、将取出的待筛选作物种质，浸种催芽，对正常出苗的植株进行加代扩繁，成熟后按单株收获，继续进行新的一轮筛选。

所述的作物是指水稻、小麦、玉米、花生、大豆、油菜。

所述的人工老化是指指在可控制条件的人工气候室、培养箱中，利用高温、高湿的人工条件加速种子老化，比较种子耐储藏特性的差异；所述的高温高湿老化条件是：水稻为温度42℃±1℃、湿度85％，不同作物有一定的区别。

所述的人工老化筛选耐储藏作物种质的方法，其特征在于所述的作物是指籼稻、粳稻，第(1)步中的含水量：籼稻12.5-13％左右，粳稻13-13.5％。

所述的人工老化筛选耐储藏作物种质的方法，其特征在于所述的第(3)步是指将对照品种子和待筛选作物种质相隔5-7天放入高温高湿的老化条件下进行人工老化；所述的第(4)步是指检测对照品种子发芽率达到设定目标1-15％后，延迟5-7天后将待筛选作物种质从老化条件下取出。

所述的对照品种子为耐储藏作物种子或不耐储藏作物种子。

所述的人工老化筛选耐储藏作物种质的方法，用于鉴定筛选作物品种间耐储藏特性，选择杂种分离后代、诱变后代耐储藏的材料和突变体。

研究表明人工加速老化作为自然老化过程的人工模拟，能较好地与自然老化吻合，人工老化与自然老化在种子耐储性研究中有类同的效果，并且人工老化克服了自然老化所需时间较长的不足，因而人工老化技术可以代替自然老化应用于耐储藏种质的鉴定、筛选和育种改良。

人工老化的优点在于：

(1)、缩短了储藏时间；

(2)、直接从分离群体中得到耐储藏的单粒并能繁衍下去；

(3)、方法简便，所控制条件接近自然老化的外界条件，发芽结果与自然老化的发芽特征类似，可以大量进行，成本低廉。

本发明的用途：

1、从现有种质资源中筛选耐储藏作物种质，为研究种子衰老、陈化变质机理和遗传提供技术和方法。

2、研究种子衰老和陈化变质以及选育耐储藏专用型品种过程中鉴定育种材料的耐储藏特性。

3、在耐储藏和不耐储藏分离群体中利用该方法提供一定的选择压力，筛选出耐储藏特性强的个体材料。

4、评价作物籽粒的储藏特性，为农产品安全储藏提供参考。

具体实施方式

实施例一：

研究表明，Lox-1，Lox-2缺失品种皖鉴2090(初始水分12.5％，发芽率99％)经过42个月的自然储藏，仍然有84％的发芽率，证明其是一个极耐储藏的品种。在T＝42℃，湿度RH＝85％人工老化条件下，一般常规品种，如早籼14，(初始水分12.5％，发芽率96％)老化20天种子发芽率全部丧失，皖鉴2090(初始水分12.5％左右，发芽率96％左右)约有50％的发芽率，老化24天皖鉴2090发芽率大约在10％。可以以皖鉴2090为耐储藏对照品种，以早籼14为一般对照品种，把待筛选水稻种质和对照品种放入同一条件进行人工老化，以发芽率为评判标准，筛选耐储藏专用型水稻种质。

以水稻为实施例，具体过程如下：

1、种子含水量平衡：将同季、同一田块收获、成熟度一致的皖鉴2090(对照)、早籼14(对照)和待筛选的水稻种质(如皖鉴2090/早籼14)杂交F2种子水分平衡至同一含水量12.5％左右，每个品种(材料)平均分成若干份，每份100克，装入纱网袋中。

2、测定种子初始发芽率；按GB/T3543.4-1995方法检测发芽率。

3、对照种子提前进行人工老化：把对照种子皖鉴2090、早籼14放入条件为：温度42℃±1℃、湿度85％的人工智能气候箱老化，及时补充加湿器里的水分。提前时间为计数作物种子发芽率所需要的时间，例如：水稻为7天。

4、再将待筛选的水稻种质杂交F2种子放入人工智能气候箱。

5、定期取样调查老化种子存活情况：在本试验条件下(温度42℃±1℃、湿度85％)12天后(水稻种子一般在12天以后成活率开始明显下降)开始定期取样，检测对照种质皖鉴2090和早籼14的发芽率，检测至两个对照品种子中种子发芽率和耐储藏的皖鉴2090相当或者达到待筛选水稻种质的选择目标(如待筛选水稻种质种子成活率目标设定为5％或10％)时从人工智能气候箱取出，第7天后，再将待筛选水稻种质杂交F2种子从人工智能气候箱取出。

6、对经人工老化的待筛选水稻种质杂交F2种子浸种、催芽，对正常出苗的植株进行加代扩繁，成熟后按单株收获，继续进行新的一轮筛选。

实施例二：从诱变分离群体中筛选耐储藏种质

1、待筛选的经物理、化学诱变的水稻分离群体如早籼14M2代种子和诱变的亲本种子早籼14(同季、同一田块收获、成熟度一致)，将种子水分平衡至同一含水量12.5％左右，平均分成若干份，每份100克，装入纱网袋中。按GB/T3543.4-1995方法检测发芽率。

2、早籼14作为对照较早籼14M2代种子提前7天放入条件为：温度42℃±1℃、湿度85％的人工智能气候箱老化，及时补充加湿器里的水分。

3、在老化12天以后定期(每天或每隔一天)取对照早籼14种子，测定发芽率。在所取对照种子成活率达到1-5％(根据选择目标确定)时，7天后将待筛选水稻种质早籼14M2代种子从人工智能气候箱取出。

4、将取出的待筛选水稻M2种子中成活的种子，催芽，对正常出苗的植株进行加代扩繁，成熟后按单株收获，继续进行新的一轮筛选。

Claims (4)

1.一种人工老化筛选耐储藏作物种质的方法，其特征在于筛选包括以下步骤：

(1)、将种植栽培和收获条件一致，成熟度一取的对照品种子和待筛选的水稻种质水分平衡至同一含水量；对照品种子为耐储藏作物种子或不耐储藏作物种子；

(2)、检测对照品种子和待筛选的作物种质的初始发芽率；

(3)、将对照品种子和待筛选的作物种质一先一后放入高温高湿的老化条件下进行人工老化；人工老化是指在可控制条件的人工气候室、培养箱中，利用高温、高湿的人工条件加速种子老化，比较种子耐储藏特性的差异；所述的高温高湿老化条件是：水稻为温度42℃±1℃、湿度85％；

(4)、检测对照品种子发芽率达到设定目标后，在达到对照品种老化时间后将待筛选作物种质从高温高湿的老化条件下取出；

(5)、将取出的待筛选作物种质，浸种催芽，对正常出苗的植株进行加代扩繁，成熟后按单株收获，继续进行新的一轮筛选；

所述的作物是水稻、小麦、玉米、花生、大豆、油菜。

2.根据权利要求1所述的人工老化筛选耐储藏作物种质的方法，其特征在于所述的作物是指籼稻、粳稻，第(1)步中的含水量：籼稻12.5-13％，粳稻13-13.5％。

3.根据权利要求1所述的人工老化筛选耐储藏作物种质的方法，其特征在于所述的第(3)步是指将对照品种子和待筛选作物种质相隔5-7天放入高温高湿的老化条件下进行人工老化；所述的第(4)步是指检测对照品种子发芽率达到设定目标1-15％后，延迟5-7天后将待筛选作物品种从老化条件下取出。

4.权利要求1-3之一所述的人工老化筛选耐储藏作物种质的方法，用于鉴定筛选作物品种耐储藏特性，选择杂种分离后代、诱变后代的耐储藏的材料和突变体。