CN105147669A - 三棱双苯内酯和三棱双苯内酯b的衍生物在制备抗炎药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医药技术领域，是三棱双苯内酯(SanLeng？diphenyllactone)以及三棱双苯内酯B(Sparstolonin？B)的衍生物在制备抗炎药物中的应用。本发明以三棱双苯内酯和三棱双苯内酯B为起始原料，经烷基化、酰化、异喹啉酮化、碱水解反应合成了10个化合物，经¹H-NMR和HR-ESI-MS谱确认，这10个化合物都是未经文献报道过的新化合物。经体外抗炎活性研究发现，三棱双苯内酯和三棱双苯内酯B的衍生物对Pam3csk4或LPS刺激的RAW264.7细胞炎性因子TNF-α和IL-6的产生具有良好的抑制作用。

Description

三棱双苯内酯和三棱双苯内酯B的衍生物在制备抗炎药物中的应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，三棱双苯内酯(SanLengdiphenyllactone)以及三棱双苯内酯B(SparstoloninB，SsnB)的衍生物在制备抗炎药物中的应用。

背景技术

Toll样受体(Toll-likereceptors，TLR)可以通过识别病原相关分子模式或有害的内源性物质来激活先天性免疫系统产生炎症细胞因子，进而启动后天免疫系统反应。TLR家族中的TLR-2、TLR-4在CD14、LBP、MD-2等分子的协同下被Pam3csk4和LPS激活，然后通过髓样分化因子-88(myeloiddifferentiation-88，MyD-88)依赖和MyD-88非依赖的信号传导途径将信号传导至细胞内，再诱发胞内一系列的相关因子反应，从而合成IL-6、IL-8、TNF-a、IL-1、IL-12、IL-1β以及IFN-γ等细胞炎症因子，产生很强的免疫反应；其在天然免疫和炎症反应中起重要作用，是连接天然免疫和获得性免疫的关键分子，但是它们过度激活引起的过度免疫反应会导致多种自身免疫性疾病、慢性炎症和感染性疾病等发生。因此，在这些疾病的治疗学研究中，将TLR-2、TLR-4作为疾病防治和药物开发的重要靶点，研发TLR-2、TLR-4拮抗剂进行负调控成为近年来的热点之一。

三棱双苯内酯和三棱双本内酯B是从莎草科藨草属植物荆三棱(ScripusyagaraOhwi)的块茎中提取分离到，结构式如下：

研究发现SparstoloninB(SsnB)对巨噬细胞炎性反应具有显著抑制作用，其分子机制是通过选择性阻断MyD88与TLR2和TLR4结合，是一个TLR-2和TLR-4信号通路阻断剂；SsnB还能明显降低由LPS诱导的HUVEC细胞炎性因子IL-1β和MCP-1的mRNA和蛋白的表达水平，抑制ICAM-1和VCAM-1的表达，显著抑制LPS诱导的HUVEC细胞关键信号蛋白Erk1/2和Akt的磷酸化水平；同时SsnB对缺氧复氧诱导的心肌细胞炎症反应有明显抑制作用，能显著提高LPS诱导的脓毒症小鼠的存活率。(QiaoliLiang，QinanWu，JihongJiang，Jin’aoDuan，ChaoWang，MarkD.Smith，HongLu，QianWang，PrakashNagarkatti，andDapingFan.CharacterizationofSparstoloninB，aChineseHerb-derivedCompound，asaSelectiveToll-likeReceptorAntagonistwithPotentAnti-inflammatoryProperties，J.BioChem，2011，286(30)，26470-26479；QiaoliLiang*，FangYu，XiaodongCui，Jin’aoDuan，QinanWu，PrakashNagarkatti，DapingFan.SparstoloninBsuppresseslipopolysaccharide-inducedinflammationinhumanumbilicalveinendothelialcells.ArchivesofPharmacalResearch，2013，36：890-896；HenryR.Bateman，QiaoliLiang，DapingFan，VanessaRodriguez，SusanM.LessnerSparstoloninBinhibitspro-angiogenicfunctionsandblockscellcycleprogressioninendothelialcells.PlosOne，2013；8(8)：e70500)。

发明内容

本发明的目的在于提供一类三棱双苯内酯和三棱双本内酯B衍生物。

本发明的目的还在于提供该类三棱双苯内酯和三棱双苯内酯B衍生物的制备方法。

本发明的目的还在于提供该类三棱双苯内酯和三棱双苯内酯B衍生物在制备抗炎药物中的应用。

本发明采取的技术方案如下：

其中：A1-A2，采用反应a，条件CH₃I，CH₃COCH₃，K₂CO₃，30℃，rt；

A3-A4，采用反应b，条件(CH₃CO)₂O，pyridine，80℃，rt；

A5-A6，采用反应c，条件(CH₃CH₂CH₂CO)₂O，pyridine，80℃，rt；

B1-B2，采用反应d，条件5％KOH，EtOH，reflux，rt；

C1-C2，采用反应e，条件NH4OH(25-28％)，DMF，80℃，rt。

且衍生物A1-A6，B1-B2，C1-C2皆为新化合物。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但所述实施例仅用于说明本发明而不是限制本发明。

实施例18，5′-dimethoxy-4-pheny-5，2′-oxidoisocoumarin(A1)的合成

室温下，取三棱双苯内酯B(8，5′-dihydroxy-4-pheny-5，2′-oxidoisocoumarin)(20mg，0.074mmol)，丙酮20ml加入反应瓶中，加入K₂CO₃(20.6mg，0.149mmol)作为催化剂，搅拌0.5h后，冰浴条件下加入0.03mlCH₃I，加热至30℃反应24h。反应完毕，过滤，减压蒸干滤液，得到黄色固体，粗产品用制备薄层色谱纯化，展开剂条件为石油醚-乙酸乙酯5∶1(v/v)，得到黄色固体产物，得率82.4％。

分子式C₁₇H₁₂O₅，HR-ESI-MS(m/z)：295.0603[M-H]^-。¹H-NMR(CDCl₃，300MHz)δ：3.84(3H，s，OCH₃)，4.00(3H，s，OCH₃)，6.88(2H，m)，7.02(2H，d，J＝9.0Hz)，7.34(1H，d，J＝9.0Hz)，7.50(1H，s).

实施例28-methoxy-4-pheny-5，2′-oxidoisocoumarin(A2)的合成

按照实施例1所述，20mg(0.079mmol)三棱双苯内酯(8-hydroxy-4-pheny-5，2′-oxidoisocoumarin)与0.015mlCH₃I反应，产物经95％乙醇重结晶得到黄绿色固体，得率89.2％。

分子式C₁₆H₁₀O₄，HR-ESI-MS(m/z)：265.1497[M-H]^-。¹H-NMR(DMSO-d₆，500MHz)δ：3.09(3H，s，OCH₃)，8.06(1H，s)，7.13(2H，m)，7.22(1H，J＝9.5Hz)，7.33(1H，t，J＝8.0Hz)，7.51(1H，d，J＝9.0Hz)，7.77(1H，d，J＝7.5Hz).

实施例38，5′-diacetyl-4-pheny-5，2′-oxidoisocoumarin(A3)的合成

常温下，取三棱双苯内酯B(8，5′-dihydroxy-4-pheny-5，2′-oxidoisocoumarin)(20mg，0.074mmol)加入25ml三孔烧瓶中，加入4ml无水醋酐，待样品搅拌溶解后加入2ml吡啶，逐渐加热至80℃反应3h，放置过夜。然后将反应液加入30ml冷水中，搅拌，出现大量黄色不溶物，滤出不溶物，40℃烘干，得到黄色粉末，得率82.5％。

分子式C₁₉H₁₂O₇，HR-ESI-MS(m/z)：351.0501[M-H]^-。¹H-NMR(DMSO-d₆，500MHz)δ：2.29(3H，s，CH₃)，2.31(3H，s，CH₃)，7.15(1H，dd，J＝9.0Hz，2.5Hz)，7.24(1H，d，，J＝8.5Hz)，7.36(1H，d，J＝8.5Hz)，7.61(1H，d，J＝9.0Hz)，7.64(1H，d，J＝2.0Hz)，8.16(1H，s).

实施例48-acetyl-4-pheny-5，2′-oxidoisocoumarin(A4)的合成

按照实施例3所述，20mg(0.079mmol)三棱双苯内酯(8-hydroxy-4-pheny-5，2′-oxidoisocoumarin)与2ml无水醋酐和1ml吡啶反应，得到淡黄色针状结晶，得率88.7％。

分子式C₁₇H₁₀O₅，HR-ESI-MS(m/z)：293.1764[M-H]^-。¹H-NMR(DMSO-d₆，500MHz)δ：2.31(3H，s，CH₃)，8.19(1H，s)，7.20(1H，d，J＝7.0Hz)，7.38(2H，m)，7.61(1H，d，J＝9.0Hz)，7.83(1H，d，J＝8.0Hz)，8.19(1H，s).

实施例58，5′-dibutyryl-4-pheny-5，2′-oxidoisocoumarin(A5)的合成

常温下，取三棱双苯内酯B(8，5′-dihydroxy-4-pheny-5，2′-oxidoisocoumarin)(25mg，0.093mmol)加入25ml三孔烧瓶中，加入4ml无水丁酸酐，待样品搅拌溶解后加入2ml吡啶，逐渐加热至80℃反应4h，放置过夜。然后将反应液加入30ml冷水中，搅拌，出现大量黄色不溶物，滤出不溶物，40℃烘干，粗产品用制备薄层色谱纯化，展开剂条件为石油醚-氯仿-丙酮-冰乙酸10∶4∶1∶1(v/v)，得到黄色固体，83.7％。

分子式C₂₃H₂₀O₇，HR-ESI-MS(m/z)：407.1125[M-H]^-。¹H-NMR(DMSO-d₆，300MHz)δ：0.99(6H，t，J＝7.5Hz)，1.68(4H，m)，2.59(4H，m)，7.14(1H，dd，J＝9.0Hz，2.4Hz)，7.24(1H，d，J＝9.0Hz)，7.35(1H，d，J＝8.7Hz)，7.61(2H，d，J＝9.0Hz)，8.19(1H，s).

实施例68-butyryl-4-pheny-5，2′-oxidoisocoumarin(A6)的合成

按照实施例3所述，15mg(0.060mmol)三棱双苯内酯(8-hydroxy-4-pheny-5，2′-oxidoisocoumarin)与2ml无水醋酐和1ml吡啶反应得到淡黄色针状结晶，得率87.2％。

分子式C₁₉H₁₄O₅，HR-ESI-MS(m/z)：321.0759[M-H]^-。¹H-NMR(DMSO-d₆，300MHz)δ：1.00(3H，t，J＝7.5Hz)，1.69(2H，m)，2.62(2H，t，J＝7.2Hz)，7.18(2H，t，J＝7.8Hz)，7.35(2H，m)，7.58(1H，d，J＝8.7Hz)，7.81(1H，d，J＝7.8Hz)，8.17(1H，s).

实施例72-hydroxy-9-oxy-9H-xanthene-1-carboxylicacid(B1)的合成

常温条件下，取三棱双苯内酯(8-hydroxy-4-pheny-5，2′-oxidoisocoumarin)(20mg，0.079mmol)加入50ml三孔烧瓶中，加入5ml无水乙醇，加热超声溶解后，加入10ml5％KOH溶液，于85℃下反应3h，反应液冷却至室温，滴加1M盐酸至PH3-4，水相用乙酸乙酯萃取3次，每次6ml，合并有机相，加入无水硫酸钠后放置过夜，除去干燥剂，减压回收溶剂，得到黄色粉末，得率90.1％。

分子式C₁₄H₈O₅，HR-ESI-MS(m/z)：255.0297[M-H]^-。¹H-NMR(DMSO-d₆，300MHz)δ：7.45(2H，m)，7.61(2H，m)，7.85(1H，t，，J＝6.9Hz)，8.13(1H，d，J＝7.5Hz)，10.1(1H，s，OH)，12.7(1H，s，COOH).

实施例82，7-dihydroxy-9-oxy-9H-xanthene-1-carboxylicacid(B2)的合成

按照实施例7所述，25mg(0.093mmol)三棱双苯内酯B(8，5′-dihydroxy-4-pheny-5，2′-oxidoisocoumarin)与12ml5％KOH溶液反应，得到亮黄色粉末，得率88.6％。

分子式C₁₄H₈O₆，HR-ESI-MS(m/z)：271.0232[M-H]^-。¹H-NMR(DMSO-d₆，300MHz)δ：7.26(2H，m)，7.37(1H，d，J＝2.7Hz)，7.44(2H，m)，9.86(1H，brs，OH).

实施例98-hydroxy-4-phenyl-5，2′-oxidoisoquinolone(C1)的合成

常温条件下，取三棱双苯内酯(8-hydroxy-4-pheny-5，2′-oxidoisocoumarin)(20mg，0.079mmol)加入25ml的三孔烧瓶中，加入5mlDMF使其溶解后，加入25～28％的氨水3ml，封闭三孔烧瓶，常温下反应3d，反应3d后，80℃下加热2h，反应液冷却至室温，加入10ml乙酸乙酯，用饱和食盐水萃取5次，每次3ml，除去DMF后，有机相中加入无水硫酸钠后放置过夜，除去干燥剂，减压回收溶剂，得到淡黄绿色粉末，得率90.1％。

分子式C₁₅H₉O₃N，HR-ESI-MS(m/z)：250.0496[M-H]^-。¹H-NMR(DMSO-d₆，300MHz)δ：6.80(1H，d，J＝8.7Hz)，7.05(2H，m)，7.25(2H，m)，7.56(1H，s)，7.82(1H，d，J＝7.5Hz)，11.7(1H，s)，12.3(1H，s).

实施例108，5′-dihydroxy-4-pheny-5，2′-oxidoisoquinolone(C2)的合成

按照实施例9所述，25mg(0.093mmol)三棱双苯内酯B(8，5′-dihydroxy-4-pheny-5，2′-oxidoisocoumarin)与4ml25～28％的氨水反应，得到黄绿色粉末，得率88.3％。

分子式C₁₅H₉O₄N，HR-ESI-MS(m/z)：266.0444[M-H]^-。¹H-NMR(DMSO-d₆，300MHz)δ：6.69(1H，dd，.J＝9.0Hz，2.4Hz)，6.79(1H，d，J＝8.7Hz)，6.90(1H，d，J＝9.0Hz)，7.09(1H，d，J＝2.4Hz)，7.21(1H，d，J＝8.7Hz)，7.37(1H，s)，9.31(1H，s)，11.6(1H，s)，12.2(1H，s).

实施例11本发明产物的体外抗炎作用研究

1细胞培养

RAW264.7细胞培养在含有10％的胎牛血清的DMEM完全培养基中，培养基中含有100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素。细胞在含有5％CO₂的37℃培养箱中培养。RAW264.7细胞呈单层贴壁生长，2～3天传代一次，0.25％胰酶消化传代。

2MTT法测定各化合物对巨噬细胞存活率影响

取对数生长期的RAW264.7细胞，以每孔1×10⁴个/孔将细胞接种于96孔板中，设四个复孔，培养20h后弃去培养液，加入含有不同浓度药物的培养基100μL，对照组加入含有0.2％DMSO的培养基100μL，空白组只加100μLDMEM培养基，培养24h，每孔加入浓度为5g/LMTT溶液20μL，继续培养4h后，弃去培养液，每孔加入150μLDMSO/孔终止反应，振荡10min使结晶完全溶解，用酶标仪于490nm波长测定光密度值(OD值)。计算存活率，存活率＝(实验组OD值-调零OD值)/(空白组OD值-调零OD值)。

3ELISA测定各化合物对巨噬细胞炎性因子释放量的影响

取对数生长期的RAW264.7细胞，以2×10⁴/孔的细胞密度接种于96孔板中，细胞培养4h后弃去培养液，PBS洗两遍，加入无血清的DMEM培养基培养20h。弃去板孔内液体，PBS洗两遍，将各待测药物与LPS或Pam3csk4共同加入刺激细胞。实验分设空白组(加入DMEM培养液)、LPS组(LPS1μg/mL)、药物加LPS组(各浓度药物+LPS1μg/mL)，Pam3csk4组(500ng/mL)，药物加Pam3csk4组和药物组(加入含各药物最大终浓度的DMEM培养液)，每组设3个复孔。加样后培养16h，分别收取上清液，ELISA法检测细胞上清液中TNF-α与IL-6的含量。操作步骤按试剂盒操作说明书进行。

4数据统计

采用GraphpadPrism5.0对数据分析进行单因素方差分析(analysisofvarianee，ANOVA)，采用SPSS17.0计算IC₅₀值，组间两两比较采用Student’sttest，p＜0.05有统计学意义。

5实验结果

5.1细胞毒性实验结果

MTT实验结果显示各化合物在一定浓度范围内对RAW264.7细胞形态无影响，即各化合物进行抗炎活性评价实验的最大试药浓度分别为：化合物A1、A3和A4均为10μM，化合物B1、B2和C1均为20μM，A2为50μM，C2为5μM。

5.2ELISA实验结果

分别用1μg/ml的LPS和500ng/ml的Pam3csk4分别刺激巨噬细胞，测定各化合物对细胞释放炎性因子TNF-α和IL-6含量的影响，评价化合物的抗炎活性。各化合物抑制LPS和Pam3csk4诱导的RAW264.7细胞释放TNF-α和IL-6的IC₅₀值见表1。

表1.各化合物抑制LPS和Pam3csk4分别刺激的RAW264.7细胞释放TNF-α和IL-6的IC₅₀值(μM)

Claims (2)

1.三棱双苯内酯(SanLengdiphenyllactone)以及三棱双苯内酯B(SparstoloninB)的衍生物在制备抗炎药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的三棱双苯内酯和三棱双苯内酯B的衍生物，其特征在于，结构式如下：

其中：

R₁＝OCH₃R₁＝OCOCH₃R₁＝OCOCH₂CH₂CH₃

或或

R₂＝H或OCH₃R₂＝H或OCOCH₃R₂＝H或OCOCH₂CH₂CH₃

R₃＝R₄＝OH或R₃＝OH，R₄＝H。