CN105145340B - 短雄花序板栗品种的分子育种方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种短雄花序板栗品种的分子育种方法，包括：1)以‘黑山寨7号’作为母本，具有优异性状的板栗种质资源作为父本，收集花粉对‘黑山寨7号’授粉；2)通过测序技术分析板栗基因在各杂交亲本间的序列差异，基于差异序列构建各杂交亲本的基因单倍型分子身份证；3)开发与板栗短雄花序性状相关的分子标记；4)利用上述构建的基因单倍型分子身份证以及与板栗短雄花序性状相关的分子标记，分别对F1代杂交苗进行筛选，从而获得既具有短雄花序基因又具有优异种质材料背景的杂交苗。本发明通过分子标记辅助选择与常规育种手段相结合的方式，实现在杂种F1代中快速聚合板栗短雄花序基因及其他优异基因的目的。

Description

短雄花序板栗品种的分子育种方法

技术领域

本发明涉及分子育种领域，具体地说，涉及一种短雄花序板栗品种的分子育种方法。

背景技术

板栗在北京市山区林果生产中占据着十分重要的地位，2010年的统计资料显示，板栗是最大栽培面积的树种，超过60万亩，产值达2.2亿元，占干果总产值的40％。板栗雄花序为柔荑花序，正常雄花序长17cm左右，花量极大，其消耗树体水分及营养的20-40％，是栗树低产的重要原因之一。因此，培育短雄花序板栗品种在板栗生产中具有重要意义。

在果树育种中，传统育种主要是根据植株在田间的表现进行评价与选择，但由于受到环境影响，选择准确度不高，且大多数性状需要多年后才能观察到，选择周期长。随着基因组学的飞速发展，植物分子育种在多种作物中得到应用研究，目前，鲜有板栗分子育种实践的相关报道。

发明内容

本发明的目的是借助分子育种手段加速筛选出优质高产短雄花序板栗新品种。

为了实现本发明目的，本发明的一种培育短雄花序板栗新品种的方法，包括以下步骤：

1)配置杂交组合：以板栗品种‘黑山寨7号’作为母本，选择具有优异性状的板栗种质资源作为父本，收集花粉对‘黑山寨7号’进行授粉，授粉过程中，无需对‘黑山寨7号’去雄及套袋(由于板栗自交结实率低且‘黑山寨7号’雄花序极短，花粉量少)，杂交获得F1代；

2)构建杂交亲本的基因单倍型分子身份证：通过测序技术分析板栗MYB转录因子基因在各杂交亲本间的序列差异，通过软件network(http://www.fluxus-engineering.com/)构建各杂交亲本单倍型，以核心SNP作为鉴定杂交亲本的“分子身份证”；

3)开发与板栗短雄花序性状相关的分子标记，具体过程如下：①人工分离群体与自然群体中板栗雄花序发育生长过程的观察及长度鉴定；②利用二代测序技术如RAD(Restriction site Associated DNA)开发新的分子标记，并利用分离群体与自然群体进行连锁与关联分析验证新标记和SNP标记与板栗短雄花序长度的相关性；③根据以上连锁分析及关联分析结果，将相关性极显著的SNP标记等作为筛选短雄花序性状的分子标记；

4)杂交苗的分子标记筛选：利用上述构建的杂交亲本的基因单倍型分子身份证以及开发的与板栗短雄花序性状相关的分子标记，分别对F1代杂交苗进行分子标记筛选，从而筛选到既具有纯合短雄花序基因又具有优异种质材料背景的杂交苗。

前述的方法，步骤1)中所述的优异性状包括防寒、矮化、短枝、耐短截、防褐变、早熟、大果等。

前述的方法，步骤1)中可将收集到的具有不同优异性状的板栗种质资源的花粉混合，对‘黑山寨7号’进行开放式人工授粉(无需去雄套袋)。

前述的方法，步骤2)中利用特异性PCR引物对I扩增各杂交亲本的MYB转录因子基因，通过测序比较板栗MYB转录因子基因在各杂交亲本间的序列差异；所述引物对I为：

1F：5′-AGGAGAGGCAGCGTTGGAGA-3′

1R：5′-GGTCTGCAGCCCATCTGCTCAA-3′

获得的核心SNP标记位于板栗MYB转录因子基因如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列上，其中，Y为C或T，R为A或G，S为C或G，N代表缺失突变。

前述的方法，步骤3)中用于PCR扩增所述与板栗短雄花序性状相关的分子标记的特异性引物对II为：

2F：5′-ACTTAGGCATTTAGCCATGTTTGG-3′

2R：5′-CTCCCACGACCACGGAAC-3′

步骤3)所述的SNP标记位于板栗如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列上，分别为A28G、G51A、A52C、A124G、A138G、A169T和T202C。

前述的方法，步骤1)中所述具有优异性状的板栗种质资源包括叶里藏、毛板栗、信阳5号、拖桌早熟、孙家营7号、遵达、柞板栗、大油栗、毛蒲、留山10号、九龙早熟、高家早熟、燕魁、柞县、中迟栗、暑处红、确罗32号、团结早熟、特早熟、遵玉、节节红、浅刺大板栗、青扎、光山2号、孙家营4号、宜良早熟、大板红、固始4号、六月暴、红栗、林谓2号、下村、下村1号、茅栗、羊毛栗、山东薄、七月红、正义大毛栗、张庄子三号、软刺早、大乌壳、山东红光、垂2、水富毛栗、宜良大板栗、罗山、油板栗、山东无花、南山4号、永平早熟、板优3号子代、确山27号等。优选特早熟、大油栗、固始四号。

前述的方法，构建的杂交亲本的基因单倍型分子身份证如下：

父本为大油栗：5′-CGATAAGAACCGGGGAGGAGGAAGGGAACAGTWRG-3′

父本为特早熟：5′-TGACAAGAACCGGGGAGGAGGAAGGGRACAGTTGG-3′

父本为固始四号：5′-CRATAAGAACCGGGGAGGAGGAAGGGAACAGTWGG-3′

其中，W代表A或T，R代表A或G。

本发明还提供与板栗短雄花序性状相关的SNP分子标记，利用北京百迈客生物科技有限公司研发的SLAF-seq(Specific-Locus Amplified Fragment Sequencing)技术对板栗短雄花遗传分离群体进行关联分析，获得与板栗短雄花紧密关联的分子标记。具体过程为：利用板栗基因组，通过bwa比对软件和GATK软件进行SNP识别。并对SNP进行过滤。过滤方法如下：首先过滤read支持度小于3的位点，然后过滤子代混池中与相应亲本的SNP类型差异的位点，最终得到高质量的可信SNP位点，并在此基础上识别两混池间差异的位点。最终利用混池间差异的位点进行关联分析。经过以上步骤的分析，筛选出显著富集关联位点的contig，其中，一个contig上在两混池间SNP位点，都与板栗短雄花表现出关联，因此该contig有非常大的概率与性状关联，根据该contig序列设计引物开发出与板栗短雄花序相关SNP分子标记。获得的与板栗短雄花序性状相关的SNP标记位于板栗如SEQ ID No.1所示核苷酸序列上，分别为A28G、G51A、A52C、A124G、A138G、A169T和T202C。

经传统育种手段培育的具有极短花序(长0.3-1.0厘米)的优系板栗品种‘黑山寨7号’已获得国家新品种保护，并且构建了以其为亲本之一的两个分离群体近500株。研究认为，细胞程序性死亡相关基因等可能与板栗短雄花序发育有关。本发明人同源克隆到板栗MYB转录因子基因。将上述基因在‘黑山寨7号’与其他正常雄花序品种中进行比较发现了SNP位点，值得一提的是，MYB转录因子基因在‘黑山寨7号’中为纯合，为筛选‘黑山寨7号’的杂交后代提供了便利。

本发明利用分离群体和自然群体，通过连锁分析和关联分析的方法来开发分子标记，通过分子标记辅助选择与常规育种手段相结合的方式，实现在杂种F1代中快速聚合板栗短雄花序基因及其他优异基因的目的。

本发明具有以下优点：

(一)本发明提供的培育短雄花序板栗新品种的方法为板栗分子育种实践研究提供借鉴。

(二)本发明采用开放式人工授粉，减少了杂交劳动量，提高了杂交效率，能够获得大量的杂种苗。

(三)本发明亲本基因单倍型分子身份证的建立能够在杂种苗后代中选择出特定父本的后代。

(四)本发明提供的与短雄花序显著相关的分子标记能够在F1代筛选到具有短雄花序基因的材料。

(五)本方法经过两轮分子标记筛选，能够在F1代筛选到既具有短雄花序基因且具有优异种质基因背景的杂种苗。

附图说明

图1为本发明实施例2-4中培育短雄花序板栗新品种的技术路线图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1与板栗短雄花序性状相关的分子标记的开发

利用北京百迈客生物科技有限公司研发的SLAF-seq(Specific-Locus AmplifiedFragment Sequencing)技术对板栗短雄花遗传分离群体进行关联分析，获得与板栗短雄花紧密关联的分子标记。具体过程为：利用板栗基因组，通过bwa比对软件和GATK软件进行SNP识别。并对SNP进行过滤。过滤方法如下：首先过滤read支持度小于3的位点，然后过滤子代混池中与相应亲本的SNP类型差异的位点，最终得到高质量的可信SNP位点，并在此基础上识别两混池间差异的位点。最终利用混池间差异的位点进行关联分析。经过以上步骤的分析，筛选出显著富集关联位点的contig，其中，一个contig上在两混池间SNP位点，都与板栗短雄花表现出关联，因此该contig有非常大的概率与性状关联，根据该contig序列设计引物开发出与板栗短雄花序相关分子标记。

用于PCR扩增所述与板栗短雄花序性状相关的SNP分子标记的特异性引物对II如下：

2F：5′-ACTTAGGCATTTAGCCATGTTTGG-3′

2R：5′-CTCCCACGACCACGGAAC-3′

获得的与板栗短雄花序性状相关的SNP标记位于板栗如SEQ ID No.1所示核苷酸序列上，分别为A28G、G51A、A52C、A124G、A138G、A169T和T202C。

实施例2培育兼具早熟型及短雄花序型板栗新品种的方法

所述方法包括以下步骤：

1)配置杂交组合：以板栗品种‘黑山寨7号’作为母本，选择‘特早熟’、‘大油栗’、‘固始四号’等优异种质资源作为父本，收集花粉混合后对‘黑山寨7号’进行授粉，授粉过程中，无需对‘黑山寨7号’去雄及套袋，用引物对I筛选真杂种，杂交获得F1代。

2)构建杂交亲本的基因单倍型分子身份证：利用特异性PCR引物对扩增各杂交亲本的MYB转录因子基因，通过测序比较板栗MYB转录因子基因在各杂交亲本间的序列差异；所述引物对I如下(由Life公司合成)：

1F：5′-AGGAGAGGCAGCGTTGGAGA-3′

1R：5′-GGTCTGCAGCCCATCTGCTCAA-3′

PCR扩增反应体系：模板DNA3μl，引物1F、1R各1μl，ddH₂O 7.5μl，Taq酶mix(北京博迈德生物技术有限公司)12.5μl，总体系25μl。

PCR扩增程序：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，72℃5min，32个循环；15℃∞。

通过测序技术分析板栗MYB转录因子基因在各杂交亲本间的序列差异，通过软件network构建各杂交亲本的基因单倍型。单倍型，即去除相同序列只保留SNP位点的具有识别亲本特性的序列，在本实施例中，突变位点分布于板栗MYB转录因子基因如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列上，其中，Y为C或T，R为A或G，S为C或G，N代表缺失突变。

其中，‘特早熟’、‘大油栗’、‘固始四号’单倍型“分子身份证”见表1。

表1父本单倍型分子身份证(5′-3′)

CGATAAGAACCGGGGAGGAGGAAGGGAACAGTWRG	大油栗
		TGACAAGAACCGGGGAGGAGGAAGGGRACAGTTGG	特早熟
CRATAAGAACCGGGGAGGAGGAAGGGAACAGTWGG	固始4号

表1中，W代表A或T，R代表A或G。

3)杂交苗的分子标记筛选：利用‘特早熟’单倍型分子身份证以及实施例1开发的与板栗短雄花序性状相关的分子标记，分别对F1代杂交苗进行分子标记筛选，从而筛选到106株既具有纯合短雄花序基因又具有早熟基因背景的杂交苗。

用途及意义：板栗雄花序为柔荑花序，正常雄花序长17cm左右，花量极大，其消耗树体水分及营养的20-40％，缩短板栗花序长度能够提高产量40％；为增加农民种植效益，满足广大消费者对板栗的消费需求，改变板栗市场上中晚熟品种集中上市的现状，可选育果品在中秋之前上市的早熟品种。因此，培育兼具早熟型及短雄花序型板栗新品种既能提高板栗产量又能增加种植收益。

实施例3培育兼具大果型及短雄花序型板栗新品种的方法

所述方法包括以下步骤：

1)配置杂交组合：以板栗品种‘黑山寨7号’作为母本，选择‘特早熟’、‘大油栗’、‘固始四号’等优异种质资源作为父本，收集花粉混合后对‘黑山寨7号’进行授粉，授粉过程中，无需对‘黑山寨7号’去雄及套袋，用引物I筛选真杂种，杂交获得F1代。

2)构建杂交亲本的基因单倍型分子身份证：同实施例2步骤2)。

3)杂交苗的分子标记筛选：利用‘大油栗’单倍型分子身份证以及实施例1开发的与板栗短雄花序性状相关的分子标记，分别对F1代杂交苗进行分子标记筛选，从而筛选到121株既具有纯合短雄花序基因又具有大果基因背景的杂交苗。

用途及意义：板栗雄花序为柔荑花序，正常雄花序长17cm左右，花量极大，其消耗树体水分及营养的20-40％，缩短板栗花序长度能够提高产量40％；大果型的板栗深受消费者以及加工企业的欢迎，大果型的板栗更易高产，种植效益更好。因此，培育兼具大果型及短雄花序型的板栗新品种既能提高板栗产量能够增加种植收益。

实施例4培育兼具抗虫耐储型及短雄花序型板栗新品种的方法

所述方法包括以下步骤：

1)配置杂交组合：以板栗品种‘黑山寨7号’作为母本，选择‘特早熟’、‘大油栗’、‘固始四号’等优异种质资源作为父本，收集花粉混合后对‘黑山寨7号’进行授粉，授粉过程中，无需对‘黑山寨7号’去雄及套袋，用引物I筛选真杂种，杂交获得F1代。

2)构建杂交亲本的基因单倍型分子身份证：同实施例2步骤2)。

3)杂交苗的分子标记筛选：利用‘固始四号’单倍型分子身份证以及实施例1开发的与板栗短雄花序性状相关的分子标记，分别对F1代杂交苗进行分子标记筛选，从而筛选到152株既具有纯合短雄花序基因又具有抗虫耐储基因背景的杂交苗。

用途及意义：板栗雄花序为柔荑花序，正常雄花序长17cm左右，花量极大，其消耗树体水分及营养的20-40％，缩短板栗花序长度能够提高产量40％。因此，培育兼具大果型及短雄花序型的板栗新品种既能提高板栗产量还能增加种植收益。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种短雄花序板栗品种的分子育种方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)配置杂交组合：以板栗品种‘黑山寨7号’作为母本，选择具有优异性状的板栗种质资源作为父本，收集花粉对‘黑山寨7号’进行授粉，授粉过程中，无需对‘黑山寨7号’去雄及套袋，杂交获得F1代；

2)构建杂交亲本的基因单倍型分子身份证：通过测序技术分析板栗MYB转录因子基因在各杂交亲本间的序列差异，通过差异序列构建各杂交亲本的基因单倍型分子身份证；

3)开发与板栗短雄花序性状相关的分子标记；

4)杂交苗的分子标记筛选：利用上述构建的杂交亲本的基因单倍型分子身份证以及开发的与板栗短雄花序性状相关的分子标记，分别对F1代杂交苗进行分子标记筛选，从而筛选到既具有纯合短雄花序基因又具有优异种质材料背景的杂交苗；

其中，步骤3)中开发的与板栗短雄花序性状相关的分子标记为SNP标记。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述的优异性状包括防寒、矮化、短枝、耐短截、防褐变、早熟、大果。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中将收集到的具有不同优异性状的板栗种质资源的花粉混合，对‘黑山寨7号’进行开放式人工授粉。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中利用特异性PCR引物对I扩增各杂交亲本的MYB转录因子基因，通过测序比较板栗MYB转录因子基因在各杂交亲本间的序列差异；所述引物对I为：

1F：5′-AGGAGAGGCAGCGTTGGAGA-3′

1R：5′-GGTCTGCAGCCCATCTGCTCAA-3′。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中用于PCR扩增所述与板栗短雄花序性状相关的分子标记的特异性引物对II为：

2F：5′-ACTTAGGCATTTAGCCATGTTTGG-3′

2R：5′-CTCCCACGACCACGGAAC-3′。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤3)所述的SNP标记的核苷酸序列如SEQID No.1所示。

7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述具有优异性状的板栗种质资源包括叶里藏、毛板栗、信阳5号、拖桌早熟、孙家营7号、遵达、柞板栗、大油栗、毛蒲、留山10号、九龙早熟、高家早熟、燕魁、柞县、中迟栗、暑处红、确罗32号、团结早熟、特早熟、遵玉、节节红、浅刺大板栗、青扎、光山2号、孙家营4号、宜良早熟、大板红、固始4号、六月暴、红栗、林谓2号、下村、下村1号、茅栗、羊毛栗、山东薄、七月红、正义大毛栗、张庄子三号、软刺早、大乌壳、山东红光、垂2、水富毛栗、宜良大板栗、罗山、油板栗、山东无花、南山4号、永平早熟、板优3号子代、确山27号。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述具有优异性状的板栗种质资源包括为特早熟、大油栗、固始4号。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤2)中构建的杂交亲本的基因单倍型分子身份证如下：

父本为大油栗：5′-CGATAAGAACCGGGGAGGAGGAAGGGAA CAGTWRG-3′

父本为特早熟：5′-TGACAAGAACCGGGGAGGAGGAAGGGRA CAGTTGG-3′

父本为固始四号：5′-CRATAAGAACCGGGGAGGAGGAAGGGA ACAGTWGG-3′

其中，W代表A或T，R代表A或G。

10.与板栗短雄花序性状相关的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。