CN105123701A - 一种桑叶消毒药物组合物和制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种桑叶消毒药物组合物和制备方法及其应用。所述药物组合物包括浓度为1500～50mg/L的二溴海因和浓度为5g/L的磷酸三钠。本发明利用二溴海因和磷酸三钠的组合获得应用于桑叶消毒的药物组合物，不仅能很好地发挥二溴海因具有低腐、刺激小、高效的特点，而且通过其与磷酸三钠合理比例的配伍，获得了溶解度理想、扩大二溴海因的杀菌范围的有益效果。从而，可以实现利用较低浓度的二溴海因就可以起到桑叶消毒的作用，降低用药成本。本发明所述药物组合物应用方法简单，应用效果良好。

Description

一种桑叶消毒药物组合物和制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及桑蚕病虫害防治技术领域，更具体地，涉及一种桑叶消毒药物组合物及其应用。

背景技术

种桑养蚕在我国历史悠久，产茧量和产丝量目前占世界的80％左右。养蚕生产中因蚕病危害的损失在10％以上，在一些养蚕新区甚至达到20％以上。而蚕病的发生，大都是由于蚕吃了污染了病原微生物的桑叶所致。研究发现家蚕微粒子孢子存活期长，能在灰尘、土壤、水流中存活7～8年(张培芬等，2010)，且野外昆虫易对桑叶造成污染(张碧君，2014)，因此在蚕病防控上如何有效地减少和预防桑叶的污染尤为重要。桑叶洗消是蚕种行业普遍采用的最有效和最直接的防病技术。采用桑叶清洗消毒的方法，可切断桑叶病原传播(周菊珍，2013)。目前桑蚕生产实践中，桑叶洗消主要是使用有效氯浓度为0.3％～0.5％的消毒液浸泡1～3龄的小蚕桑叶10min，漂洗干净，自然晾干后喂食(张培芬，2010)；在4龄眠时第1天使用“防微灵”进行叶面喷雾，后每隔3d喷药一次，直至结茧(钱永华等，2001)。此外，根据桑园预警情况，可用0.3％～0.35％有效氯漂白粉液直接进行桑园桑叶的叶面消毒(苏建，2014)。但目前生产中使用的叶面消毒剂主要为漂白粉、漂粉精和强氯精等，在对桑叶进行喷雾或清洗消毒过程中，该类叶面消毒剂腐蚀性强，易破坏桑叶叶质、降低桑叶口感，且影响蚕农健康，污染环境(杨琼，2009)。

因此，蚕业生产上需要一种消毒效果可靠、安全、杀菌谱广、对环境污染小、对消毒物品损坏小的消毒剂。随着目前对消毒剂研究水平的不断提高，通过与其他学科的结合，研制出新型高效的复方消毒剂成为了一种研究趋势。消毒作为蚕业生产过程中不可或缺的重要环节，实现消毒剂的专业化和功能化，使其高效、广谱、稳定、低成本亦是未来研究的重要方向。

发明内容

本发明要解决的技术问题是针对桑蚕病虫害防治方面消毒剂的技术不足，提供一种桑叶消毒的药物组合物。

本发明的要解决的另一技术问题提供所述药物组合物的制备方法。

本发明还一要解决的技术问题是提供所述药物组合物的应用。

本发明的目的通过下述技术方案予以实现：

提供一种药物组合物，所述药物组合物包括浓度为1500～50mg/L的二溴海因和浓度为5g/L的磷酸三钠。

优选地，所述药物组合物包括浓度为1500mg/L的二溴海因和浓度为5g/L的磷酸三钠。

本发明同时提供所述药物组合物的制备方法，包括如下步骤：

S01.准备好含磷酸三钠的浓度为5g/L的溶液1000mL；

S02.按比例称取二溴海因，将二溴海因在S1所述溶液中完全溶解。

本发明同时提供所述药物组合物的应用，应用操作包括以下步骤：

S11.取新鲜采摘的桑叶，将采摘的新鲜桑叶在所述药物组合物中以浸泡或者浸洗的方式进行叶面消毒；

S12.将消毒后的桑叶取出放置自然晾干或阴干后，饲喂家蚕。

优选地，所述饲喂家蚕的给桑叶的时间为：从四龄起蚕开始饲喂，连续饲喂8～12日，直至家蚕上蔟，每日给桑2～3次。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明利用二溴海因和磷酸三钠组合在一起成为桑叶消毒的药物组合物，不仅发挥二溴海因具有低腐、刺激小、高效的特点，而且通过其余磷酸三钠合理比例的配伍，获得了溶解度理想的消毒溶液，调节二溴海因溶液的pH，扩大了二溴海因的杀菌范围。从而，可以实现利用较低浓度的二溴海因就可以起到桑叶消毒的作用，降低用药成本。

本发明所述药物组合物应用方法简单，应用效果良好，只需要采用药物浸洗或漂洗的方式对桑叶进行叶面清洗消毒处理，就可以显著降低或预防桑叶病原微生物对家蚕的感染，对家蚕病虫害防治具有较好的效果，而且避免了对养蚕设备的损坏，不会对养蚕环境产生污染，对家蚕的正常生长和人类身体健康不会造成影响及危害。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

一、生物材料

1、病原：家蚕微孢子虫(NosemabombycisNaegeli)孢子、球孢白僵菌(Beauveriabassiana(Bals.)Vuill.)、苏云金芽孢杆菌猝倒亚种(Bacillusthuringiensissubsp.sottoIshiwata)芽孢、黑胸败血病菌(Bacillusbombyseptieus)芽孢、家蚕质型多角体病毒(BombyxmoriCytoplasmicPolyhedrosisVirus，BmCPV)、家蚕核型多角体病毒(BombyxmoriNuclearPolyhedrosisVirus，BmNPV)均系华南农业大学蚕学实验室历年保存菌种。

2、实验材料蚕由广东省蚕业技术推广中心提供，蚕品种为：932·芙蓉×7532·湘晖。

本领域技术人员也可以采用其他来源的病原和蚕品种及来源，并不因此限定本发明范围。

二、供试药品

二溴海因、磷酸三钠：均为市售成品化学试剂。二溴海因(C₅H₆Br₂N₂O₂，含量97％；Lot.#11410148，上海晶纯生化科技股份有限公司)，磷酸三钠(天津市大茂化学试剂厂)，自行配置成目的浓度消毒液。中和剂：使用PBS配置的1％硫代硫酸钠与1％吐温-80的混合液。

实施例1本发明药物组合物对家蚕细菌病病原菌、白僵菌分生孢子的杀灭试验

采用悬液定量法杀灭细菌病病原菌，具体步骤如下：

1.配制含不同浓度的二溴海因的药物组合物，为免赘述，本实施例以含二溴海因浓度分别为1500mg/L、1000mg/L、500mg/L、200mg/L、50mg/L的药物组合物为例说明。具体为：

二溴海因浓度为1500mg/L的药物组合物的制备方法：

S01.准备好含磷酸三钠的浓度为5g/L的溶液1000mL；

S02.称取二溴海因1.5g，将二溴海因在S1所述溶液中完全溶解。

二溴海因浓度为1000mg/L的药物组合物制备方法参照上述，具体是称取二溴海因1.0g完全溶解于磷酸三钠浓度为5g/L的水溶液1000mL中。

二溴海因浓度为500mg/L的药物组合物：称取二溴海因0.5g，完全溶解于含磷酸三钠浓度为5g/L的水溶液1000mL中。

二溴海因浓度为200mg/L的药物组合物：称取二溴海因0.2g完全溶解于含磷酸三钠浓度为5g/L的水溶液1000mL中。

二溴海因浓度为50mg/L的药物组合物：称取二溴海因0.05g完全溶解于含磷酸三钠浓度为5g/L的水溶液1000mL中。

使用4℃冰箱保存的菌株配制实验所用菌悬液，苏云金杆菌芽孢悬液、黑胸败血病菌芽孢悬液浓度为1×10⁸～5×10⁸cfu/mL，白僵菌悬液浓度为1×10⁷cfu/mL。取消毒试验用无菌大试管，先加入0.5mL试验用菌悬液，再加入0.5mL有机干扰物，混匀，置20℃水浴中5min后，用无菌吸管吸取上述不同浓度药物组合物4.0mL注入其中。

(1)待试验菌与药物组合物相互作用至30min后，分别吸取0.5mL试验菌与消毒剂混合液加于4.5mL经灭菌处理后的中和剂中，混匀。

(2)各管试验菌与药物组合物混合液加中和剂作用10min后，分别吸取20uL样液，按活菌培养计数方法测定存活菌数，每管样液进行三组平行试验。平板上生长的菌落数较多时，需进行系列10倍稀释后，再进行活菌培养计数。

(3)同时用稀释液代替药物组合物，进行平行试验，作为感染不处理组(阴性对照组)。以不作任何处理的作为空白对照。将涂布完成的培养基标记，封口。

(4)放入37℃温箱中培养，培养24h统计各培养基的菌落数。试验重复3次，计算各组的活菌浓度(cfu/mL)，并换算为对数值(N)，然后按公式2-3计算杀灭对数值：

KL＝No-Nx(2-3)

式中：

KL为杀灭对数值；

N_O为对照组平均活菌浓度的对数值；

N_X为试验组活菌浓度对数值；

计算杀灭对数值时，取小数点后两位值，进行数字修约。如果消毒试验组消毒处理后平均生产菌落数，小于等于1时，其杀灭对数值，即大于等于对照组平均活菌浓度的对数值。

(7)实验结果

表1本发明药物组合物对黑胸败血病菌芽孢处理30min的杀菌对数值

注：同行的数据后右上角不同数字表示相互间差异性显著(P＜0.05)。

随着二溴海因浓度的增加，对黑胸败血病菌芽孢的杀灭效果增强，同稀释液处理的阴性对照组比，具有显著性差异(P＜0.05)，即试验的五个浓度对家蚕黑胸败血病菌芽孢均有杀灭效果。但使用二溴海因浓度为1500mg/L的药物组合物进行消毒，杀菌对数值均小于1，二溴海因浓度为1000mg/L时，药物组合物对家蚕黑胸败血病菌芽孢的杀菌对数值为0.78，使用二溴海因浓度为200mg/L和50mg/L的消毒剂进行杀菌，所计算出的杀菌对数值的差异性不显著，在该范围内，随着二溴海因浓度的增加，杀菌能力变化较小。

表2本发明药物组合物对苏云金杆菌芽孢处理30min的杀菌对数值

注：同行的数据后右上角不同数字表示相互间差异性显著(P＜0.05)。

统计结果显示，处理相同的时间，随着二溴海因浓度的增加，杀菌对数值增加，杀菌效果增强，按二溴海因浓度从高到低5种消毒剂对苏云金杆菌芽孢的杀菌对数值分别为0.66，0.61，0.39，0.31，0.24，说明5种浓度的二溴海因消毒剂对家蚕苏云金杆菌芽孢都具有杀灭效果。二溴海因浓度为200mg/L的消毒剂同二溴海因浓度为50mg/L的消毒剂的杀菌对数值具有显著性差异(P＜0.05)，消毒剂对苏云金杆菌芽胞具有良好的杀灭效果。

表3本发明药物组合物对白僵菌分生孢子处理30min的杀菌对数值

注：同行的数据后右上角不同数字表示相互间差异性显著(P＜0.05)。

经二溴海因浓度为1500mg/L的药物组合物处理30min后，培养基上均无白僵菌的菌落出现，其杀菌对数值即大于等于对照组平均活菌浓度的对数值，二溴海因浓度为1500mg/L的消毒剂同其他浓度的消毒剂比较分析，差异性显著(P＜0.05)，杀菌效果明显。5种二溴海因浓度的本发明药物组合物，杀菌对数值同稀释液处理的阴性对照相比，差异性显著(P＜0.05)，即对白僵菌分生孢子均有杀灭效果，随着二溴海因浓度的增加，杀菌对数值的增长明显，杀菌效果明显增强。

实施例2本发明药物组合物对多角体病毒、家蚕微孢子虫孢子的杀灭试验

(1)配制二溴海因浓度分别为1500mg/L，1000mg/L，500mg/L，200mg/L，50mg/L的药物组合物。

(2)取消毒试验用无菌大试管，分别先加入4℃冰箱内保存的试验用悬液0.5mL，病毒多角体悬液、家蚕微孢子虫孢子悬液浓度分别为10⁹个/mL、1×10⁹个/mL，再加入0.5mL有机干扰物，混匀，置20℃水浴中5min后，用无菌吸管吸取上述浓度药物组合物4.0mL注入其中，迅速混匀，密封放置，标记。

(3)待各试验悬液与不同浓度的二溴海因消毒剂相互作用至30min后，分别吸取0.5mL试验悬液与消毒剂混合液加于4.5mL经灭菌的中和剂中，混匀，密封放置，标记。

(4)待各管试验悬液与消毒剂混合液经加中和剂作用10min后，将中和后的混合液均匀地涂抹于直径2cm的圆形桑叶背面，每片圆叶涂抹50μL混合液，每区50头2龄起蚕，每区喂饲涂抹混合液的圆叶6片，共7区。

(5)用水代替消毒剂，进行平行试验，作为感染不处理组(阴性对照组)，以不作任何处理的作为空白对照组。

(6)待蚕将以上涂抹混合液的桑叶食尽后，改喂普通无菌桑叶。

根据各种蚕病潜伏期的长短，在25～27℃下饲养观察一定时间(一般核型多角体病5d，质型多角体病10d，家蚕微孢子虫孢子9d，饥饿1d，期间出现病死蚕应及时调查确认，并及时清除)，饲养过程中随时观察蚕体的生长发育情况，做好病蚕的隔离消毒工作，防止交叉感染。根据各种病的发病症状并结合显微镜进行逐条检查，记录发病蚕头数。计算各组发病率，然后按公式2-4计算灭活率：

试验重复3次，计算平均灭活率。

(7)实验结果

表4二溴海因消毒剂对质型多角体病毒处理30min的杀灭效果

注：阴性对照为感染不处理组，空白对照为不作任何处理组。

由表4可知，浓度为1500mg/L的二溴海因消毒剂对家蚕质型多角体病毒的灭活率为45％，并不能达到很好的杀灭效果，随着二溴海因浓度的增加，家蚕质型多角体病毒的发病率不断降低，灭活率不断的升高，5种浓度的二溴海因消毒剂对家蚕质型多角体病毒杀灭效果显著(P＜0.05)，该消毒剂对质型多角体病毒具有很好的杀灭效果。

表5药物组合物对核型多角体病毒处理30min的杀灭效果

注：阴性对照为感染不处理组，空白对照为不作任何处理组。

三组重复实验表明，含二溴海因浓度为1500mg/L的消毒剂对核型多角体病毒的灭活率低于50％，但对核型多角体病毒的杀灭具有剂量关系，随着浓度的增加，对多角体病毒的杀灭效果增强，且在二溴海因浓度为50mg/L的药物组合物对核型多角体病毒仍具有杀灭作用。

表6二溴海因消毒剂对微孢子虫孢子处理30min的杀灭效果

注：阴性对照为感染不处理组，空白对照为不作任何处理组。

由表6可知，使用二溴海因浓度为1500mg/L的药物组合物，灭活率可达到100％，杀灭效果远远高于药物对照组，通过荧光显微镜对杀灭效果进行观察时发现，该浓度下，对微孢子虫孢子浓度为10⁹个/mL菌液作用5min，视野中的微孢子虫孢子即全部是橙色，说明微孢子虫孢子已被完全杀灭。二溴海因浓度为1000mg/L的消毒剂处理30min，对家蚕微孢子虫孢子的灭活率即可达到90％以上。且5种二溴海因的试验浓度与阴性对照组都具有显著性差异(P＜0.05)，说明5种浓度的药物组合物对家蚕微孢子虫孢子均具有杀灭效果。

实施例3药物组合物浸泡桑叶前后叶绿素的测定试验

配制二溴海因浓度为1500mg/L，1000mg/L，500mg/L，200mg/L，50mg/L的药物组合物，取新鲜采摘的桑叶，在桑叶上取五点并标记，测量其叶绿素的含量，将测量后的桑叶浸泡在二溴海因浓度不同的消毒剂中浸泡5min，10min，20min，30min，60min，取出擦干桑叶表面残留的消毒剂，在标记的5点测取桑叶的叶绿素含量，以水浸泡的桑叶为阴性对照组。结果如表7所示。

表7药物组合物浸泡桑叶不同时间桑叶叶绿素的含量

注：阴性对照组为水浸泡处理。

由表7可知，在浸泡5min时，二溴海因处理组以及阴性对照组的叶绿素都有下降的过程，叶绿素并无太大不同。在处理5min到60min这段时间里，叶绿素的含量变化均小于1，浸泡时间对桑叶中叶绿素的影响小，且不同浓度的二溴海因浸泡桑叶，桑叶的叶绿色含量并无明显的变化，桑叶叶绿素的含量同二溴海因并无剂量关系，处理时间的长短对桑叶叶绿素含量的影响不显著(P＞0.05)，该消毒剂可用作桑叶的清洗消毒。

实施例4药物组合物的使用对家蚕安全性评价

正常饲养家蚕至四龄起蚕后分区，每区饲养50头蚕，进行连续添食试验。试验共6区，其中3区分别用浓度为1500mg/L，1000mg/L，500mg/L二溴海因消毒剂，1区为使用1500mg/L的消毒剂1L，加入1g烟酸诺氟沙星可溶性粉(蚕用)混均而成的混配液A，设水处理为阴性对照，以不作任何处理的作为空白对照组。将采摘后新鲜的桑叶在相应的溶液中清洗，取出放置自然晾干后给桑，直至家蚕上簇，每区喂饲桑叶量应保持一致。收集家蚕生长发育以及茧质的相关数据。结果见表8和表9。

表8连续饲喂采用本发明药物组合物清洗的桑叶的家蚕生长发育的调查

注：混配消毒剂A为使用二溴海因1500mg/L的消毒剂1L加入1g烟酸诺氟沙星可溶性粉(蚕用)混匀而成，各组数据为50头家蚕的平均数。

连续饲喂含二溴海因浓度为1500mg/L的药物组合物，混配液A清洗的桑叶四龄眠蚕体重，熟蚕体重与空白对照相比，药物组合物并不会降低家蚕生长发育，混配液A清洗的桑叶连续饲喂家蚕，家蚕的食桑量减少，食欲减退，且龄期延长。使用二溴海因的消毒剂连续饲喂家蚕，同空白对照相比，龄期无变化，二溴海因浓度为1000mg/L，500mg/L的消毒剂清洗桑叶饲喂家蚕，家蚕的各项指标同空白对照组比无显著性差异(P＞0.05)，可用于桑叶清洗后连续饲喂家蚕。

表9连续饲喂采用本发明药物组合物清洗后的桑叶家蚕茧质的调查

注：混配消毒剂A为使用二溴海因1500mg/L的消毒剂1L加入1g烟酸诺氟沙星可溶性粉(蚕用)混匀而成，各组数据为50头家蚕的平均数，结果表示为平均数±标准差。

连续饲喂含二溴海因浓度为1500mg/L的药物组合物，混配消毒剂A，家蚕的全茧量，茧层量同空白对照相比，具有显著性差异(P＜0.05)，但茧层率并无显著性差异(P＞0.05)，含二溴海因浓度为1500mg/L的药物组合物处理桑叶，家蚕全茧量、茧层量同空白对照相比增加，而混配消毒剂A处理，家蚕全茧量、茧层量较空白对照相比减小。二溴海因浓度为1000mg/L，500mg/L的消毒剂清洗桑叶饲喂家蚕，茧质同空白对照相比，并无显著性差异(P＞0.05)，使用二溴海因消毒剂清洗桑叶连续饲喂家蚕，家蚕的茧质并不会下降。

使用含二溴海因浓度为1500mg/L的药物组合物处理30min，或者使用含二溴海因浓度为1000mg/L的药物组合物处理60min，对白僵菌分生孢子的处理即可达到100％的杀灭效果；含二溴海因浓度为1500mg/L的药物组合物对微孢子虫孢子的杀灭效果达到100％。观察发现，经本发明药物组合物处理后的黑胸败血病菌聚集性增强、苏云金杆菌芽孢伴孢晶体减少，白僵菌分生孢子、微孢子虫孢子的外部褶皱增多，折光性降低，质型病毒多角体、核型病毒多角体的外部不光滑，形状改变。综合实施例的结果来看，本发明将二溴海因和磷酸三钠组合在一起进行桑叶洗消，对家蚕黑胸败血病菌芽孢、苏云金杆菌芽孢、白僵菌分生孢子、质型多角体病毒、核型多角体病毒、微孢子虫孢子均表有不同程度的杀灭效果，可以起到防治家蚕病原微生物的作用，且对桑叶叶绿素含量的影响小，不会降低家蚕的生长发育与茧质。因此本发明的药物组合物可以作为蚕种生产上桑叶叶面消毒洗消药物。

Claims (10)

1.一种桑叶消毒药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括浓度为1500～50mg/L的二溴海因和浓度为5g/L的磷酸三钠。

2.根据权利要求1所述桑叶消毒药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括浓度为1500mg/L的二溴海因和浓度为5g/L的磷酸三钠。

3.权利要求1或2所述桑叶消毒药物组合物的应用，其特征在于，应用于为桑叶叶面消毒，杀灭桑叶叶面病原菌。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述病原菌为家蚕黑胸败血病菌芽孢、苏云金杆菌芽孢和/或白僵菌分生孢子。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用操作包括以下步骤：

S11.取新鲜采摘的桑叶，将采摘的新鲜桑叶在所述药物组合物中以浸泡或者浸洗的方式进行叶面消毒；

S12.将消毒后的桑叶取出放置自然晾干或阴干后，饲喂家蚕。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述饲喂家蚕的给桑叶的时间为：从四龄起蚕开始饲喂，连续饲喂8～12日，直至家蚕上蔟，每日给桑2～3次。

7.权利要求1或2所述桑叶消毒药物组合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S01.准备好含磷酸三钠的浓度为5g/L的溶液1000mL；

S02.按比例称取二溴海因，将二溴海因在S1所述溶液中完全溶解。

8.权利要求7所述制备方法制备得到的桑叶消毒药物组合物。

9.权利要求8所述桑叶消毒药物组合物的应用，其特征在于，应用于为桑叶叶面消毒，杀灭桑叶叶面病原菌。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述病原菌为家蚕黑胸败血病菌芽孢、苏云金杆菌芽孢和/或白僵菌分生孢子。