CN105132455A - 通过过量表达原人参二醇合成酶基因提高人参发根中人参皂苷含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种通过过量表达人参原人参二醇合成酶基因提高人参发根中人参皂苷含量的方法。该方法利用植物双元表达载体pBI121质粒，在该表达载体强启动子CaMV35S下游插入人参原人参二醇合成酶基因D12H，构建人参基因D12H植物过量表达载体pBI121-D12H重组质粒，将重组质粒pBI121-D12H通过发根农杆菌转化人参根片，诱导生成人参皂苷产量提高的发根系Pg-pBI121-D12H。实现了通过过量表达人参皂苷合成关键酶基因提高人参皂苷含量的目的，为获得高产人参皂苷的人参发根系奠定基础。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及人参原人参二醇合成酶基因D12H，植物过量表达载体pBI21-D12H，一种通过过量表达人参基因D12H使人参发根中人参皂苷含量提高的方法。
背景技术
人参是药用植物，具有补脾益肺，安神明目等多种功效。人参中的主要生理活性物质为人参皂苷，人参皂苷为人参的次生代谢物质，具有广泛的药理活性，对多种疾病有显著的疗效，人参皂苷具有很高的药用价值。但是，人参皂苷的主要来源是从植物体中提取，现在野生的人参非常稀少，人工栽培的人参生长周期长，人参培育过程遭到病虫的危害也较多，影响了人参培育的品质，自然生长的人参中人参皂苷的含量较低，这些因素都限制了人参皂苷的开发与利用。近些年来国内外的学者通过组织培养、生物转化、微生物合成等方法进行人参皂苷合成研究，均取得了一定的研究成果。基因工程等技术的发展与应用，对进行人参品种改良和人参的种质资源创新具有重要意义。上世纪八十年代，首次成功诱导人参产生发根，获得的人参发根，生长稳定，生长速度快，为基因工程改良人参品质以提高人参皂苷含量奠定了基础。近几年对人参皂苷的合成途径不断进行研究，成功的确定和克隆出人参皂苷合成过程中的关键酶基因，人们利用代谢工程和基因工程手段对这些关键酶基因进行处理，调控人参皂苷合成途径，以获得的更多的人参皂苷。
目前，已经确认的多种人参单体皂苷，其中三萜类皂苷为主要成分。研究表明，人参皂苷的共同前体为2，3-氧化角鲨烯，其通过多种酶的共同作用生成种类众多的单体皂苷。其生物合成路线为甲羟戊酸(MVA)途径生成的IPP及其异构化的DMAPP在牛儿基焦磷酸合成酶(GPS)作用下首先形成牛儿基焦磷酸(GPP)，接着利用法尼基焦磷酸合成酶(FPS)转化成法尼基焦磷酸(FPP)，又在鲨烯合成酶(SS)等的作用下合成鲨烯，然后经鲨烯环氧酶(SE)催化转变为2，3-氧化鲨烯。2，3-氧化角鲨烯流向三条不同的代谢途径，其一是在达玛烯二醇合成酶、原人参二醇合成酶的作用下生成达玛烷型皂苷；其二是在β-香树素合成酶的作用下生成齐墩果烷型皂苷；另一条在环阿乔醇合成酶的作用下合成植物甾醇。在众多人参皂苷中只有一种齐墩果烷型皂苷-Ro，其他人参单体皂苷均为达玛烷型皂苷，因此，达玛烷型人参皂苷合成酶基因为关键酶基因，其表达水平决定人参皂苷的含量。
发明内容
本发明首先克隆人参原人参二醇合成酶(或称达玛烯二醇12-羟化酶，Dammarenediol-12-hydroxylase，D12H)基因D12H，构建人参基因D12H过量表达载体，对人参进行遗传转化，诱导出人参发根，通过对人参发根中人参皂苷含量的分析，证明过量表达人参原人参二醇合成酶基因D12H可提高人参中主要人参三萜类皂苷的含量。
本发明利用植物双元表达载体pBI121质粒，该表达载体有强启动子CaMV35S，该启动子由TATA盒、CAAT盒、倒转重复序列和增强子核心序列四部分组成。
构建人参基因D12H植物过量表达载体pBI121-D12H重组质粒。
将重组质粒pBI121-D12H转化发根农杆菌A4，获得工程菌A4-pBI121-D12H。
利用植物过量表达工程菌A4-pBI121-D12H侵染人参根片，诱导出过量表达D12H且人参皂苷产量提高的人参发根系Pg-pBI121-D12H，从而实现通过过量表达人参皂苷合成关键酶基因从而提高人参皂苷含量的目的。
附图说明
图1是人参基因D12HPCR扩增后电泳图。
图2是重组质粒pBI121-D12H的菌落PCR鉴定电泳图。
图3是重组质粒pBI121-D12H双酶切鉴定电泳图。
图4是过量表达工程菌A4-pBI121-D12H菌落PCR电泳图。其中：
1：A4-pBI121-D12H；2：阴性对照组。
图5是诱导成功的人参发根Pg-pBI121-D12H。
图6是人参发根Pg-pBI121-D12H的鉴定图。其中：1：Pg-pBI121-D12H的NPTⅡ扩增；2：pBI121的NPTⅡ扩增。
图7是人参皂苷标准品HPLC图。
图8是对照组人参发根与过量表达组人参发根Pg-pBI121-D12H人参皂苷含量对比图。其中：a：对照组；b：过量表达组Pg-pBI121-D12H。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所用的各种试剂盒、酶均购于宝生物工程(大连)有限公司，pBI121植物双元表达载体，大肠杆菌JM109购于北京鼎国生物制品有限公司。
实施例1：构建人参基因D12H植物过量表达载体pBI121-D12H
(1)D12H基因引物设计与合成
根据GenBank已登录的原人参二醇合成酶基因(JN604536)的序列，利用PrimerPremier5.0软件设计人参基因D12H上下游引物，并在上下游引物5’端分别添加酶切位点BamHI和SacI，上下游引物如下：
D12H-BamHI-F：5’-CGGGATCCATGGCAGCAGCAATGGTG-3’
D12H-SacI-R：5’-CGAGCTCTTAATTGTGGGGATGTAGAT-3’
引物由武汉金开瑞生物有限公司合成。
(2)D12H基因的扩增
以人参发根(吉林大学生物与农业工程学院生物工程系实验室保存)为原材料，按照RNA提取试剂盒的操作说明提取人参的总RNA，使用反转录试剂盒经反转录获得cDNA。以cDNA为模板，以D12H-BamHI-F，D12H-SacI-R为引物扩增人参D12H基因。PCR扩增反应体系(25μl体系)：模板RT-PCR产物1μl；10×Buffer2.5μl；dNTPMix1μl；上游引物1μl；下游引物1μl；TaqDNA聚合酶0.2μl；ddH2O18.3μl。
PCR仪扩增程序设定是：1)94℃，8min；2)94℃，30s；3)60℃，30s；4)72℃，1min；5)72℃，8min；6)4℃，保存。循环从2)到4)，循环数32个。PCR扩增结束后，对产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，获得了1461bp的人参D12H基因片段，如图1所示在1461bp左右有特异性目的条带与人参D12H基因的长度相同，说明成功的扩增了人参D12H基因。人参基因D12H的碱基序列(1461bp)参见序列表。
(3)人参过量表达载体pBI121-D12H重组质粒的构建
使用pBI121质粒构建人参D12H基因的过量表达载体。pBI121是双元植物表达载体，片段长度为14kb。含有组成型启动子CaMV35S，启动子下游有可用于插入基因片段的多克隆位点。抗性选择标记基因为新霉素磷酸转移酶基因NPTII，表现为卡那霉素抗性，可对重组质粒、组织或植株进行抗性筛选。
提取pBI121质粒进行过量表达载体的构建，对人参D12H基因克隆时已经在目的片段两端添加了酶切位点BamHI和SacI，pBI121质粒中也存在同样的酶切位点。对目的基因片段和pBI121质粒进行双酶切。质粒酶切反应体系：20μl体系，pBI121质粒5μl；BamHI(15U/μl)1μl；SacI(15U/μl)1μl；0.5×KBuffer1μl；ddH2O12μl。目的基因D12H酶切反应体系：20μl体系，D12H基因1μl；BamHI(15U/μl)1μl；SacI(15U/μl)1μl；0.5×KBuffer1μl；ddH2O16μl。酶切反应条件：温度，37℃；时间，3h。充分酶切后，进行1％的琼脂糖凝胶电泳检测，使用切胶回收试剂盒回收酶切产物。
在T4DNA连接酶的作用下对经过双酶切后切胶回收的pBI121质粒和双酶切后的D12H基因进行连接。连接反应体系：20μl体系，D12H酶切产物12μl；pBI121酶切产物1μl；10×DNALigaseBuffer2μl；T4DNALigase1μl；ddH2O4μl。反应条件：16℃连接过夜。本连接体系中所选择的酶切后的质粒与目的基因摩尔比为10：1。
将上述连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞中。转化实验方法如下：取出在-70℃保存的JM109感受态细胞，放在冰浴中使其融化；取100μl感受态细胞，加入上述连接产物，放置于1.5ml离心管中，冰浴30min；将离心管放在42℃水浴锅中，热激90s，迅速冰浴5min；向离心管中加入800μl无抗生素的LB液体培养基，混匀。置于培养箱中37℃，200rpm振荡培养2h。培养结束后，8000rpm离心1min，移去上清液，用100μlLB液体培养基回溶；将菌液涂布在含有50mg/L卡那霉素的LB固体培养基上，37℃培养16h；挑取上述转化的单菌落，接种到含有50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃、200rpm振荡培养过夜。
重组质粒的鉴定：挑取单菌落进行菌落PCR鉴定，先对上述经过培养的菌液进行重组质粒的PCR鉴定，以菌液为模板，PCR反应体系、反应程序同上述的D12H基因扩增。菌落PCR产物电泳结果如图2所示，泳道1出现了预期的目的条带，初步说明了挑取的单菌落为阳性过量表达重组质粒，基因连接到了质粒上。对菌液进行质粒提取，提取的质粒使用BamHⅠ和SacⅠ对其进行双酶切鉴定，结果图3所示，泳道1可明显看出在1461bp左右有条带，与目的基因D12H的长度相符合，即在阳性菌种的质粒中成功切下了D12H，说明了成功构建了过量表达载体pBI121-D12H。
实施例2：过量表达工程菌的构建及人参的遗传转化
(1)感受态发根农杆菌A4制备
1)挑取经过活化的发根农杆菌A4，接种于10mlYEB液体培养基中，培养过夜；2)取菌液1ml，按1：100的比例加入YEB液体培养基，28℃振荡培养，至OD600值为0.5；3)取2)中菌液2ml于无菌离心管中，5000rpm离心5min，移去上清液；4)加500μl0.15mol/LCaCl2，悬浮沉淀，10000rpm离心1min，移去上清；5)加500μl0.15mol/LCaCl2，悬浮沉淀，冰浴中放置20min；6)5000rpm离心5min，移去上清；7)加入200μl预冷的20mmol/LCaCl2悬浮沉淀，冰浴中保存备用。
(2)重组质粒pBI121-D12H转化发根农杆菌A4
采用冻融法将重组质粒pBI121-D12H转入A4感受态细胞中。取10μlpBI121-D12H重组质粒加入到含100μlA4感受态细胞的离心管中，混匀，冰浴放置30min；将离心管立即用液氮冷冻5min；然后38℃水浴10min；加入YEB液体培养基1ml，28℃、150rpm振荡培养8小时；接种于含卡那霉素YEB固体培养皿中，28℃暗培养3天，挑取菌落做菌落PCR鉴定，如图4所示，泳道1中可以看到清晰的条带，片段大小约为1461bp，与D12H基因的长度相符，所以挑取的菌落为阳性工程菌，命名为A4-pBI121-D12H，泳道2没有特异性条带，2为阴性菌落。
(3)人参的遗传转化
选取三年生的人参(购于吉林省万良镇)作为本实验的诱导材料。人参根用水冲去泥沙，再用肥皂水清洗，用试管刷刷洗人参表面，去除残留泥沙；将洗干净的人参根放入70％乙醇，浸泡消毒15min。再放入0.1％的升汞中浸泡消毒5min，消毒完成后用灭菌蒸馏水清洗三次，以除去残留的溶液。在超净工作台上用接种刀将除菌后的人参根，切成3mm厚的薄片。将根片放在MS固体培养基中，25℃预培养2天；用灭菌棉签蘸取适量的工程菌A4-pBI121-D12H，涂抹到经过预培养人参根片切面处。经过诱导的根片接种到含有卡那霉素(50mg/L)和头孢唑林钠(400mg/L)的MS固体培养基上。人参发根诱导成功，用接种刀切下人参发根根尖，转接到含有卡那霉素(50mg/L)和头孢唑林钠(400mg/L)MS固体培养基，每周转接一次，经过4次转接后得到除菌的人参发根。除菌后的人参发根，转接到MS液体培养基中，使发根快速生长，得到D12H过量表达的人参发根系Pg-pBI121-D12H，如图5所示。
(4)人参遗传转化的鉴定
提取转化成功的过量表达人参发根系Pg-pBI121-D12H的总RNA，反转录生成cDNA。由于过量表达基因D12H属于同源转化，人参本身含有D12H，不能用于检测，所以使用表达载体上的特殊基因进行鉴定分析。本发明使用的检测基因为pBI121质粒上携带的新霉素磷酸转移酶基因(NPTⅡ)，NPTⅡ片段长度为795bp。以cDNA为模板，用NPTⅡ的扩增引物，进行PCR反应。新霉素磷酸转移酶基因(NPTⅡ)碱基序列(795bp)参见序列表：
NPTⅡ引物：
上游引物：5’-ATGATTGAACAAGATGGAT-3’
下游引物：5’-TCAGAAGAACTCGTCAAGA-3’
分别以Pg-pBI121-D12HcDNA和pBI121质粒为模板，用NPTⅡ的扩增引物，进行PCR反应。反应体系为25μl，PCR仪扩增程序设定是：1)94℃，8min；2)94℃，30s；3)45℃，30s；4)72℃，50s；5)72℃，8min；6)4℃，保存。循环从2)到4)，循环数32个。PCR产物电泳鉴定结果如图6所示，泳道1和泳道2均可见条带，泳道1为以Pg-pBI121-D12HcDNA，泳道2为以pBI121质粒为模板进行PCR扩增产生的条带，两条条带大小一致，均为795bp左右，证明工程菌A4-pBI121-D12H诱导人参根片取得成功，质粒的T-DNA区已经整合到植物中，即得到了带有过量表达基因D12H的人参发根系。
(5)人参发根皂苷含量测定
1)采取超声提取法提取人参皂苷，步骤如下：
将发根放在坩埚中置于电热鼓风干燥箱中，45℃烘干3h。用杵将烘干的人参发根研磨，充分研磨后过40目筛，放置于干燥箱在备用。精确称取经过研磨的粉末1.0g，按1：10倍的料液比加入70％的乙醇，摇床上振荡浸提24h；浸提后，在40℃，用40Khz超声波提取30min。超声提取3次，合并抽滤液；经旋转蒸发得浸膏，浸膏用10ml水溶解；向其中加入等体积的乙醚脱脂，倒入分液漏斗中分层，保留水相，脱脂2次；上述水相用10ml水饱和正丁醇萃取，萃取3次，合并水饱和正丁醇萃取相；加入10ml蒸馏水除糖，弃去水相；经过旋转蒸发得到纯化的人参皂苷，用适量甲醇溶解后，定容到10ml，4℃保存备用。
2)人参发根单体皂苷(Rg1，Re，Rb1)含量测定
采用高效液相色谱法测定人参发根样品人参单体皂苷Rg1，Re，Rb1的含量。
对标准品和样品做HPLC测定，洗脱条件：流动相：乙腈(A)，0.05％磷酸水溶液(B)，流速：0.8ml/min，检测波长：203nm，柱温：35℃，上样量：20μl。洗脱程序见下表。
人参皂苷标准品HPLC测定结果如图7所示，在20min时出现了人参皂苷Rg1的色谱峰，Re在20.5min时出现色谱峰，而Rb1的出峰时间为35min。
用相同的洗脱体系对过量表达组人参发根Pg-pBI121-D12H和对照组人参发根人参皂苷提取液进行高效液相色谱检测，进样量为20μl，结果如图8所示。计算皂苷含量，相比对照组，过量表达组人参皂苷Rg1、Re、Rb1含量分别提高了30.95％、32.36％、68.75％，其中Rb1的含量增加幅度最大。说明过量表达人参原人参二醇合成酶基因D12H是一种有效的提高人参发根中人参皂苷含量的方法，并为获得高产人参皂苷的人参发根系奠定基础。
Claims (2)
1.一种通过过量表达人参原人参二醇合成酶基因提高人参发根中人参皂苷含量的方法，该方法是：利用植物双元表达载体pBI121质粒，该表达载体有强启动子CaMV35S，该启动子由TATA盒、CAAT盒、倒转重复序列和增强子核心序列四部分组成；构建人参基因D12H植物过量表达载体pBI121-D12H重组质粒，将重组质粒pBI121-D12H通过发根农杆菌转化人参根片，诱导生成人参皂苷产量提高的发根系Pg-pBI121-D12H，从而实现通过过量表达提高人参皂苷含量的目的。
2.根据权利要求1所述的一种通过过量表达人参原人参二醇合成酶基因提高人参发根中人参皂苷含量的方法，其特征在于：所述的人参基因D12H植物过量表达载体pBI121-D12H是在pBI121质粒强启动子CaMV35S下游插入人参基因D12H，是可以高效表达人参原人参二醇合成酶基因D12H的重组质粒载体。
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