CN105136967A - 用于鉴别贡菊和亳菊的反相薄层色谱方法 - Google Patents
用于鉴别贡菊和亳菊的反相薄层色谱方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种用于鉴别贡菊和亳菊的反相薄层色谱方法，具体步骤如下：以木樨草素、山柰酚、金合欢素为对照品，贡菊和亳菊乙醇溶液为供试品溶液，点于同一反相薄层板上，以甲醇和水为展开剂，展开后，取出，晾干，以三氯化铝乙醇溶液为显色剂，显色后，分别于波长365nm和254nm紫外光灯下进行检视鉴别。贡菊供试品在与木樨草素对照品相同位置上，显示较弱的荧光斑点或暗斑，在与山柰酚、金合欢素对照品相同位置上，不显示荧光斑点或暗斑；亳菊供试品在与木樨草素对照品相同位置上，显示较强的荧光斑点或暗斑，在与山柰酚、金合欢素对照品相同位置上，显示相同的荧光斑点或暗斑。此发明是首次采用反相薄层色谱法鉴别贡菊和亳菊，该鉴别方法专属性强，能够准确鉴别贡菊和亳菊。
Description
技术领域
本发明属中药药材鉴别技术领域，涉及一种用于鉴别贡菊和亳菊的反相薄层色谱方法。
背景技术
菊花为常用中药，也是常用饮品。商品菊花为菊科植物菊ChrysanthemummorifoliumRamat.的干燥头状花序。由于产地和加工方法不同，菊花商品药材又分为贡菊、亳菊、杭菊等，其中贡菊和亳菊均产于安徽省，为常见主流品种。由于商品品种和等级不同，市场销售各种菊花价格相差甚大，而又由于各种菊花商品外观性状差异的鉴别方法不易掌握，通常出现品种混杂、以次充好的现象。为保护广大消费者的利益，打击不法销售现象，研究开发一种用于鉴别贡菊和亳菊的方法例如反相薄层色谱方法，是具有重要意义的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种简单的方法来鉴别贡菊和亳菊。已经出人意料地发现，使用反相薄层色谱法来鉴别贡菊和亳菊，以木樨草素、山柰酚、金合欢素为指标成分，通过溶剂展开与显色等程序，可以容易地实现贡菊和亳菊的鉴别，达到准确使用药材的目的。本发明基于此发现而得以完成。
为此，本发明的一个方面提供了一种反相薄层色谱法鉴别贡菊和亳菊的方法，其包括以下步骤：
1)分别精密称取木樨草素、山柰酚、金合欢素对照品，加甲醇或乙醇溶液制成每1ml各含1～5mg(例如2～3mg)的溶液，作为对照品溶液；
2)取贡菊和亳菊药材粗粉适量，分别置于具塞锥形瓶中，加溶剂25ml，超声处理10～90分钟，滤过，将滤液在水浴上蒸干，残渣分别加甲醇或乙醇1ml溶解，制得贡菊和亳菊的供试品溶液；
3)用定量毛细管分别吸取上述1)制得的3种对照品溶液和2)制得的2种供试品溶液适量，依次点样于同一反相薄层板W/UV254的同一水平线不同位置上；
4)以甲醇和水、或乙醇和水以一定比例为展开剂，进行展开，展开后取出，晾干；
5)以5％三氯化铝乙醇溶液为显色剂，显色后，加热适当长时间，取出，放凉；
6)在364nm和/或254nm紫外灯光下观察，并比较色谱图中的荧光斑点(365nm紫外光灯下)和/或暗斑(254nm紫外光灯下)，以鉴别贡菊和亳菊；
7)结果判断：
正品的贡菊供试品在与木樨草素对照品相同Rf值位置上，(相对于木樨草素对照品斑点而言，下同)显示较弱的荧光斑点(365nm紫外光灯下)和/或暗斑(254nm紫外光灯下)，在与山柰酚、金合欢素对照品相同Rf值位置上，不显示荧光斑点(365nm紫外光灯下)和/或暗斑(254nm紫外光灯下)；
正品的亳菊供试品在与木樨草素对照品相同Rf值位置上，(相对于木樨草素对照品斑点而言，下同)显示较强的荧光斑点(365nm紫外光灯下)和/或暗斑(254nm紫外光灯下)，在与山柰酚、金合欢素对照品相同Rf值位置上，(相对于山柰酚、金合欢素对照品斑点而言，下同)显示相同的荧光斑点(365nm紫外光灯下)和/或暗斑(254nm紫外光灯下)；
如果标记为贡菊或亳菊的检测药材与上述相应正品药材不吻合，则该检测药材不是正品药材。
根据本发明的方法，所述步骤1)中所述甲醇或乙醇溶液是指将甲醇或乙醇与水以一定比例混合后制成的溶液，其中甲醇与水的体积比可以是10:90～100:0、乙醇与水的体积比可以是10:90～100:0；例如甲醇溶液或乙醇溶液的浓度为10％～100％，例如浓度为50％～90％，例如浓度为60％～90％。根据本发明的方法，所述步骤2)中所述药材粗粉可以是过20～100目筛的粉末(例如50-80目筛)；所述粗粉适量，可以是0.1～0.5g，例如0.2～0.3g；所述溶剂是指将甲醇或乙醇与水以一定比例混合后制成的溶液，其中甲醇与水的体积比可以是10:90～100:0、乙醇与水的体积比可以是10:90～100:0；例如甲醇溶液或乙醇溶液的浓度为10％～100％，例如浓度为50％～90％，例如浓度为60％～90％。
根据本发明的方法，所述步骤3)中所述取对照品溶液或供试品溶液适量，可以是1～10μl，例如1～5μl，例如1～3μl；所述反相薄层板W/UV254，可以是国产或进口的预制反相薄层板；
根据本发明的方法，所述步骤4)中所述甲醇和水、或乙醇和水以一定比例为展开剂，甲醇与水的体积比可以是10:90～100:0、乙醇与水的体积比可以是10:90～100:0，例如甲醇溶液或乙醇溶液的浓度为10％～100％，例如浓度为20％～90％，例如浓度为20％～80％；所述展开，可以是一次展开或二次展开。
根据本发明的方法，步骤4)中，所述5％三氯化铝乙醇溶液是三氯化铝用95％乙醇溶液配制成的溶液。
根据本发明的方法，所述步骤5)中所述加热，可以是烘箱加热，也可以是电吹风加热；加热温度控制在45～100℃，例如80～100℃；所述适当长时间可以是1～20分钟，例如2-10分钟，例如5分钟。
根据本发明的方法，其包括以下步骤：
1)对照品溶液的制备：
分别精密称取木樨草素、山柰酚、金合欢素对照品，置于10ml量瓶中，加50％～100％甲醇溶液(例如60％～90％甲醇溶液)或50％～100％乙醇溶液(例如60％～90％乙醇溶液)溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1ml含1～5mg(例如含2～3mg)的对照品溶液，备用；
2)药材供试品溶液制备：
用高速万能粉碎机对干燥的贡菊和亳菊药材分别进行粉碎，过60目筛得药材粉末；
精密称取贡菊、亳菊粉末0.1～1g(，例如0.2～0.3g)，分别置于具塞锥形瓶中，加50％～100％甲醇(甲醇占水溶液中体积比)或50％～100％乙醇(乙醇占水溶液中体积比)(例如甲醇溶液或乙醇溶液的浓度为50％～90％，例如浓度为60％～90％)25ml，超声处理30-50分钟，滤过，将滤液在水浴上蒸干，残渣分别加甲醇或乙醇1ml溶解，制得贡菊和亳菊的供试品溶液。
3)用定量毛细管分别吸取上述制得的3种对照品溶液和2种供试品溶液各2～10μl(例如1～5μl，例如1～3μl)，依次点样于同一反相薄层板W/UV254的同一水平线不同位置上。接着使用以下二次展开方法或者一次展开方法进行展开。
4)二次展开方法，按以下a～d方法操作：
a)取甲醇和水，按照体积比2：8混合均匀，得到展开剂I。将展开剂I置干燥洁净的双槽薄层色谱展开缸的第一个槽中；
b)将步骤3)的反相薄层板W/UV254，置于步骤a)的双槽薄层色谱展开缸第二个槽中，密闭缸盖，预饱和10-15分钟后，将上述双槽薄层色谱展开缸第一个槽中的展开剂转移到放有反相薄层板W/UV254的第二个槽中，进行第一次展开，展距10cm，结束展开，取出薄层板，晾干，完成第一次展开；
c)取甲醇和水，按照体积比6：4混合均匀，得到展开剂II。将展开剂II置干燥洁净的双槽薄层色谱展开缸的第一个槽中；
d)将步骤b)完成第一次展开的反相薄层板W/UV254，置于步骤c)的双槽薄层色谱展开缸第二个槽中，密闭缸盖，预饱和10-15分钟后，将上述双槽薄层色谱展开缸第一个槽中的展开剂转移到放有反相薄层板W/UV254的第二个槽中，进行第二次展开，展距10cm，结束展开，取出薄层板，晾干，完成第二次展开；
5)一次展开方法，按以下e～f操作：
e)取甲醇和水，按照体积比7：2混合均匀，得到展开剂。将展开剂置干燥洁净的双槽薄层色谱展开缸的第一个槽中；
f)将步骤3)的反相薄层板W/UV254，置于步骤e)的双槽薄层色谱展开缸第二个槽中，密闭缸盖，预饱和10-15分钟后，将上述双槽薄层色谱展开缸第一个槽中的展开剂转移到放有反相薄层板W/UV254的第二个槽中，进行展开，展距10cm，结束展开，取出薄层板，晾干；
6)配制显色剂：取5g三氯化铝(AlCl3)置于100ml量瓶中，用95％乙醇溶解并稀释至刻度，配制成5％AlCl3乙醇溶液显色剂，置于喷雾器中备用；
7)将显色剂均匀喷至步骤4)或步骤5)的反相薄层板W/UV254上，100℃加热5分钟，取出，放凉。按下述方法比较色谱图中的斑点鉴别贡菊和亳菊：
71)分别于365nm、254nm波长紫外灯下检视步骤7)的反相薄层板W/UV254，并比较色谱图中的荧光斑点(365nm紫外光灯下)或暗斑(254nm紫外光灯下)，以鉴别贡菊和亳菊；
72)正品的贡菊供试品在与木樨草素对照品相同Rf值位置上，显示较弱的荧光斑点(365nm紫外光灯下)或暗斑(254nm紫外光灯下)，在与山柰酚、金合欢素对照品相同Rf值位置上，不显示荧光斑点(365nm紫外光灯下)或暗斑(254nm紫外光灯下)；
73)正品的亳菊供试品在与木樨草素对照品相同Rf值位置上，显示较强的荧光斑点(365nm紫外光灯下)或暗斑(254nm紫外光灯下)，在与山柰酚、金合欢素对照品相同Rf值位置上，显示相同的荧光斑点(365nm紫外光灯下)或暗斑(254nm紫外光灯下)；
74)如果标记为贡菊或亳菊的检测药材与上述相应正品药材不吻合，则该检测药材不是正品药材。
本发明的优点在于：本发明方法不但可以用于贡菊或亳菊的区分性鉴别，还可以用于贡菊或亳菊的真伪性鉴别。本发明首次采用反相薄层色谱法鉴别贡菊和亳菊，方法操作简单，所使用的仪器设备和对照品普及性好，便于药材加工、销售企业和药品检验单位推广应用。
附图说明
图1为本发明实施例1中，反相薄层色谱鉴别方法色谱图(365nm紫外灯光)，图中1为正品贡菊，2为正品亳菊，3为木樨草素对照品，4为山柰酚对照品，5为金合欢素对照品；实施例2的365nm紫外灯光的结果与该基本相同。从图1可见，正品贡菊的木樨草素比木樨草素对照品斑点更弱，并且在山柰酚、金合欢素两处不显示斑点；但是正品亳菊的木樨草素比木樨草素对照品斑点更强，并且在山柰酚、金合欢素两处显示与对照品相同强度的斑点。
图2为本发明实施例1中，反相薄层色谱鉴别方法色谱图(254nm紫外灯光)，图中1为正品贡菊，2为正品亳菊，3为木樨草素对照品，4为山柰酚对照品，5为金合欢素对照品；实施例2的254nm紫外灯光的结果与该基本相同。从图2可见，正品贡菊的木樨草素比木樨草素对照品斑点更弱，并且在山柰酚、金合欢素两处不显示斑点；但是正品亳菊的木樨草素比木樨草素对照品斑点更强，并且在山柰酚、金合欢素两处显示与对照品相同强度的斑点。
具体实施方式
实施例1
反相薄层色谱法鉴别贡菊和亳菊的方法。
1)对照品溶液的制备：
分别精密称取木樨草素、山柰酚、金合欢素对照品，置于10ml量瓶中，加70％乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1ml含2.5mg的对照品溶液，备用；
2)药材供试品溶液制备：
用高速万能粉碎机对干燥的贡菊和亳菊药材分别进行粉碎，过60目筛得药材粉末；
分别精密称取贡菊、亳菊粉末0.25g，置于具塞锥形瓶中，加70％甲醇25ml，超声处理30分钟，滤过，将滤液在水浴上蒸干，残渣加甲醇1ml溶解，分别制得贡菊和亳菊的供试品溶液。
3)用定量毛细管分别吸取上述制得的3种对照品溶液和2种供试品溶液各2μl，依次点样于同一反相薄层板W/UV254同一水平线的不同位置上。
4)二次展开方法，按以下a～d方法操作：
a)取甲醇和水，按照体积比2：8混合均匀，得到展开剂I。将展开剂I置干燥洁净的双槽薄层色谱展开缸的第一个槽中；
b)将步骤3)的反相薄层板W/UV254，置于步骤a)的双槽薄层色谱展开缸第二个槽中，密闭缸盖，预饱和10-15分钟后，将上述双槽薄层色谱展开缸第一个槽中的展开剂转移到放有反相薄层板W/UV254的第二个槽中，进行第一次展开，展距10cm，结束展开，取出薄层板，晾干，完成第一次展开；
c)取甲醇和水，按照体积比6：4混合均匀，得到展开剂II。将展开剂II置干燥洁净的双槽薄层色谱展开缸的第一个槽中；
d)将步骤b)完成第一次展开的反相薄层板W/UV254，置于步骤c)的双槽薄层色谱展开缸第二个槽中，密闭缸盖，预饱和10-15分钟后，将上述双槽薄层色谱展开缸第一个槽中的展开剂转移到放有反相薄层板W/UV254的第二个槽中，进行第二次展开，展距10cm，结束展开，取出薄层板，晾干，完成第二次展开；
5)配制显色剂：取5g三氯化铝(AlCl3)置于100ml量瓶中，用95％乙醇溶解并稀释至刻度，配制成5％AlCl3乙醇溶液显色剂，置于喷雾器中备用；
6)将显色剂均匀喷至步骤4)的反相薄层板W/UV254上，100℃加热5分钟，取出，放凉。按下述方法比较色谱图中的斑点鉴别贡菊和亳菊：
分别于365nm、254nm波长紫外灯下检视，并比较色谱图中的荧光斑点(365nm紫外光灯下)或暗斑(254nm紫外光灯下)，以鉴别贡菊和亳菊。
贡菊供试品在与木樨草素对照品相同Rf值位置上，显示较弱的荧光斑点(365nm紫外光灯下)或暗斑(254nm紫外光灯下)，在与山柰酚、金合欢素对照品相同Rf值位置上，不显示荧光斑点(365nm紫外光灯下)或暗斑(254nm紫外光灯下)；
亳菊供试品在与木樨草素对照品相同Rf值位置上，显示较强的荧光斑点(365nm紫外光灯下)或暗斑(254nm紫外光灯下)，在与山柰酚、金合欢素对照品相同Rf值位置上，显示相同的荧光斑点(365nm紫外光灯下)或暗斑(254nm紫外光灯下)。本发明人已针对多批次正品贡菊和亳菊以及从市场购得的据称为贡菊和亳菊的样品使用本实施例和以下实施例进行了检测，均显示上述判断方法是准确的。
实施例2
反相薄层色谱法鉴别贡菊和亳菊的方法。
1)对照品溶液的制备：
分别精密称取木樨草素、山柰酚、金合欢素对照品，置于10ml量瓶中，加80％乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1ml含3mg的对照品溶液，备用；
2)药材供试品溶液制备：
用高速万能粉碎机对干燥的贡菊和亳菊药材分别进行粉碎，过60目筛得药材粉末；
分别精密称取贡菊、亳菊粉末0.3g，置于具塞锥形瓶中，加80％乙醇25ml，超声处理50分钟，滤过，将滤液在水浴上蒸干，残渣加甲醇醇1ml溶解，分别制得贡菊和亳菊的供试品溶液。
3)用定量毛细管分别吸取上述制得的3种对照品溶液和2种供试品溶液各1μl，依次点样于同一反相薄层板W/UV254同一水平线的不同位置上。
4)一次展开方法，按以下e～f操作：
e)取甲醇和水，按照体积比7：2混合均匀，得到展开剂。将展开剂置干燥洁净的双槽薄层色谱展开缸的第一个槽中；
f)将步骤3)的反相薄层板W/UV254，置于步骤e)的双槽薄层色谱展开缸第二个槽中，密闭缸盖，预饱和10-15分钟后，将上述双槽薄层色谱展开缸第一个槽中的展开剂转移到放有反相薄层板W/UV254的第二个槽中，进行展开，展距10cm，结束展开，取出薄层板，晾干；
5)配制显色剂：取5g三氯化铝(AlCl3)置于100ml量瓶中，用95％乙醇溶解并稀释至刻度，配制成5％AlCl3乙醇溶液显色剂，置于喷雾器中备用；
6)将显色剂均匀喷至步骤4)的反相薄层板W/UV254上，100℃加热5分钟，取出，放凉。按下述方法比较色谱图中的斑点鉴别贡菊和亳菊：分别于365nm、254nm波长紫外灯下检视，并比较色谱图中的荧光斑点(365nm紫外光灯下)或暗斑(254nm紫外光灯下)，以鉴别贡菊和亳菊。贡菊供试品在与木樨草素对照品相同Rf值位置上，显示较弱的荧光斑点(365nm紫外光灯下)或暗斑(254nm紫外光灯下)，在与山柰酚、金合欢素对照品相同Rf值位置上，不显示荧光斑点(365nm紫外光灯下)或暗斑(254nm紫外光灯下)；亳菊供试品在与木樨草素对照品相同Rf值位置上，显示较强的荧光斑点(365nm紫外光灯下)或暗斑(254nm紫外光灯下)，在与山柰酚、金合欢素对照品相同Rf值位置上，显示相同的荧光斑点(365nm紫外光灯下)或暗斑(254nm紫外光灯下)。
Claims (10)
1.反相薄层色谱法鉴别贡菊和亳菊的方法，其包括以下步骤：
1）分别精密称取木樨草素、山柰酚、金合欢素对照品，加甲醇或乙醇溶液制成每1ml各含1～5mg(例如2～3mg)的溶液，作为对照品溶液；
2）取贡菊和亳菊药材粗粉适量，分别置于具塞锥形瓶中，加溶剂25ml，超声处理10～90分钟，滤过，将滤液在水浴上蒸干，残渣分别加甲醇或乙醇1ml溶解，制得贡菊和亳菊的供试品溶液；
3）用定量毛细管分别吸取上述1）制得的3种对照品溶液和2）制得的2种供试品溶液适量，依次点样于同一反相薄层板W/UV254的同一水平线不同位置上；
4）以甲醇和水、或乙醇和水以一定比例为展开剂，进行展开，展开后取出，晾干；
5）以5%三氯化铝乙醇溶液为显色剂，显色后，加热适当长时间，取出，放凉；
6）在364nm和/或254nm紫外灯光下观察，并比较色谱图中的荧光斑点（365nm紫外光灯下）和/或暗斑（254nm紫外光灯下），以鉴别贡菊和亳菊；
7）结果判断：
正品的贡菊供试品在与木樨草素对照品相同Rf值位置上，(相对于木樨草素对照品斑点而言，下同)显示较弱的荧光斑点（365nm紫外光灯下）和/或暗斑（254nm紫外光灯下），在与山柰酚、金合欢素对照品相同Rf值位置上，不显示荧光斑点（365nm紫外光灯下）和/或暗斑（254nm紫外光灯下）；
正品的亳菊供试品在与木樨草素对照品相同Rf值位置上，(相对于木樨草素对照品斑点而言，下同)显示较强的荧光斑点（365nm紫外光灯下）和/或暗斑（254nm紫外光灯下），在与山柰酚、金合欢素对照品相同Rf值位置上，(相对于山柰酚、金合欢素对照品斑点而言，下同)显示相同的荧光斑点（365nm紫外光灯下）和/或暗斑（254nm紫外光灯下）；
如果标记为贡菊或亳菊的检测药材与上述相应正品药材不吻合，则该检测药材不是正品药材。
2.根据权利要求1的方法，所述步骤1）中所述甲醇或乙醇溶液是指将甲醇或乙醇与水以一定比例混合后制成的溶液，其中甲醇与水的体积比可以是10:90～100:0、乙醇与水的体积比可以是10:90～100:0；例如甲醇溶液或乙醇溶液的浓度为10%～100%，例如浓度为50%～90%，例如浓度为60%～90%。
3.根据权利要求1的方法，所述步骤2）中所述药材粗粉可以是过20～100目筛的粉末(例如50-80目筛)；所述粗粉适量，可以是0.1～0.5g，例如0.2～0.3g。
4.根据权利要求1的方法，所述步骤2）中，所述溶剂是指将甲醇或乙醇与水以一定比例混合后制成的溶液，其中甲醇与水的体积比可以是10:90～100:0、乙醇与水的体积比可以是10:90～100:0；例如甲醇溶液或乙醇溶液的浓度为10%～100%，例如浓度为50%～90%，例如浓度为60%～90%。
5.根据权利要求1的方法，所述步骤3）中所述取对照品溶液或供试品溶液适量，可以是1～10μl，例如1～5μl，例如1～3μl。
6.根据权利要求1的方法，所述步骤4）中所述甲醇和水、或乙醇和水以一定比例为展开剂，甲醇与水的体积比可以是10:90～100:0、乙醇与水的体积比可以是10:90～100:0，例如甲醇溶液或乙醇溶液的浓度为10%～100%，例如浓度为20%～90%，例如浓度为20%～80%。
7.根据权利要求1的方法，所述展开是一次展开或二次展开。
8.根据权利要求1的方法，步骤4）中，所述5%三氯化铝乙醇溶液是三氯化铝用95%乙醇溶液配制成的溶液。
9.根据权利要求1的方法，所述步骤5）中所述加热，可以是烘箱加热，也可以是电吹风加热；加热温度控制在45～100℃，例如80～100℃；所述适当长时间可以是1～20分钟，例如2-10分钟，例如5分钟。
10.根据权利要求1的方法，其包括以下步骤：
1）对照品溶液的制备：
分别精密称取木樨草素、山柰酚、金合欢素对照品，置于10ml量瓶中，加50%～100%甲醇溶液（例如60%～90%甲醇溶液）或50%～100%乙醇溶液（例如60%～90%乙醇溶液）溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1ml含1～5mg(例如含2～3mg)的对照品溶液，备用；
2）药材供试品溶液制备：
用高速万能粉碎机对干燥的贡菊和亳菊药材分别进行粉碎，过60目筛得药材粉末；
精密称取贡菊、亳菊粉末0.1～1g(，例如0.2～0.3g)，分别置于具塞锥形瓶中，加50%～100%甲醇（甲醇占水溶液中体积比）或50%～100%乙醇（乙醇占水溶液中体积比）(例如甲醇溶液或乙醇溶液的浓度为50%～90%，例如浓度为60%～90%)25ml，超声处理30-50分钟，滤过，将滤液在水浴上蒸干，残渣分别加甲醇或乙醇1ml溶解，制得贡菊和亳菊的供试品溶液；
3）用定量毛细管分别吸取上述制得的3种对照品溶液和2种供试品溶液各2～10μl(例如1～5μl，例如1～3μl)，依次点样于同一反相薄层板W/UV254的同一水平线不同位置上；接着使用以下二次展开方法或者一次展开方法进行展开；
4）二次展开方法，按以下a～d方法操作：
a）取甲醇和水，按照体积比2：8混合均匀，得到展开剂I；将展开剂I置干燥洁净的双槽薄层色谱展开缸的第一个槽中；
b）将步骤3）的反相薄层板W/UV254，置于步骤a）的双槽薄层色谱展开缸第二个槽中，密闭缸盖，预饱和10-15分钟后，将上述双槽薄层色谱展开缸第一个槽中的展开剂转移到放有反相薄层板W/UV254的第二个槽中，进行第一次展开，展距10cm，结束展开，取出薄层板，晾干，完成第一次展开；
c）取甲醇和水，按照体积比6：4混合均匀，得到展开剂II；将展开剂II置干燥洁净的双槽薄层色谱展开缸的第一个槽中；
d）将步骤b）完成第一次展开的反相薄层板W/UV254，置于步骤c）的双槽薄层色谱展开缸第二个槽中，密闭缸盖，预饱和10-15分钟后，将上述双槽薄层色谱展开缸第一个槽中的展开剂转移到放有反相薄层板W/UV254的第二个槽中，进行第二次展开，展距10cm，结束展开，取出薄层板，晾干，完成第二次展开；
5）一次展开方法，按以下e～f操作：
e）取甲醇和水，按照体积比7：2混合均匀，得到展开剂；将展开剂置干燥洁净的双槽薄层色谱展开缸的第一个槽中；
f）将步骤3）的反相薄层板W/UV254，置于步骤e）的双槽薄层色谱展开缸第二个槽中，密闭缸盖，预饱和10-15分钟后，将上述双槽薄层色谱展开缸第一个槽中的展开剂转移到放有反相薄层板W/UV254的第二个槽中，进行展开，展距10cm，结束展开，取出薄层板，晾干；
6）配制显色剂：取5g三氯化铝（AlCl3）置于100ml量瓶中，用95%乙醇溶解并稀释至刻度，配制成5%AlCl3乙醇溶液显色剂，置于喷雾器中备用；
7）将显色剂均匀喷至步骤4）或步骤5）的反相薄层板W/UV254上，100℃加热5分钟，取出，放凉；按下述方法比较色谱图中的斑点鉴别贡菊和亳菊：
71）分别于365nm、254nm波长紫外灯下检视步骤7）的反相薄层板W/UV254，并比较色谱图中的荧光斑点（365nm紫外光灯下）或暗斑（254nm紫外光灯下），以鉴别贡菊和亳菊；
72）正品的贡菊供试品在与木樨草素对照品相同Rf值位置上，显示较弱的荧光斑点（365nm紫外光灯下）或暗斑（254nm紫外光灯下），在与山柰酚、金合欢素对照品相同Rf值位置上，不显示荧光斑点（365nm紫外光灯下）或暗斑（254nm紫外光灯下）；
73）正品的亳菊供试品在与木樨草素对照品相同Rf值位置上，显示较强的荧光斑点（365nm紫外光灯下）或暗斑（254nm紫外光灯下），在与山柰酚、金合欢素对照品相同Rf值位置上，显示相同的荧光斑点（365nm紫外光灯下）或暗斑（254nm紫外光灯下）；
74）如果标记为贡菊或亳菊的检测药材与上述相应正品药材不吻合，则该检测药材不是正品药材。
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