CN105148267B - 一种鱼用白细胞介素佐剂的制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了SEQ ID NO：3所示蛋白质或SEQ ID NO：4所示蛋白质在制备鱼用疫苗的佐剂中的用途。本发明还公开了一种复合佐剂，它含有SEQ ID NO：3所示蛋白质和SEQ ID NO：4所示蛋白质，以及药学上可接受的载体。本发明重组IL‑1β1和IL‑1β2可以有效提高鱼用疫苗的免疫原性，显著提高特异性抗体，可以作为鱼用疫苗的佐剂使用，二者联合使用时的效果明显优于同等剂量下二者单独使用(p<0.05)，可以制备成为复合佐剂，临床应用前景良好。

Description

一种鱼用白细胞介素佐剂的制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种鱼用白细胞介素佐剂的制备方法和用途。

背景技术

随着现代水产养殖集约化程度的日益提高，养殖鱼类暴发的疾病所造成的损失越来越严重，鱼类病害已经成为阻碍水产养殖业健康发展的重要因素。预防鱼类病害的传统方法(如化学药品、抗生物等)增强了病原微生物的抗药性，并给环境带来了药物残留等新的问题；自从1942年Duff等科学家成功研制了杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)的全菌灭活疫苗后，鱼类疫苗逐渐成为鱼类疾病更为理想的预防手段。最近几十年来，随着鱼用疫苗的发展和生产应用，与鱼用疫苗紧密相关的鱼用免疫佐剂者也越来越收到重视。

免疫佐剂简称佐剂(Adjuvant)，是指与抗原同时或预先使用，能非特异性地改变或增强机体对抗原的特异性免疫应答，增强相应抗原的免疫原性或改变免疫反应的一类物质。佐剂在动物免疫过程中，主要是通过非特异性的物理或化学方式与抗原结合，增强机体免疫系统对抗原的免疫应答反应能力，其作用主要包括：一是增强免疫系统的高效性和持久性，提高动物机体保护能力；二是减少抗原的使用剂量和免疫次数。

“佐剂(Adjuvant)”一词来源于拉丁文Adjuvare。1925年，免疫学家Gaston Ramon等最早研究发现木薯粉、淀粉或琼脂等物质具有增强疫苗免疫效应的作用。1926年，Glenny等最先将铝盐作为白喉外毒素疫苗的佐剂使用，为以后铝佐剂(如氢氧化铝、磷酸铝等)在疫苗上的广泛应用奠定了基础。1951年，Freund等将石蜡液体与羊毛脂以适当比例混合后制作的油包水型弗氏佐剂，已成为目前国内外实验室经典的免疫佐剂。随着鱼类疫苗研究的发展，鱼用合成肽疫苗、亚单位疫苗、DNA疫苗等新型疫苗也逐渐发展起来，与传统疫苗相比，新型疫苗中的抗原纯度较高导致抗原免疫原性下降，诱导机体产生的免疫应答相对较弱，因此就需要配合佐剂使用提高疫苗的免疫原性,以获得更加稳定、长久的免疫保护效应。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种新的免疫佐剂。

本发明首先提供了SEQ ID NO：3所示蛋白质或SEQ ID NO：4所示蛋白质在制备鱼用疫苗的佐剂中的用途。

本发明还提供了SEQ ID NO：3所示蛋白质和SEQ ID NO：4所示蛋白质在制备复合佐剂中的用途。

优选地，所述复合佐剂中，SEQ ID NO：3所示蛋白质和SEQ ID NO：4所示蛋白质的重量配比为1：1。

本发明还提供了一种复合佐剂，它含有SEQ ID NO：3所示蛋白质和SEQ ID NO：4所示蛋白质，以及药学上可接受的载体。

优选地，SEQ ID NO：3所示蛋白质和SEQ ID NO：4所示蛋白质的重量配比为1：1。

本发明还提供了复合佐剂在制备疫苗中的用途。

本发明还提供了一种预防鱼类链球菌病的疫苗，它包括预防鱼类链球菌病的免疫原以及前述复合佐剂。

优选地，所述预防鱼类链球菌病的免疫原的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。

优选地，SEQ ID NO：5所示蛋白质与前述的复合佐剂的重量比为1:1。

本发明还提供了氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示的蛋白。

本发明还提供了氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示的蛋白在制备预防鱼类链球菌病的疫苗中的用途。

本发明还提供了一种预防鱼类链球菌病的疫苗，它包括氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示的蛋白，以及药物学上可接受的辅料。

优选地，所述辅料是SEQ ID NO：3所示蛋白质和/或SEQ ID NO：4所示蛋白质。进一步优选地，所述所述辅料是SEQ ID NO：3所示蛋白质和SEQ ID NO：4所示蛋白质时，二者的重量配比为1:1。

重组IL-1β1的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)：

MADKDLLMLERYFDSDCGFDSDDMDFDKLDCSDPLAMSGRCDLHKGLRIEVTKEPLSMRHVANVVIALQRLKLTQNIQSTEFTDQELFNVFIDNVIEESMVINLKCTESKSYSLQDKVVRCTICDKSKRALVQKEKLPLLLAFTLKGGNKENKAWFNLSAYTPPNCTENKNGQPVCLGIVKTNLFLSCTLENETPFLGLEEVKDKERLKSIQENDGMERFLFFRNGTGDSLNTFESVKYPGWFITTSKDDDKPVQMCKQQSSHLQLFTLHDETVVSQNEM

编码IL-1β1开放阅读框

SEQ ID NO：1：

ATGGCTGACAAAGATTTGTTAATGCTGGAAAGGTACTTTGACAGTGACTGTGGATTTGATTCAGATGACATGGATTTTGACAAGCTGGACTGCTCTGATCCTTTGGCCATGAGCGGCAGATGTGACCTGCACAAAGGACTCCGCATCGAGGTCACCAAGGAGCCTCTTAGTATGCGCCATGTTGCTAATGTTGTAATCGCTTTGCAGAGGCTGAAACTCACTCAAAATATTCAGTCCACGGAGTTCACCGACCAGGAGCTTTTCAATGTCTTCATTGATAATGTGATTGAAGAGAGCATGGTGATCAATTTGAAGTGCACTGAATCCAAGAGTTACAGCCTGCAAGACAAGGTTGTGCGGTGCACTATATGTGACAAGTCTAAAAGGGCTTTGGTGCAGAAGGAAAAGCTTCCTCTTCTGCTGGCTTTTACTCTGAAGGGTGGAAATAAGGAGAATAAAGCATGGTTCAACCTCTCGGCCTACACTCCACCAAACTGCACAGAAAACAAAAATGGCCAGCCTGTATGTTTGGGGATTGTAAAGACCAATCTCTTTCTCTCATGCACACTGGAGAATGAAACTCCTTTTCTAGGCTTAGAGGAGGTAAAAGACAAAGAGAGACTGAAGTCCATCCAGGAGAATGATGGCATGGAACGCTTCCTTTTCTTCAGAAACGGCACTGGTGACTCCCTTAACACCTTCGAGTCAGTTAAATACCCGGGCTGGTTCATCACCACCTCAAAGGATGACGATAAGCCAGTGCAAACGTGTAAGCAGCAATCCAGTCACCTCCAGCTGTTCACACTCCATGATGAGACTGTAGTCTCTCAGAATGAGATGTGA

重组IL-1β2的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)：

MDDKDLLTLERSFDSDCGFDSDAMDFDELDCSDPLAMSGRCDLHEGLRIEVTKEPLSMRQVANVVIALQRLKLTQNIQSTEFTDQELFNVFIENVIEESMVINLKCTESKSYSLQDKVVRCTICDKSKRALVQREKLPILLAFTLKGGNKDNKAWFNLSAYTPPNCTENTKGQPVCLGIVKTNLFLSCTLENETPFLGLEEVKDKERLKSIQENDGMERFLFFRNGTGDSLNTFESVKYPGWFITTSKEDYKPVQMCKQQSSHLQLFTLHDETVVSQNEI.

IL-1β2开放阅读框：

SEQ ID NO：2：

ATGGATGACAAAGATTTGTTAACGCTGGAAAGGTCCTTTGACAGTGACTGTGGATTTGATTCAGATGCCATGGATTTTGATGAGCTGGACTGCTCTGATCCATTGGCCATGAGTGGCAGATGTGACCTGCACGAAGGACTCCGCATCGAGGTCACCAAGGAGCCTCTTAGTATGCGCCAAGTTGCTAATGTTGTAATCGCTCTGCAGAGGCTGAAACTCACTCAAAATATTCAGTCCACGGAGTTCACCGACCAGGAGCTTTTCAATGTCTTCATTGAGAATGTGATTGAAGAGAGCATGGTGATCAATTTGAAGTGCACTGAATCCAAGAGTTACAGCCTGCAAGACAAGGTTGTGCGGTGCACTATATGTGACAAGTCTAAAAGGGCTTTGGTGCAGAGGGAAAAGCTTCCTATTCTGCTGGCCTTTACTCTGAAGGGTGGAAACAAGGATAATAAAGCATGGTTCAACCTCTCGGCCTACACTCCACCAAACTGCACAGAAAACACGAAAGGACAGCCTGTATGTTTGGGGATTGTAAAGACCAATCTCTTTCTCTCATGCACACTGGAGAATGAAACTCCTTTTCTTGGCTTAGAGGAGGTAAAAGACAAAGAGAGACTGAAGTCCATCCAGGAGAATGATGGCATGGAACGCTTCCTTTTCTTCAGAAACGGCACTGGTGACTCCCTTAACACCTTCGAGTCGGTCAAATACCCGGGCTGGTTCATCACCACCTCAAAGGAGGACTATAAGCCAGTGCAAATGTGTAAGCAGCAATCCAGTCACCTCCAGCTGTTCACACTCCATGATGAGACTGTAGTCTCTCAGAATGAGATCTGA

SEQ ID NO：5所示的蛋白的氨基酸序列：

ETVVSAQPSSGEASVEPVSGEEQKPLIDYVDPSNVKDIWEKVGRGKGSLIAVIDAGIEQTHDMLNLADSSDLKYSSKEDLEAKKKEHGIERGKWVNHKLVFYHDYNEGVDSPKSGDEDLYHGTHVAGIAAGSMVNNKKNELLMEGIAPDAQLMFMRVGKTSLIPEKENLYALAIEDAVALGATAINMSFGSVGKASDELKESVHRALNAAREKGVALIVAAGNDFAMGGYPVKPLAKNPDFGVIGTPATTDDVLTIAAYVAPEDISEVFTVASHNDSKELAVTVASAFPKGRQLDFIDIGKGLEDDYLDKDVKGKIVIVDYEAVITSKATAELAQSKGVAGVLVHHRDYKRPLLPLNYHGDLPMGFISLEDFDYLKSLDKATLTFNHKKKLVSVPGGRQMANFSSWGLSADGHMKPDLSAPGYELYSPSLKNTYEPMSGTSSASPHAMGIVSLVQEHVKKKYPQYSPQEQLLLVKNILMSTADPIISPVDNTYYSPRLQGAGAIDAKKAIATDVYLTGSNGLSKINLGDISNTFDLKVRLHNMGNQTKQFKYYATVLADKAENGKMTLRPQKLYTTEQEEVILAPNEEKEVSLTIDISNFDASLIAQMINGYFVDGFVHFDSNDGIKNVLSIPFL

本发明重组IL-1β1和IL-1β2可以有效提高鱼用疫苗的免疫原性，显著提高特异性抗体，可以作为鱼用疫苗的佐剂使用，二者联合使用时的效果明显优于同等剂量下二者单独使用(p<0.05)，可以制备成为复合佐剂。

本发明SEQ ID NO：5所示蛋白质的免疫原性好，对机体的保护作用强，可以制成有效预防鱼类链球病菌的疫苗，临床应用前景良好。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1 PCR扩增结果。M，DNA marker DL2000；1，IL-1β1基因PCR扩增产物；2，IL-1β1基因PCR扩增产物；

图2重组表达质粒pET-32a(+)-IL-1β1/β2酶切鉴定。M，DNA Marker(DL2,000)；1，pET-32a(+)-IL-1β1经BamHI和XhoI酶切；2，pET-32a(+)-IL-1β2经BamHI和XhoI酶切；

图3 A、重组IL-1β1的表达分析；B、重组IL-1β2的表达分析M，蛋白质marker；1，未诱导的BL21-pET-32a(+)-IL-1β1/β21全菌,2，IPTG诱导后的BL21-pET-32a(+)-IL-1β1/β2全菌,3，未诱导的BL21-pET-32a(+)全菌；4，IPTG诱导后的BL21-pET-32a(+)全菌；5，IPTG诱导后的BL21-pET-32a(+)-IL-1β1/β2上清；6，IPTG诱导后的L21-pET-32a(+)-IL-1β1/β2沉淀；7，纯化后的BL21-pET-32a(+)-IL-1β1/β2；

图4 A，Western-blot分析重组蛋白IL-1β1特异性；B，Western-blot分析重组蛋白IL-1β2特异性；M，蛋白质marker；1，重组蛋白IL-1β1/β2；

图5不同佐剂对斑点叉尾鮰抗体水平的影响。“**”表示差异极显著(p<0.01)；“*”表示差异显著(p<0.05)；

图6不同佐剂组溶菌酶活力。“**”表示差异极显著(p<0.01)；“*”表示差异显著(p<0.05)；

图7累计死亡数量

图8细胞因子IL-1β在肾脏和脾脏中的相对表达量，“**”represent thedifference was extremely significant(p<0.01),“*”represent the different wassignificant(p<0.05)

具体实施方式

实施例1本发明免疫佐剂的制备

1.实验材料

1.1试验动物

斑点叉尾鮰来源于浦江某养殖场，质量为100±5g,饲养在室内水族箱中，每天投喂一定量的饲料，并通气换水，水温控制在25±3℃。

1.2主要仪器

Allegra21R型高速冷冻离心机(Thermo公司)；

ESJ180-4型电子天平(沈阳龙腾电子有限公司)；

SW-CJ-1FD型超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)；

MIs-3780型全自动高压灭菌锅(Sanyo公司)；

WaterPro Plus超纯水仪(LABCONCO公司)；

F80C型碎冰制冰机(Icematic公司)；

725型超低温冰箱(Thermo公司)；

C1000 Thermal Cycler PCR扩增仪(Bio-Rad公司)；

Mini-Protean cell型凝胶成像系统(Bio-Rad公司)；

90-1型恒温磁力搅拌器(上海沪西分析仪器厂)；

SmartSpec3000型核酸蛋白检测仪(Bio-Rad公司)

PowerPac 100型蛋白电泳仪(Bio-Rad公司)；

MLtrasonicProcessor-500超声波裂解器(Autoscience公司)；

HZS-HA型水浴振荡器(哈尔滨东明医疗仪器厂)；

微量加样枪(Eppendorf公司)。

1.3质粒和菌株

表达载体pET-32a(+)购于Invitrogen公司；DH5α(自制)，BL21(DE3)感受态细胞购于天根生化科技(北京)有限公司。

1.4主要试剂

(1)Total RNA Isolation Reagent(RNAiso Plus)、Taq DNA polymerase、DNAMarker，Reverse Transcriptase反转录试剂盒，购置于宝生物工程(大连)有限公司(TAKARA，D9108B,DR100D,D501A)；

(2)胰蛋白胨、酵母提取物购于英国OXOID公司；

(3)氨苄青霉素和质粒DNA小量提取试剂盒购于生工生物工程(上海)股份有限公司；

(4)2×Taq Master Mix、Gold View、琼脂糖购于天根生化科技(北京)有限公司；

(5)T4DNA连接酶、限制性内切酶购于德国Thermo公司；

(6)琼脂糖胶回收试剂盒、IPTG和DNA Marker购于宝生物工程(大连)公司；

(7)辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG、溴酚蓝、考马斯亮蓝R-250、DAB显色液、购于天根生化科技(北京)有限公司；

(8)Tris碱、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、SDS、过硫酸铵、TEMED、2-巯基乙醇、溴酚蓝购于生工生物工程(上海)股份有限公司；

(9)预染蛋白质marker购于德国Thermo公司；

(10)镍NTA琼脂糖凝胶FF亲和层析柱、High-Q阴离子交换层析柱均购自Bia-Rad公司；

1.5主要试剂配制

1.5.1培养基配制

氨苄青霉素(Amp)储备液为100mg/ml：3g Amp置于30ml的离心管中，加入20ml灭菌的超纯水，充分溶解后，定容至30ml，然后再用0.22μm的滤器过滤除菌，每份1ml分装后-20℃保存。

LB液体培养基：5g胰蛋白胨，2.5g酵母提取物，5g NaCl，加入500ml双蒸水溶解，调pH值至7.0～7.2，121℃灭菌30min。

Amp-LB琼脂糖培养基：在LB液体培养基中添加2～3％的琼脂粉，调pH值至7.0～7.2，121℃灭菌30min。待冷却至50～60℃时添加Amp(100mg/ml)储备液使终浓度到100μg/ml。

1.5.2琼脂糖电泳相关试剂配制

5×TBE电泳缓冲液(贮存液)：54g Tris碱，25ml 0.5mol/L EDTA(PH8.0)，27.5g硼酸，加双蒸水定容到1000ml；

1×TBE电泳缓冲液(工作液)：用5×TBE电泳缓冲液稀释而成；

1.0％琼脂糖凝胶：100ml 1×TBE缓冲液，1.0g琼脂糖。

1.5.3蛋白质电泳相关试剂配制

PBS缓冲液(0.02mol/L，pH 7.4)：16g NaCl，0.4g KCl，2.84g Na₂HPO₄，0.54gKH₂PO₄于烧杯中，加入800ml去离子水溶解,调节pH值至7.4，然后加入去离子水定容至1L，121℃灭菌30min，室温保存。

2M Tris-HCl(pH8.8)：121g Tris于烧杯中，加入400ml双蒸水溶解,加浓盐酸调节pH值至8.8，然后加入双蒸水定容至500ml，121℃灭菌30min，室温保存。

1M Tris-HCl(pH6.8)：60.5g Tris于烧杯中，加入400ml双蒸水溶解,加浓盐酸调节pH值至6.8，然后加入双蒸水定容至500ml，121℃灭菌30min，室温保存。

10％SDS:10g SDS，加入80ml双蒸水，搅拌溶解,再加入双蒸水定容至100ml，室温保存。

10％过硫酸铵：1g过硫酸铵溶于8ml双蒸水中，定容至10ml，室温保存。

30％丙烯酰胺(A液)：29.2g丙烯酰胺和1g甲叉双丙烯酰胺于烧杯中，加入80ml双蒸水，充分搅拌溶解，再加入双蒸水定容至100ml，于棕色瓶中4℃保存。

4×分离胶缓冲液(B液)：取75ml 2M的Tris-HCl(pH8.8)，4ml 10％的SDS于烧杯中混匀，再加入21ml去离子水，室温保存。

4×浓缩胶缓冲液(C液)：量取50ml 1M的Tris-HCl(pH6.8)，4ml 10％的SDS于烧杯中混匀，再加入46ml去离子水，室温保存。

12.5％的分离胶(6ml)：2.5ml A液，1.5ml B液，2ml去离子水，30μl10％的过硫酸铵，3μl TEMED。

5％的浓缩胶(4ml)：0.67ml A液，1ml C液，2ml去离子水，30μl10％的过硫酸铵，5μl TEMED。

5×SDS PAGE电泳缓冲液：7.55g Tris，47g甘氨酸，2.5g SDS，加入400ml双蒸水溶解，然后加入去离子水定容至500ml，室温保存。

5×SDS PAGE Loading Buffer：吸取2.5ml 1M的Tris-HCl(pH6.8)，5ml甘油，1gSDS，50mg溴酚蓝放入于10ml离心管中，加入双蒸水溶解并定容至10ml，小份(0.5ml/份)分装，室温保存。使用前将加25μl的2-巯基乙醇。

考马斯亮蓝R-250染色液：1g考马斯亮蓝R-250，250ml异丙醇，100ml冰醋酸加入烧杯，搅拌均匀加双蒸水定容至1L，4℃保存。

SDS-PAGE脱色液：100ml冰醋酸，50ml乙醇，850ml双蒸水，充分混合，4℃保存。

1.5.4蛋白质纯化相关试剂配制

50mMpH7.4的PBS缓冲液的配制：0.5M NaH₂PO₄ 19ml，0.5M Na₂HPO₄81ml，NaCl29.3g加热溶解后定容到1000ml，调节PH7.4。

包涵体洗涤液：120g脲，8.775gNacl，0.372gEDTA,50ml pH8.0Tris-Hcl溶液，1mlTrionX-100，用50mM pH7.4的PBS缓冲液定容至1000ml。

2.实验方法

2.1斑点叉尾鮰IL-1β基因的扩增

2.1.1引物设计

根据GenBank中斑点叉尾鮰IL-1β1(GenBank登录号为：DQ160229)和IL-1β2基因序列(GenBank登录号为：DQ160230)，运用生物软件Oligo6.0和primer5.0对其上下游引物进行设计，并添加限制性内切酶BamHI和Xho I位点(划线部分)。引物由生工生物工程(上海)有限公司合成，预期扩增片段大小均为：843bp，包含完整的IL-1β基因开放阅读框序列。引物序列分别为：

IL-1β1F 5'-CGGATCCATGGCTGACAAAGATTT-3，

IL-1β1R5'-CCTCGAGTCACATCTCATTCTG-3；IL-1β2F

5'-CGGATCCATGGATGACAAAGATTT-3'；

IL-1β2R 5'-CCTCGAGTCAGATCTCATTCTGAG-3'。

2.1.2感受态细胞的制备

(1)取本实验室-80℃保存的DH5α大肠杆菌划线接种于平板，37℃过夜培养后挑取单菌落，接种到10ml LB液体培养基的三角瓶内，37℃、180rpm振荡过夜培养，待OD₆₀₀＝1.5左右时停止培养；

(2)在无菌操作台内，将上述菌液吸取2ml加入到100ml LB培养液中，37℃，200rpm摇床培养，培养过程中每隔30min检测菌液，当OD₆₀₀值在0.5左右时停止培养；

(3)无菌条件下将上述菌液转入冰预冷的50ml离心管中，冰上放置10min；

(4)4℃，4000rpm离心l0min，弃上清液，离心管倒置1min，使液体流净；

(5)每管加入30ml预冷CaC1₂(0.1M)；重悬细胞后，冰上放置30min，4000rpm，4℃离心10min，弃上清废液；

(6)按照CaC1₂:菌液体积比＝1:25的比例，每管加入800ul预冷CaC1₂(0.1M)重悬细胞，再每管加入160ul甘油混匀；

(7)按照每管100ul将混匀细胞分装至1.5ml离心管中，冻存于-80℃冰箱备用。

2.1.3样品采集

实验所用斑点叉尾鮰实验室水簇箱内暂养1周。随机选健康的斑点叉尾鮰，解剖取其头肾，液氮冻存，用于RNA提取。

2.1.4总RNA提取

(1)加入适量液氮预冷研钵，将液氮冻存的头肾迅速转移至研钵中进行研磨，研磨过程中不断添加液氮，保持研钵内一直有液氮；

(2)充分研磨后，适量转入含有1mlRNAisoPlus的1.5ml离心管；

(3)室温放置5min，4℃,12000rpm离心5min；

(4)取上清液转入新的1.5ml离心管(切勿吸取沉淀)，然后加入200ul氯仿，剧烈振荡15sec,室温放置5min；

(5)4℃，12000rpm离心15min；

(6)取上清400ml于新的1.5ml离心管(切忌吸出白色中间层)，并重复4步骤；

(7)再将无色上清液400ml移至新的1.5ml离心管(小心吸取)，加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀，在室温静置10min；

(8)4℃，12000rpm离心10min。一般离心后，离心管底部会出现沉淀；

(9)小心弃去上清液，加1ml 100％无水乙醇，充分振荡；

(10)4℃,12000rpm离心5min；

(11)小心弃去上清，缓慢地沿离心管壁加1ml 75％乙醇(DEPC水配制)轻轻上下颠倒离心管；

(12)4℃,12000rpm离心5min，小心弃去乙醇；空干RNA沉淀10～15min；

(13)向离心管中加入适量的DEPC水(约为40ul)溶解RNA沉淀；

(14)取适量的RNA样品，测定RNA比值和浓度，并且取适量的RNA进行1％琼脂糖凝胶电泳以检测RNA的质量，然后保存于-80℃备用。

2.1.5斑点叉尾鮰cDNA的合成

cDNA的合成参照宝生物公司Reverse Transcriptase反转录试剂盒说明书使用，按以下组分在冰上加入以下混合物于0.2ml的PCR管中(表1)；然后，混合简短微离心后，放入PCR仪进行反转录，反应条件为：37℃15min，85℃5sec，4℃保存，合成第一链cDNA。

表1反转录反应体系

2.1.6斑点叉尾鮰IL-1β基因的扩增

以上步反转录的IL-1βcDNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应体系为25μl：2×TaqMaster Mix 12.5μl，DNA模板1μl，上下游引物(10pmol)各1.0μl，加ddH₂O补至25μl(表2)。反应条件：95℃预变性5min，94℃30s，56℃30s，72℃1.5min，共35个循环，最后72℃延伸10min。取5μl PCR反应产物，用1％琼脂糖凝胶进行电泳，凝胶成像系统检测扩增结果。

表2 PCR反应体系

2.2 IL-1β基因的T克隆

2.2.1 PCR产物回收及纯化

将扩增产物PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳后，用蒸馏水漂洗，在紫外灯下用消毒干净的刀片切下含有目的片段的条带(切胶时请注意不要将DNA长时间暴露在紫外灯下，防止DNA损伤)。然后，按照Takara琼脂糖凝胶回收试剂盒说明书回收目的片段。具体操作步骤如下：

(1)将目的DNA条带切下(尽量去除多余的部分)，放入干净的离心管中，称取重量，并计算胶块体积；

(2)向胶块中加入融化液Buffer GM，充分振荡混合后室温融化；

(3)将融化液体转入吸附柱中，12000rpm离心1min倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；

(4)将700ul的Buffer WB加入到吸附柱内，12000rpm离心1min倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；

(5)重复操作步骤4；

(6)将吸附柱安置于收集管中，室温12000rpm离心1min；

(7)将吸附柱安置于新的1.5ml离心管上，在吸附柱膜的中央加入30～50ul的灭菌蒸馏水或者Elution Buffer，室温静止1min。(注：将灭菌蒸馏水或者Elution Buffer加热至60℃使用时有利于提高洗脱效率)

2.2.2 IL-1β连接转化

按照(表3)的连接体系进行加样，16℃连接过夜。将过夜连接的产物10μl加入至100μl的感受态细胞DH5α^[50]，冰中孵育30min，然后42℃热激90sec，再冰浴5min；加入940μlLB肉汤，37℃，120rpm振荡培养2h；取200μl菌液铺于Amp-LB(100ug/ml)琼脂培养基，37℃培养24h。

表3连接反应体系

2.3T克隆IL-1β基因的鉴定

将疑似阳性克隆子的菌落先进行PCR鉴定，然后进行双酶切鉴定和测序鉴定。

2.3.1菌落PCR鉴定

用灭菌牙签从平板上挑取直径大于1mm的菌落，为了保留相同的菌落，将原菌落进行标记。将细菌转移至装PCR反应管中，反应体系如下：2×Taq Master Mix 12.5μl，DNA模板为单个菌落，上下游引物(10pmol)各1.0μl，加ddH₂O至25μl(表4)。反应条件：95℃预变性5min，94℃1min，56℃30sec，72℃1.5min，共35个循环，最后72℃延伸10min。最后，取5μl反应产物以1％琼脂糖凝胶进行电泳，凝胶成像系统检测扩增结果。

表4菌落PCR反应体系

2.3.2重组克隆质粒的提取

挑取筛选出的白色单菌落，接种到10ml含Amp(100ug/ml)的LB液体培养基中，37℃振荡下过夜培养，将10～15ml菌液12000×g离心1min收集沉淀，按照生工小量提取质粒DNA试剂盒说明书操作。具体操作步骤如下：

(1)将1.5ml过夜培养的细菌菌液加入1.5ml离心管中，10000×g离心1min，并弃去上清液；

(2)在沉淀中加250ul P1 Buffer,用移液枪反复吹打，彻底重悬细菌体沉淀；

(3)加250ul P2 Buffer,立即温和颠倒离心管5～10次(不要剧烈震动，以防止基因组DNA被剪切)；

(4)加350ul P3 Buffer，立即轻柔颠倒离心管5～10次，溶液出现絮状物，但不会出现局部沉淀；

(5)于12000rpm离心5～10min,直至形成白色沉淀；

(6)将步骤5)离心后得到的上清液转移到Spin column内。8000×g离心30sec,并弃去收集管内的液体；

(7)向Spin column内加500ul Buffer DW1,9000×g离心30sec，弃去收集管内的液体；

(8)加入500ul Wash Solution，9000×g离心离心30sec，弃去收集管内的液体；

(9)重复步骤8)1次。

(10)空吸附柱于9000×g离心1min，然后将Spin column转移到无菌的1.5ml离心管中；

(11)向Spin column内加50～100ul Elution Buffer或去离子水，于室温静置1min；

(12)9000×g离心1min，1.5ml离心管内溶液中含有质粒DNA，并分装保存于-20℃备用。

2.3.3重组质粒的鉴定

将上述抽提的重组质粒DNA pMD19-T-IL-1β1和pMD19-T-IL-1β2作为模板进行双酶切鉴定，反应体系(表5)。对鉴定正确的pMD19-T-IL-1β1/β2送上海生工生物工程技术服务公司进行测序鉴定。

表5酶切反应体系

2.4原核表达载体pET-32a(+)-1β1/1β2的构建

将重组质粒pMD19-T-IL-1β1/1β2与表达质粒pET-32a(+)的菌株分别培养后，抽提质粒,并对重组克隆质粒PMD-19T和表达质粒pET-32a(+)进行双酶切(BamHI和Xho I)。运用胶回收试剂盒回收目的基因IL-1β1/1β2片段、表达质粒pET-32a(+)。按T4连接酶反应体系(表6)，4℃过夜连接(16～24h)酶切产物。获得重组表达质粒pET-32a(+)-IL-1β1/1β2转化入感受态DH5α大肠杆菌中，并且通过Amp-LB平板筛选后进行酶切鉴定。

表6连接反应体系

2.5.原核表达载体pET-32a(+)-IL-1β1/1β2的表达

2.5.1原核表达质粒pET-32a(+)-IL-1β1/1β2转化至BL21

将鉴定为阳性的重组表达质粒pET-32a(+)-IL-1β1/1β2，按照2.2.2的方法提取出来，转化至BL21(DE3)宿主菌内。然后，将阳性菌落进行PCR鉴定。

2.5.2重组蛋白IL-1β1/1β2的诱导表达

将含有阳性重组质粒pET-32a(+)-IL-1β1/1β2的BL21(DE3)菌种划线接种于Amp(100μg/mL)抗性的LB平板，37℃培养过夜，挑取单菌落接种于10mL LB培养液中，150rpm振荡培养过夜。将过夜培养的菌液按1:50的比例接种于10mlLB培养液中，剧烈振荡培养OD₆₀₀＝0.6时,加入IPTG至终浓度为l.0mmol/L；诱导培养4h后，取1mL菌液4℃、10000rpm离心2min，弃去上清；沉淀中加入40μl的Tris-HCl缓冲液和10μl的5×SDS上样缓冲液，100℃煮沸10min,用于10％SDS-PAGE分析。

2.5.3重组蛋白IL-1β1/1β2的诱导表达的条件优化

将含有pET-32a(+)-IL-1β1/1β2重组质粒的表达菌株BL21(DE3)，接种于50ml含Amp的LB液体锥形瓶中，分别于30℃、34℃和37℃振荡培养至OD₆₀₀＝0.6时，向三个瓶中加入IPTG至终浓度为1.0mmol/L，150r/min,振荡培养；并且，以含有pET-32a(+)空载的表达菌株BL21(DE3)阴性对照，重组阳性质粒不加IPTG作为空白对照，空载不加IPTG作为空白对照。诱导4h后将上述各瓶菌液4℃8000r/min离心10min，弃上清，收集的菌体用20ml 20mM的Tris-HCl(pH8.0)，洗涤3次；用3ml 20mM的Tris-HCl(pH8.0)重悬浮菌体，反复冻融三次，在冰浴条件下超声破碎(功率150w)菌体(工作3sec，间隔5sec，连续20次)。对超声后的菌体在4℃下8000r/min离心10min，上清转移至另一干净离心管中；沉淀另用2ml 20mM的Tris-HCl(pH8.0)混匀。上清和沉淀各取40μl样品，分别加入10μl 5×Loading Buffer，沸水浴10min，2000r/min离心30sec，进行10％SDS-PAGE分析。

以上述方法诱导表达宿主菌，加入最优终浓度的IPTG，在最优温度条件下诱导0h，1h，2h，3h，4h，5h，6h，7h，8h和过夜诱导后，收集菌体，分别取1ml菌液按照2.5.2.2的方法处理后进行10％SDS-PAGE分析。

以上述方法诱导表达宿主菌，分别加入IPTG至终浓度为：0，0.1，0.3，0.5，0.7，0.9，1.1，1.3,1.5和2.0mmol/L，在最优温度下诱导4h后，收集菌体，分别取1ml菌液按照2.5.2.2方法处理后进行10％SDS-PAGE分析。

2.6重组蛋白IL-1β1/1β2的制备与纯化

2.6.1重组蛋白IL-1β1/1β2的制备

按照上述优化的条件进行重组蛋白的大量诱导表达，将诱导表达的菌液离心收集菌体，进行超声波破碎，发现IL-1β1/1β2基因诱导表达后以包涵体的形式存在，然后进行跑胶鉴定。沉淀用含2M尿素的洗涤液洗涤，洗涤后9000r/min 10min离心弃上清洗涤液，连续洗涤3次；然后用6M盐酸胍缓冲液溶解重组蛋白，至沉淀完全溶解为止。将溶解液，用0.45μm滤膜过滤。

2.6.2重组蛋白IL-1β1/1β2的纯化及复性

按照上海生工生物工程公司的Ni-NTA-Sefinose Column(BSP079-3)纯化系统操作说明进行纯化。纯化后的蛋白经10％SDS-PAGE检验纯度后，分别在含6M脲素、4M脲素、2M脲素和PBS缓冲液中进行梯度透析复性，然后用聚乙二醇12000进行浓缩，用核酸蛋白仪检测浓度，分装于2ml离心管存储于-80℃备用。

2.7 Western-blot检测重组蛋白特异性

纯化的重组蛋白采用10％浓度的凝胶进行SDS-PAGE电泳分离，然后转移至PVDF膜上，进行Western-blot鉴定。按文献具体步骤如下：先将SDS-PAGE电泳后的凝胶浸泡入转移缓冲液中，并准备好6张滤纸和一张PVDF膜；将转移缓冲液浸泡过的滤纸、纤维垫和甲醇浸泡的PVDF膜，以“海绵垫—滤纸—凝胶—PVDF膜—滤纸—海绵垫”的顺序在转移盒负极上按顺序叠放；在冰浴条件下，100V转移3h；取PVDF膜放入培养皿内，加入适量3％BSA/TBST在37℃轻摇封闭2h；倒掉封闭液，用TBST洗膜3次，每次10min；加入适当体积的0.5％BSA的小鼠抗His抗体(1：3000稀释)，37℃轻摇1h，弃一抗，用TBST洗膜3次，每次10min；将膜转移至适量的1:5000稀释的二抗HRP标记的山羊抗鼠IgG中，37℃轻摇1h；TBST洗膜3次，10min/次；加入天根DAB显色液，显色10～25min，当看见的目的条带时，迅速用双蒸水终止显色，并照相记录保存。

3.结果

3.1斑点叉尾鮰IL-1β1/β2基因的扩增、T克隆和鉴定

以反转录的斑点叉尾鮰IL-1β1/β2cDNA为模板，经PCR反应后IL-1β1和IL-1β2都扩增出一条位于750bp-1000bp区间的目的片断(图1)。PCR产物经胶回收纯化后，与pMD19-T载体连接获得重组质粒pMD19-T-1β1/β2，对重组质粒经双酶切鉴定和测序鉴定。IL-1β1和IL-1β2双酶切都分别出现两个条带，都约为843bp和2600bp，测序结果与引物设计参考序列同区段相似性为100％。

3.2斑点叉尾鮰IL-1β1/β2基因原核表达载体的构建

将上述测序正确的重组质粒pMD19-T-IL-1β1/β2，进行双酶切后通过胶回收试剂盒回收目的片段，然后将胶回收的IL-1β1/β2片段分别与表达载体pET-32a(+)连接获得重组表达质粒pET-32a(+)-IL-1β1/β2。并且，进行双酶切鉴定，结果显示两个重组质粒的目的条带都介于750bp～1000bp之间与预期结果一致(图2)。

3.3重组质粒pET-32a(+)-IL-1β1/β2诱导表达、条件优化及纯化

将鉴定正确的重组质粒pET-32a(+)-IL-1β1和pET-32a(+)-IL-1β2分别转化至BL21(DE3)，经PCR鉴定正确后，挑取单个菌落于10ml含Amp(10μg/ml)LB中150rpm振荡至菌液浓度为OD₆₀₀＝0.6时,加入诱导剂IPTG至终浓度l.0mmol/L；诱导4h后进行10％SDS-PAGE检测，两个重组质粒都出现约48.1KDa大小的条带(图3)。然后分别对重组质粒pET-32a(+)-IL-1β1和pET-32a(+)-IL-1β2的表达条件进行优化，结果最佳诱导温度都为37℃，最佳诱导IPTG浓度都为0.5mmol/L，最佳诱导时间都为4h。诱导后使用上海生工生物工程公司的Ni-NTA-Sefinose Column(BSP079-3)纯化系统进行纯化获得的IL-1β1和IL-1β2重组蛋白，核酸蛋白仪测定各自的浓度分别为1.4mg/ml和1.2mg/ml。

3.4 Western-blot检测重组IL-1β1/β2的特异性

将纯化的IL-1β1/β2蛋白处理后进行SDS-PAGE凝胶电泳、转膜、BSA封闭、加入小鼠抗His抗体孵育,完后加入HRP标记的山羊抗鼠IgG，DAB显色后拍照。结果显示：表达出来的重组IL-1β1/β2蛋白具有较好的特异性，能够满足后续试验的要求(图4)。

实验结果说明，本发明制备得到了重组IL-1β1和IL-1β2，它们的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

实施例2本发明复合佐剂的制备

取实施例1制备得到的重组IL-1β1和IL-1β2，二者的重量比为1:1，加上药学上可接受的辅料，制成复合佐剂。

实施例3本发明疫苗的制备

抗原制备：

将含有pET-32a(+)-pscpI重组质粒的表达菌株BL21(DE3)(pscpI是海豚链球菌的一个致病因子，具有较强的免疫原性，重组pscpI质粒由本实验室之前研究者提供)进行大量诱导表达，收集菌体进行超声波破碎和鉴定。离心弃上清后，用含6M盐酸胍的缓冲液溶解重组蛋白，将溶解后的溶液，用0.45μm孔径的滤膜过滤。然后，按照生工生物工程(上海)股份有限公司的Ni-NTA-Sefinose Column(BSP079-3)纯化系统操作说明进行纯化。纯化后的蛋白经SDS-PAGE检验纯度后，分别在含6M脲素、4M脲素、2M脲素和PBS缓冲液中进行梯度透析复性，透析后用聚乙二醇12000进行浓缩，用核酸蛋白仪检测浓度，并用PBS将重组蛋白pSCPI稀释浓度为1.0mg/ml。

pSCPI的氨基酸序列：

ETVVSAQPSSGEASVEPVSGEEQKPLIDYVDPSNVKDIWEKVGRGKGSLIAVIDAGIEQTHDMLNLADSSDLKYSSKEDLEAKKKEHGIERGKWVNHKLVFYHDYNEGVDSPKSGDEDLYHGTHVAGIAAGSMVNNKKNELLMEGIAPDAQLMFMRVGKTSLIPEKENLYALAIEDAVALGATAINMSFGSVGKASDELKESVHRALNAAREKGVALIVAAGNDFAMGGYPVKPLAKNPDFGVIGTPATTDDVLTIAAYVAPEDISEVFTVASHNDSKELAVTVASAFPKGRQLDFIDIGKGLEDDYLDKDVKGKIVIVDYEAVITSKATAELAQSKGVAGVLVHHRDYKRPLLPLNYHGDLPMGFISLEDFDYLKSLDKATLTFNHKKKLVSVPGGRQMANFSSWGLSADGHMKPDLSAPGYELYSPSLKNTYEPMSGTSSASPHAMGIVSLVQEHVKKKYPQYSPQEQLLLVKNILMSTADPIISPVDNTYYSPRLQGAGAIDAKKAIATDVYLTGSNGLSKINLGDISNTFDLKVRLHNMGNQTKQFKYYATVLADKAENGKMTLRPQKLYTTEQEEVILAPNEEKEVSLTIDISNFDASLIAQMINGYFVDGFVHFDSNDGIKNVLSIPFL

取实施例1制备得到的重组IL-1β1和IL-1β2，二者的重量比为1:1，再加入pSCPI，其与重组IL-1β1的重量比为1:2，加上药学上可接受的辅料，制成疫苗。

以下用实验例的方式说明本发明的有益效果：

实验例1 免疫效果研究

1.试验材料

1.1试验菌株和材料

斑点叉尾鮰源海豚链球菌分离株DGX07由四川农业大学鱼病研究中心分离鉴定并保存。

实施例1制备得到的重组IL-1β1和IL-1β2。

1.2试验动物

健康斑点叉尾鮰(100g±5g)购于四川蒲江某养殖场，试验前在四川农业大学水产系水泥养殖池(1.5m×1.0m×1.5m)中暂养两周，暂养期间每天按照鱼体重3％投喂商品浮性饲料。养殖水体为曝气自来水，水温25℃±3℃，每天换水一次，每次三分之一。尾静脉采血制作血清用于后续试验，采血前用浓度为0.02％的MS-222对试验鱼进行麻醉。

1.3主要仪器

MIs-3780型全自动高压灭菌锅(Sanyo公司)；

JA12002型电子天平(上海分析仪器厂)；

SW-CJ-3FD超净工作台(苏净集团安泰公司)；

PYX-DHS-40×50隔水式电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂)；

Bio-RAD 680Microplate Reader酶联免疫检测仪(美国Bio-Rad公司)；

SmartSpec3000型核酸蛋白检测仪(美国Bio-Rad公司)；

Thermo CR3i冷冻高速离心机(美国Thermo公司)；

SHX150A生化培养箱(常州中诚仪器制造有限公司)。

1.4主要试剂

(1)脑心浸液培养基(BHI)购于美国Difco公司；胰蛋白胨、酵母提取物购于英国OXOID公司；

(2)辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG购于百奇生物科技(苏州)有限公司；

(3)青霉素、微球菌粉、鸡蛋清溶菌酶(HEWL)、DMSO(二甲基亚砜)、乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)购于生工(上海)生物工程有限公司；

(4)可溶型单组分TMB底物溶液购于北京天根有限公司；

(5)绵羊红细胞(SRBC)购于郑州百基生物科技有限公司。

(6)兔抗斑点叉尾鮰血清IgM(本实验室提供)

1.5主要试剂和培养基的配制

0.05M PBS：Na₂HPO₄·12H₂O 6.615g，NaH₂PO₄·H₂O 0.666g，NaCl 10.0g，KCl0.45g加双蒸水至450ml,调节PH到7.4。使用时稀释至0.01M；

脑心浸液肉汤(brain heart infusion broth)：称取BHI 10.5g，加蒸馏水至500mL,按每支试管10mL的量分装，然后在115℃高压灭菌15min，冷却后4℃保存备用；

脑心浸液固体培养基(brain heart infusion agar)：在脑心浸液液体培养基中添加2～3％的琼脂粉，然后在115℃高压灭菌15min，待冷却至50～60℃时倒平板。

2.试验方法

2.1抗原制备

将含有pET-32a(+)-pscpI重组质粒的表达菌株BL21(DE3)(pscpI是海豚链球菌的一个致病因子，具有较强的免疫原性，重组pscpI质粒由本实验室之前研究者提供)进行大量诱导表达，收集菌体进行超声波破碎和鉴定。离心弃上清后，用含6M盐酸胍的缓冲液溶解重组蛋白，将溶解后的溶液，用0.45μm孔径的滤膜过滤。然后，按照生工生物工程(上海)股份有限公司的Ni-NTA-Sefinose Column(BSP079-3)纯化系统操作说明进行纯化。纯化后的蛋白经SDS-PAGE检验纯度后，分别在含6M脲素、4M脲素、2M脲素和PBS缓冲液中进行梯度透析复性，透析后用聚乙二醇12000进行浓缩，用核酸蛋白仪检测浓度，并用PBS将重组蛋白pSCPI稀释浓度为1.0mg/ml。

pSCPI的氨基酸序列：

ETVVSAQPSSGEASVEPVSGEEQKPLIDYVDPSNVKDIWEKVGRGKGSLIAVIDAGIEQTHDMLNLADSSDLKYSSKEDLEAKKKEHGIERGKWVNHKLVFYHDYNEGVDSPKSGDEDLYHGTHVAGIAAGSMVNNKKNELLMEGIAPDAQLMFMRVGKTSLIPEKENLYALAIEDAVALGATAINMSFGSVGKASDELKESVHRALNAAREKGVALIVAAGNDFAMGGYPVKPLAKNPDFGVIGTPATTDDVLTIAAYVAPEDISEVFTVASHNDSKELAVTVASAFPKGRQLDFIDIGKGLEDDYLDKDVKGKIVIVDYEAVITSKATAELAQSKGVAGVLVHHRDYKRPLLPLNYHGDLPMGFISLEDFDYLKSLDKATLTFNHKKKLVSVPGGRQMANFSSWGLSADGHMKPDLSAPGYELYSPSLKNTYEPMSGTSSASPHAMGIVSLVQEHVKKKYPQYSPQEQLLLVKNILMSTADPIISPVDNTYYSPRLQGAGAIDAKKAIATDVYLTGSNGLSKINLGDISNTFDLKVRLHNMGNQTKQFKYYATVLADKAENGKMTLRPQKLYTTEQEEVILAPNEEKEVSLTIDISNFDASLIAQMINGYFVDGFVHFDSNDGIKNVLSIPFL

2.2免疫

试验前随机选取3尾鱼进行尾静脉采血，通过凝集试验测定试验鱼血清是否与海豚链球菌DGX07株进行反应。并且，分别接种3尾鱼的肝脏、肾脏和脾脏组织于BHI平板，观察有无细菌感染。

将300尾健康斑点叉尾鮰(100g±5g)随机分成5组，每组60尾。其中3组免疫组分别为pSCPI+IL-1β1、pSCPI+IL-1β2、pSCPI+IL-1β1+IL-1β2(IL-1β1与IL-1β2的重量比1:1)，对照组为pSCPI、PBS，亚单位疫苗免疫剂量每尾鱼为2μg/g，亚单位疫苗与佐剂1:1(重量比为1:1)混合(pSCPI：IL-1β1/IL-1β2、pSCPI：(IL-1β1+IL-1β2))，每尾鱼腹腔注射0.2ml配比好的佐剂疫苗，浓度为1mg/ml。两周后免疫组用等量的亚单位疫苗加强免疫一次(表7)。

表7免疫程序和剂量

2.3采血

免疫后分别在第1、2、3、4、5、6、7和8周进行尾静脉采血，每个组随机选取5尾鱼用MS-222进行麻醉，每尾采集0.5ml。采集的血液室温静置3h后转入4℃冰箱，放置过夜，然后4000×g离心30min，收集血清，放-80℃备用。

2.4免疫指标检测

2.4.1抗体效价检测

免疫后的斑点叉尾鮰特异性抗体效价的检测，按照张崇文的间接ELISA方法进行：

(1)包被:将抗原pSCPI用包被液稀释至500μg/ml，取100μl加入到96孔板(50μg/孔)，每个样品三个重复，4℃包被过夜；

(2)洗涤:倒掉包被液，每孔加入250μl洗涤液，洗涤3次，每次5min；

(3)封闭:每孔加入200μl 3％的BSA，37℃封闭2h；

(4)洗涤:弃封闭液，按照步骤2进行洗涤；

(5)加入一抗：首孔加入100μl 100倍稀释的斑点叉尾鮰抗pSCPI重组蛋白血清，以后各孔进行2倍梯度稀释，37℃孵育1h；

(6)洗涤:弃一抗，每孔加入250μl洗涤液，洗涤3次，每次5min；

(7)加入二抗：每孔加入1000稀释的兔抗斑点叉尾鮰IgM血清100μl，37℃孵育1h；

(8)洗涤:弃二抗，按照步骤2进行洗涤；

(9)加入酶标三抗：每孔加入5000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG血清100μl，37℃孵育1h；

(10)洗涤:弃三抗，按照步骤2进行洗涤；

(11)显色：每孔加入100μlTMB显色液，避光放置，室温显色15min；

(12)终止：每孔加入2M的硫酸100μl终止显色；

(13)测定：终止显色后用酶标仪在450nm波长条件下测定；

抗体效价度根据P/N值来确定：P/N＝(待检血清OD₄₅₀—空白对照的OD₄₅₀)/(阴性血清的OD₄₅₀—空白对照的OD₄₅₀)。当P/N值大于2.1时抗血清的最高稀释倍数为其最终抗体效价。数据以“平均数±标准误”表示，并用单因素方差分析进行显著性检验。

2.4.2血清溶菌酶活力检测

血清溶菌酶活力的测定，利用冻干的微球菌粉通过浊度进行分析：首先将待测血清用的柠檬酸盐缓冲液(pH5.5，0.02M)10倍稀释，取20μl加入到U型底96孔板中，每个样品具有3个重复。然后每孔加入用浓度为0.2mg/ml的微球菌粉200μl，迅速在OD值450nm的吸光度下测定初始的吸光度，然后将含有底物的待测样品放置于37℃恒温箱孵育1h，在相同的450nm吸光度下测定最终的OD值。并采用相同的方法，以鸡蛋白溶菌酶做标准曲线，测定值应该在标准曲线有效范围之内。溶菌水平以U/ml表示，0.001/min表示一个单位U。

2.4.3攻毒试验

将攻毒试验鱼在80cm×60cm×60cm的水族箱中暂养一周，水温用加热棒控制在28℃±1℃，养殖用水为曝气自来水，每天换水三分之一。然后接种海豚链球菌DGX07株于BHI肉汤，于28℃过夜培养，以10LD₁₀₀的致死剂量(6×10⁸cfu/ml)为攻毒浓度6×10⁹cfu/ml，每组25尾鱼，每尾腹腔注射0.2ml。攻毒后连续观察14d，观察死亡情况并记录，分别接种肝脏、肾脏和脾脏组织于BHI平板鉴定攻毒细菌。以相对保护率表示免疫效果：相对保护率(RPS)＝[1-(免疫组死亡率％/对照组死亡率％)]×100％。

2.5重组蛋白IL-1β1/2对斑点叉尾鮰细胞因子转录影响

2.5.1样品采集

将上述攻毒试验鱼，在攻毒后24h和48h，各个试验组分别随机选取3尾鱼取其头肾、脾脏样品，液氮冻存备用。

2.5.2提取总RNA和反转录cDNA

按第二章2.1.4和2.1.5的方法组织匀浆后提取总RNA，用核酸蛋白定量仪测定总RNA浓度，按宝生物反转录试剂盒合成cDNA。

2.5.3荧光定量引物设计

根据GenBank中斑点叉尾鮰细胞介素-1β(IL-1β)和内参基因18S序列(表8)，运用生物软件Oligo6.0和primer5.0对其上下游引物进行设计，送生工生物工程(上海)有限公司合成。

表8实时荧光定量PCR反应的引物

2.6.实时荧光定量(Real-time)PCR分析

2.6.1 Real-time PCR反应体系和条件

参照ABI公司SYBR@Green PCR Supermix染料说明书配置PCR反应体系，总反应体积为10ul,含cDNA 1.0ul,SYBR Green Real-time PCR Master Mix 5ul,上下游引物各0.5ul，ddH₂O 3.0ul(表9)。将各反应成分在0.2ml PCR管中混勾。按照以下条件进行PCR反应，95℃预变性2min,95℃变性20sec，62℃退火20sec，72℃延伸30sec，40个循环，72℃釆集荧光信号。扩增反应结束后继续从65℃缓慢升温至95℃(0.5℃/10sec),进行PCR产物溶解曲线分析,鉴定扩增产物是否特异性单一。

表9Real-time PCR反应体系

2.6.2标准曲线构建、融解曲线分析

将cDNA按10、10²、10³、10⁴和10⁵五个浓度梯度稀释，按照上述反应体系和条件分别进行目的基因白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和内参基因18S的扩增，形成以Ct值(达到阈值时的循环次数)为纵坐标，稀释度为横坐标的标准曲线。该条件下扩增的目的基因与内参基因的融解曲线均应只有一个峰。

2.6.3相对定量方法

每个试验组均进行平行检测(n＝3)取其循环阈值(Ct)的平均值，计算斑点叉尾鮰细胞因子IL-1β和TNF-α基因的相对表达量＝2^-△△Ct，△Ct＝目的基因平均Ct值-内参基因平均Ct值，△△Ct＝实验组△Ct-对照组△Ct。用SPSS19.0软件包进行统计分析，所有实验数据用Mean±SE表示，各不同组织△Ct值釆用独立样本t检验，P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异极显著。

2.7统计学分析

采用spss19.0软件进行统计学分析，各组相同指标的数据进行单因素方差分析，结果用“平均值±SE”表示，P<0.05表示差异显著，P>0.05表示差异不显著；P<0.01表示差异极显著。

3.结果

3.1抗体水平检测

本试验分别测定了免疫组和对照组第3周到第5周抗体水平(图5)。

结果显示：1、佐剂疫苗组和无佐剂疫苗组抗体水平均在第四周达到峰值；2、第3、4、5周pSCPI+IL-1β1+IL-1β2组抗体水平最高，其次为pSCPI+IL-1β1组和pSCPI+IL-1β2组；3、在第三周和第四周，与pSCPI+IL-1β1组和pSCPI+IL-1β2组相比，pSCPI+IL-1β1+IL-1β2组抗体明显更高(p<0.05)。

3.2血清溶菌酶活力检测

本试验测定了第4周各组亚单位疫苗对斑点叉尾鮰溶菌酶活性的影响见(图6)。

结果显示:1、疫苗组溶菌酶活力均极显著高于对照组溶菌酶活力(p<0.01)；2、同时第4周佐剂疫苗组溶菌酶活力极显著高于无佐剂疫苗组(p<0.01)；3、与pSCPI+IL-1β1组和pSCPI+IL-1β2组相比，pSCPI+IL-1β1+IL-1β2组溶菌酶活力明显更高。

3.5死亡率和相对免疫保护率

实验结果如图7所示：

1、试验鱼攻毒后第三天开始陆续死亡，PBS组和pSCPI组第3天开始死亡，而pSCPI+IL-1β1组和pSCPI+IL-1β2组第4天开始死亡，pSCPI+IL-1β1+IL-1β2组第5天开始死亡，各组分别在第8天到第11天达到死亡高峰期。

2、PBS、pSCPI pSCPI+IL-1β1、pSCPI+IL-1β2和pSCPI+IL-1β1+IL-1β2组连续观察14天的累计死亡率分别为：93.33％、46.67％、36.67％、33.33％和23.33％。pSCPI、pSCPI+IL-1β1、pSCPI+IL-1β2和pSCPI+IL-1β1+IL-1β2组相对保护率分别为：50.1％、61.71％、65.29％和75.01％。

3、与pSCPI+IL-1β1组和pSCPI+IL-1β2组相比，pSCPI+IL-1β1+IL-1β2的保护率提高了9.72～13.3％，提高幅度大。

3.6 Real-time PCR分析斑点叉尾鮰IL-1β的转录表达变化

实验结果如图8所示：

IL-1β基因在脾脏中pSCPI+IL-1β1和pSCPI+IL-1β1+IL-1β2组48h转录水平高于24h，而pSCPI+IL-1β2组24h转录高于48h，24h时pSCPI+IL-1β2转录水平最高，48h时pSCPI+IL-1β1+IL-1β2组转录水平最高，pSCPI+IL-1β2、pSCPI+IL-1β1+IL-1β2组24h转录水平和pSCPI+IL-1β1、pSCPI+IL-1β1+IL-1β2组48h转录水平与对照组差异极显著(p<0.01)；在第48h时，pSCPI+IL-1β1+IL-1β2组的转录水平比pSCPI+IL-1β1组、pSCPI+IL-1β2组的三倍还高。

实验结果说明，pSCPI+IL-1β1、pSCPI+IL-1β2均可以有效提高免疫原的免疫原性，诱导机体产生特异性抗体；而pSCPI+IL-1β1、pSCPI+IL-1β2联用时，诱导机体产生的抗体、IL-1β的水平，血清溶菌酶活性，以及对机体的保护作用均明显优于同等剂量下二者单独使用(p<0.05)，说明将二者使用发挥了协同增效的作用，取得意料不到的技术效果。

综上，本发明重组IL-1β1和IL-1β2可以有效提高鱼用疫苗的免疫原性，可以作为鱼用疫苗的佐剂使用，二者联合使用时的效果明显优于同等剂量下二者单独使用(p<0.05)，可以制备成为复合佐剂。本发明SEQ ID NO：5所示蛋白质的免疫原性好，对机体的保护作用强，可以制成有效预防鱼类链球病菌的疫苗，临床应用前景良好。

Claims (2)

1.一种复合佐剂和SEQ ID NO：5所示的蛋白在制备疫苗中的用途，其特征在于：所述的复合佐剂含有SEQ ID NO：3所示蛋白质和SEQ ID NO：4所示蛋白质，以及药学上可接受的载体，SEQ ID NO：3所示蛋白质与SEQ ID NO：4所示蛋白质的重量配比为1：1。

2.一种预防鱼类链球菌病的疫苗，其特征在于：它包括氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示的蛋白，以及药物学上可接受的辅料；所述辅料是SEQ ID NO：3所示蛋白质和SEQ ID NO：4所示蛋白质，二者的重量配比为1:1。