CN105121453A

CN105121453A - 类伽腺苷的稳定固体形态

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Publication number: CN105121453A
Application number: CN201480020987.1A
Authority: CN
Inventors: 帕里德·克里斯蒂; 伊拉希·山鲁佐德·雷扎; 朱塞佩·瓜齐; 玛利亚·阿吉西
Original assignee: Poli Industria Chimica SpA
Current assignee: Poli Industria Chimica SpA
Priority date: 2013-04-11
Filing date: 2014-04-10
Publication date: 2015-12-02
Anticipated expiration: 2034-04-10
Also published as: EP3760637A2; WO2014167046A1; EP2789624B1; EP2984099A1; CN105121453B; HK1201841A1; EP2789624A1; ES2837751T3; US10144756B2; US20160024137A1; EP3760637A3

Abstract

本申请公开了一种制备下式的类伽腺苷(Regadenoson)的非晶形的方法可以在温和的反应条件下制备类伽腺苷(Regadenoson)非晶形，其具有高化学纯度(>99.6％)，而且在加热时具备高稳定性。还公开了一种热力学尤其稳定的类伽腺苷(Regadenoson)的无水结晶形，其不仅当25℃下暴露于90％的相对湿度(RH)96小时时，而且当加热升温至200℃时具有高稳定性。

Description

类伽腺苷的稳定固体形态

本发明涉及用于作为药物中活性剂的有机化合物的合成。特别地，本发明涉及一种制备稳定固体形态的类伽腺苷(Regadenoson)的方法及由其获得的形态。

发明背景

多态性现象是由于相同的物质可能会以不同的结晶形态(多晶形)进行组织，与溶剂分子进行结晶(氢氧化物和溶剂化物)或无周期性的固化(无定形物)而产生的。

即使是相同物质的不同结晶或非晶形相，也可能具有不同的化学、物理和机械特性，而且如果是活性药物，还具有不同的生物有效性和治疗效率。而且，不同结晶或非晶形相的相同产物可能存在不同的化学稳定性特性。

WO00/078779中首次描述了类伽腺苷(以登记号：313348-27-5鉴定的化合物)，其具有下面的结构式：

该化合物是一种负责调节心肌血流的A_2A腺苷受体激动剂，其通过血脉舒张冠状动脉并增加血流到心肌。类伽腺苷用作心脏成像助剂，其中，在给药显影剂之前，冠状动脉被扩张，然后通过观察由此产生的图像，可以进行可能的冠状动脉疾病(CAD)的诊断。

该化合物被描述为具有不同的多晶形，被鉴定为多晶形A、B、C和D以及非晶形。

这些固体状态的稳定性是关键的，以便允许以制备级合成该化合物。通过文献数据已知，公开于US8106183中的多晶形A，和公开于WO2012149196中的多晶形D，是更稳定的多晶形，而且是优选的固体状态，其中能分离类伽腺苷并用于制剂用途。

更详细地，US8106183中公开了多晶形A、B、C和非晶形。本专利中，晶形通过X射线衍射光谱学(XRD光谱学)、差示扫描量热法数据(DSC)的方式定义；还给出了制备方法。

类伽腺苷多晶形A被鉴定为是一种水合物形态；可以通过从质子溶剂(例如乙醇或乙醇/水混合物)或从极性溶剂(例如二甲亚砜/水)结晶类伽腺苷来生产这种结晶形。US8106183的作者将类伽腺苷A形鉴定为在环境温度以及低于相对湿度应力条件直至它的熔点(通过DSC鉴定为194.5℃)时比多晶形B和C更稳定。

多晶形B、C和非晶形被称作固体状态，其不能被容易地制备和/或被证明是不稳定的。通过在真空和环境温度下，蒸发溶于三氟乙醇的类伽腺苷溶液制备B形。但是，由于X射线扰乱了宽峰，US8106183的发明人不能确定它的结构，该多晶形包含可变的水分含量，不能重复进行可靠的制备。通过将乙腈中的类伽腺苷在60℃匀浆一段长时间来制备多晶形C。该多晶形显示独特的X射线谱，但是被证明是可变的氢氧化物，在高温下不稳定。

在US8106183中，类伽腺苷的非晶形的制备方法被描述为通过在200℃加热多晶形A；这种固体状态，与多晶形A-C不同，作者没有通过X射线衍射谱以鉴定可能特征性的halo-峰(宽峰)进行描述。根据US8106183，通过在该物质的熔点值之上加热多晶形A(对于多晶形A是194.5℃)制备该非晶形。这种方法工业上是不适用的，其导致形成几种副产品。本发明人已经发现，这种热处理导致色谱纯度降低大约30％和样品颜色的改变(类伽腺苷多晶形A是白色物质，但是在190℃-200℃热处理以后颜色变成棕色)。就我们所知，这是唯一描述用于制备非晶形类伽腺苷的方法。

WO2012149196中公开D形在惰性条件下是稳定的。该形包含按重量计0.8％到1.7％的结合水，而且显示可用于给药的溶液制品，如肠胃外的溶液。在该参考文献中也公开了通过类伽腺苷的完全新的合成来制备D形。合并纯度＞99％的类伽腺苷HPLC级分，并浓缩成糊状物。倒出上清液，将烧瓶在油浴中，在20mmHg的还原压力下，于150℃加热6小时产生D形。

这些文献数据表明仅仅多晶形A和D被鉴定为稳定化合物，但是，对于它们的储藏条件和处理必须考虑一些预防措施。

在制药工业中强烈需要工业上简便的类伽腺苷的稳定固体形态的制备方式。也需要把非晶形转变为热力学上更稳定的多晶形的简便方法。

而且，强烈需要有效的固体形态的类伽腺苷，其在正常大气条件下，尤其是在潮湿条件下是稳定的，不需要在受控制的大气或惰性条件下储存它们，同时在处理和成本方面具有明显的优势。

本发明通过提供一种制备类伽腺苷多晶形和将它转变为新的稳定固体形态的方法，克服了类伽腺苷的多晶形的稳定性的技术问题。

发明内容

我们已经意外地发现，可以在温和的反应条件中制备高化学纯度(>99.6％)的类伽腺苷非晶形，而且其在保护的大气下加热(即80℃)直至96小时是稳定的；此外，当在80℃下储存高达96小时时，以及当以25℃/90％RH暴露于水分高达96小时时，这种固体状态在干燥条件下不产生降解产物。这种非晶形的制备方法不需要极端的反应温度(即US81906183中描述的200℃)，而且可用于工业制备的用途。

在本发明的另一个实施方案中，类伽腺苷非晶形可用于制备其他两种稳定的溶剂化物多晶形，在本文中被命名为类伽腺苷E形(具有1分子三氟乙醇的溶剂化物)和类伽腺苷F形(具有0.5分子乙醇的溶剂化物)。

在一个另外的实施方案中，还有一种尤其热力学稳定的无水结晶形类伽腺苷，在本文中被命名为G形，可以通过在无水乙醇中回流60-90小时从非晶形类伽腺苷制备。类伽腺苷G形的特征为大约265℃的融合吸热峰(通过DSC确定)和特征性的XRD谱。还可以通过长反应时间的直接沉淀从包含乙醇和甲胺的无水反应混合物方便地分离类伽腺苷G形。通常，通过将非晶形类伽腺苷转变为热力学更稳定晶体无水G形来制备G形。

至于非晶形类伽腺苷，这3种新的多晶形在干燥条件下，在80℃下，高达96小时是稳定的，而且不产生降解产物。而且，在湿润条件下(即25℃/90％RH)，这些新的多晶形不产生降解产物。最后我们已经意外地发现，如果与多晶形A-F和非晶形相比较，类伽腺苷多晶形G的结晶相也显示不平常的高稳定性：实际上，多晶形G不仅当在25℃下暴露于90％RH96小时是稳定的，而且当升温至200℃时也是稳定的。

合成方案1中报道了制备本发明非晶形类伽腺苷的合成途径。在该反应方案中，按照WO00/78779、WO2007092372和Niiya，Kazunori等(药物化学杂志(JournalofMedicinalChemistry),35(24),4557-61；1992)中描述的相同方法，把2-卤素腺苷(Hal＝氯或碘)转变成化合物2。

从化合物2到非晶形类伽腺苷的合成步骤是本发明的一个目的，研发该步骤以便直接在温和条件下从反应混合物获得高化学纯度的该固体非晶形的沉淀。

方案1.类伽腺苷的合成途径

现在结合上文的描述并通过附图和实施例来公开本发明。

附图中：

图1：类伽腺苷非晶形的XRD；

图2：类伽腺苷晶形F(具有乙醇的溶剂化物形态)的XRD；

图3：类伽腺苷晶形E(具有三氟乙醇的溶剂化物形态)的XRD；

图4：类伽腺苷G形(无水形态)的XRD；

图5：类伽腺苷A形的XRD(现有技术)；

图6：类伽腺苷非晶形的差示扫描量热法数据；

图7：类伽腺苷G形(无水形态)的差示扫描量热法数据；

图8：类伽腺苷非晶形的稳定性数据：在80℃、惰性环境下96小时以后XRD；

图9：类伽腺苷晶形F(具有乙醇的溶剂化物形态)的稳定性数据∶在80℃、惰性环境下96小时以后XRD；

图10：类伽腺苷E形(具有三氟乙醇的溶剂化物形态)的稳定性数据∶在80℃、惰性环境下96小时以后XRD。

图11：类伽腺苷G形(无水形态)的稳定性数据∶在80℃、惰性环境下96小时以后XRD。

图12：类伽腺苷G形(无水形态)的稳定性数据∶在25℃/90％RH下96小时以后XRD。

发明详述

根据本发明，关于上述方案1，用于制备非晶形类伽腺苷的方法包括以下步骤：

a)使2-(4-乙氧基羰基吡唑-1-基)腺苷(化合物2)与甲胺溶于线性或分支C₁-C₄醇的干溶液反应，提供反应混合物；

b)在包括60℃-100℃的温度下，在压力反应器中，持续搅拌所述反应混合物，以将化合物2转变为(1-{9-[(4S,2R,3R,5R)-3,4-二羟基-5-(羟甲基)草脲胺-2-基]-6-氨基嘌呤-2-基}吡唑-4-基)-N-甲基氨甲酰胺(类伽腺苷，化合物3)；

c)从所述反应混合物除去未反应的甲胺；

d)以1℃-2℃/min的冷却速率，把来自步骤c)的所述反应混合物冷却至10℃-25℃；

e)用干C₁-C₄醇1:1稀释来自步骤d)的所述反应混合物，提供非晶形(1-{9-[(4S,2R,3R,5R)-3,4-二羟基-5-(羟甲基)草脲胺-2-基]-6-氨基嘌呤-2-基}吡唑-4-基)-N-甲基氨甲酰的沉淀；

f)过滤步骤e)的所述非晶形沉淀以进行分离，如果需要

g)干燥所述沉淀。

在下面的说明中，2-(4-乙氧基羰基吡唑-1-基)腺苷也被命名为乙基1-{9-[(4S,2R,3R,5R)-3,4-二羟基-5-(羟甲基)草脲胺-2-基]-6-氨基嘌呤-2-基}吡唑-4-羰酸盐，并相应于上述方案1中的化合物2。

在下面的说明中，(1-{9-[(4S,2R,3R,5R)-3,4-二羟基-5-(羟甲基)草脲胺-2-基]-6-氨基嘌呤-2-基}吡唑-4-基)-N-甲基氨甲酰是类伽腺苷，并相应于上述方案1中的化合物3。

在压力反应器中持续搅拌步骤a)的反应混合物。压力例如在大约1Bar-5Bar范围内。

优选地，进行步骤b)中的反应，直至完全转变为类伽腺苷。反应时间可取决于反应条件、使用的溶剂、反应物浓度。典型地，反应进行大约20-40小时。

C₁-C₄醇是甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、正丁醇、仲丁醇、叔丁醇。乙醇是优选的，更优选干(绝对)乙醇。

根据反应物浓度、所希望的速度和根据反应环境和设备的其他考虑，选择反应温度。这些条件可以由本领域普通技术人员设定。例如，化合物2甚至在0.1M下室温时是可溶的，而在0.5M下，在80℃才发生溶解。在任何情况下，反应也在悬浮液中发生。

可用任何常规方法除去步骤c)中未反应的甲胺，例如，通过在真空下大约30℃-60℃或者在正常压力下大约40℃蒸馏。

步骤e)中使用的醇优选前面步骤中使用的相同的醇。

干燥最终产物是一般操作，不需要详细解释。例如，可以在真空中50℃-80℃下干燥48-96小时，优选在惰性环境下。

根据本发明的一个优选的实施方案，使用无水乙醇进行反应，而且乙醇中甲胺的浓度包括10w/w到40％w/w，优选33％w/w。反应化合物中化合物2的摩尔浓度包括0.5M到0.1M，优选0.25M。优选的反应温度包括大约3Bar的工作压力下，在80℃-85℃之间大约30小时的反应时间。

在本发明的一个优选实施方案中，通过在40℃、真空下蒸馏(大约15％反应体积被蒸馏)除去甲胺，在20℃-25℃冷却反应混合物，用无水乙醇1:1稀释反应混合物，在20℃-25℃下持续搅拌反应混合物30分钟–60分钟，通过过滤回收沉淀，来进行反应(步骤c)-g))的激发。有利地，这种激发允许同时获得高化学纯度的非晶形类伽腺苷。真空中60℃下干燥湿产物72小时，以提供非晶形类伽腺苷。

非晶形可以通过本领域普通技术人员熟知的标准技术鉴定。

XRD谱的鉴定峰具有6个卤素：P1(4.0402,32％,宽度大约2.0002)、P2(14.0802,33％,宽度大约3.3002)、P3(18.4002,52％,宽度大约3.3002)、P4(21.5202,57％,宽度大约2.6662)、P5(24.2202,68％,宽度大约1.6662)、P6(26.4802,100％,宽度大约4.9982)。

DSC显示245.6℃时一个主要的放热峰(236.6℃激发)，接着280.4℃时一个吸热峰。

本发明的另一个目的是类伽腺苷的多晶形F(具有每摩尔类伽腺苷0.5摩尔乙醇的溶剂化物形态)，而且可以通过包括以下步骤的方法制备：

a)优选在惰性环境下，以3％w/w-8％w/w的浓度，处理无水乙醇中的非晶形

类伽腺苷，提供悬浮液；

b)在包括15℃-40℃的温度下保持所述悬浮液8-15小时，获得沉淀；

c)回收所述沉淀，例如通过过滤；如果需要

d)真空下干燥所述回收的沉淀，例如在40℃-80℃下48-96小时。

根据一个优选实施方案，步骤a)中，非晶形类伽腺苷与乙醇之间的相对比率是5％w/w，步骤b)中，所述悬浮液在20℃-25℃下持续搅拌8-10小时，步骤d)中所述干燥条件是60℃进行72小时。

非晶形F可以通过本领域普通技术人员熟知的标准技术鉴定。

XRD谱的鉴定峰是：2值(相对强度)：6.42(40％),10.38(30％),12.20(29％),12.80(21％),13.80(36％),16.24(40％),16.84(24％),19.28(30％),19.96(23％),20.20(24％),20.70(42％),22.00(32％),22.58(19％),23.38(19％),23.80(31％),25.04(100％),25.60(48％),26.28(22％),27.18(73％),28.48(22％)。

NMR谱的特征为CH₃CH₂OH信号，其增加到非晶形的公知的NMR的信号。

并且，元素分析提供了溶剂化物形态的确认。

DSC显示189℃时的一个吸热峰(183℃激发)。

本发明的另一个目的是类伽腺苷的多晶形E(具有每摩尔类伽腺苷1摩尔三氟乙醇的溶剂化物形态)，而且可以通过包括以下步骤的方法制备：

a)优选以1％-3％的浓度，在包括15℃-50℃的温度下处理干燥三氟乙醇中的非晶形类伽腺苷0.5-1.0小时，提供反应混合物；

b)过滤所述反应混合物，回收滤液；

c)真空下，典型地40℃-60℃下，浓缩所述滤液，提供残余物；

d)优选在浓缩相同的温度下，真空下，保持所述残留物，例如24-72小时。

根据一个优选实施方案，非晶形类伽腺苷与三氟乙醇之间的相对比率为1％w/w，并在20℃-25℃下持续搅拌溶液0.5小时。优选的蒸发温度是大约40℃，并在该温度下保持48小时。

非晶形E可以通过本领域普通技术人员熟知的标准技术鉴定。

XRD谱的鉴定峰是：2值(相对强度):4.98(100％),12.08(31％),14.66(52％),17.60(33％),17.96(31％),19.20(69％),19.62(93％),20.24(41％),20.78(34％),21.08(33％),21.52(36％),23.18(37％),24.10(42％),24.24(39％),25.08(38％),25.52(46％),26.02(85％),26.64(62％),27.36(54％),27.66(59％),27.84(64％),28.74(39％)。

NMR谱由的特征为CF₃CH₂OH信号，其增加到非晶形公知的NMR的信号。

并且，元素分析提供了溶剂化物形态的确认。

DSC显示145℃时宽的吸热峰。

可以通过包括以下步骤的方法制备类伽腺苷的多晶形G(类伽腺苷无水)：

a)优选以4％w/v-7％w/v的浓度，在包括70℃-78℃的温度下，处理干燥乙醇中的非晶形类伽腺苷足够的时间以将所述非晶形类伽腺苷转变成热力学更稳定的G形，一般地60-90小时，提供反应混合物；

b)冷却所述反应混合物降至20℃-25℃以提供沉淀；

c)分离所述沉淀，例如通过过滤；

d)真空中40℃-60℃下干燥所述沉淀24-72小时。

根据一个优选的实施方案，非晶形类伽腺苷与乙醇之间的相对比率为5％w/v，并在80℃下持续搅拌反应混合物70小时。优选的干燥条件是60℃下24小时。

也可以直接从上述化合物2到非晶形类伽腺苷的方法的步骤b)中公开的反应混合物制备多晶形G。一旦化合物2转变为类伽腺苷，继续反应足够的时间以将它转变成热力学更稳定的晶形G。典型地，反应继续至少30小时。

根据该实施方案，通过包括以下步骤的方法制备类伽腺苷的多晶形G(结晶的无水类伽腺苷)：

b)在压力反应器中，在包括60℃-100℃的温度下持续搅拌所述反应混合物，以获得将化合物2转变为(1-{9-[(4S,2R,3R,5R)-3,4-二羟基-5-(羟甲基)草脲胺-2-基]-6-氨基嘌呤-2-基}吡唑-4-基)-N-甲基氨甲酰(类伽腺苷，化合物3)；

c)继续反应足够的时间以将类伽腺苷转变为热力学更稳定的晶形G；

d)从所述反应混合物除去未反应的甲胺；

e)以1℃-2℃/min的冷却速率将来自步骤d)的所述反应混合物冷却至10℃-25℃；

f)用干C₁-C₄醇1:1稀释来自步骤e)的所述反应混合物，提供结晶的无水类伽腺苷G形的沉淀；

g)分离步骤f)的所述沉淀，例如通过过滤，如果需要；

h)干燥所述沉淀。

根据一个优选的实施方案，使用无水乙醇进行反应，而且乙醇中甲胺的浓度包括10％到40％之间，优选33％。反应混合物中化合物2的摩尔浓度包括0.5M到0.1M，优选0.25M。优选的反应温度包括在大约3Bar的工作压力下，80℃-85℃之间进行大约70小时的反应时间。通过在40℃、真空下蒸馏(大约15％的反应体积被蒸馏)除去甲胺，在20℃-25℃冷却反应混合物，用无水乙醇1:1稀释反应混合物，在20℃-25℃下持续搅拌反应混合物30分钟，通过过滤回收沉淀，来实现反应的激发。真空中60℃下干燥湿产物72小时，以提高类伽腺苷多晶形G。

多晶形G可以通过本领域普通技术人员熟知的标准技术鉴定。

XRD谱的鉴定峰是：2值(相对强度):8.24(100％),14.90(23％),17.70(20％),18.16(21％),19.84(20％),21.92(30％),26.16(44％),27.68(34％),30.44(21％)。

并且，元素分析提供了无水形态的确认。

DSC显示了264.6℃时的主要吸热峰。

多晶形G显示了在湿润条件下也非常热稳定的重要优点。

在类伽腺苷固体形态的上述鉴定中，采用几个光谱和分析数据的值，考虑到使用的分析技术类型典型的可能的误差、精确度和准确度。

本发明所有固体形态的类伽腺苷，从化学的观点来说是稳定的，也即其特征是高纯度，尤其考虑到它们用作药物。而且，根据本发明的固体形态是热力学稳定的，而且G形在应力的湿润条件下尤其稳定。

本发明的优点是提供一种用于制备非晶形类伽腺苷的非破坏性方法，经历包括温和反应条件的合成途径。

从调控的观点来看，固体稳定形态也是有利的，因为晶形的稳定性是药物注册所需要的。

并且，从工业的观点来看，这种晶形的贮存对于它们更长的贮存期限是有利的。

本发明的另一个目的是药物组合物，其包括以多晶形E、F或G之一或其混合物的类伽腺苷。药物组合物以及它们的制备方法是本领域熟知的。参见，例如“雷明登药学大全(Remington’sPharmaceuticalSciences)”，最后一版。上述参考文献中也提供了药物组合物的实例，参见例如WO2012/149196。本发明的药物组合物包括治疗有效量的以多晶形E、F或G或其混合物的类伽腺苷，与常规赋形剂和载体的混合物。以在现有技术中找到典型的治疗剂量，尤其是对于药物优选的组合物是可注射的制剂，例如预先填充的注射器，其含有0.4mg/5ml活性组分。

尤其优选的是可注射制剂形态的药物组合物。

下面的实施例更进一步说明本发明。

实验部分

用BrukerFT-NMRAVANCETMDRX500分光计，以500MHz进行¹HNMR分析。在装备有通用ATR加样器的PerkinElmer仪器(ModFTIRSpectrumOne)上记录红外光谱(IR)。以20℃/min的加热速率从50℃到310℃，在PerkinElmer仪器(Mod.DSC7)上记录DSC。通过衍射计(Rigaku-D-Max)，从5.000到60.000的起始角度[1/22θ]，记录X射线衍射谱。使用Cu阳极(和)获得衍射图。

这里报告了用于确定类伽腺苷的色谱纯度的HPLC方法：

·柱偶氮磺胺C-18-AQ(250x4.6mm,5μm)

·柱温度：45℃

·流速1.5ml/min

·检测器UV＝260nm

·梯度洗脱：时间0＝95％A相，5％B相；时间35分钟＝75％A相和25％B相；时间38分钟25％A相和75％B相；时间40分钟＝95％A相和5％B相。

·A相组合物：97％水/0.1％三乙胺/0.1％乙酸/3.0％乙腈(v/v/v/v)

·B相组合物：10％A相和90％乙腈(v/v)

实施例1

方法A.从2-氯腺苷制备2-肼基腺苷(化合物1)

搅拌2-氯腺苷(100g；0.33摩尔)和水合肼(60％-65％水中；300ml)的混合物，同时加热至40℃-45℃2.5小时。然后使反应混合物达到20℃-25℃，并在搅拌下用96％乙醇(900ml)稀释；然后持续搅拌反应混合物8-10小时，通过过滤收集沉淀。用水(400ml)与冷却至0℃的乙醇(400ml)依序洗涤滤渣；在降低的压力下，40℃干燥回收固体，提供2-肼基腺苷(80g，0.27摩尔；81％摩尔产率)。

方法B.从2-碘腺苷制备2-肼基腺苷(化合物1)

40℃-45℃下搅拌96％乙醇(300ml)中2-碘腺苷(100g；0.25摩尔)，肼一水合物(98％；80ml)的混合物大约2小时。然后使反应混合物达到20℃-25℃，并在搅拌下用96％乙醇(300ml)稀释；然后持续搅拌反应混合物8-10小时，通过过滤收集沉淀。用冷却至0℃的96％乙醇(2x140ml)洗涤滤渣；在降低的压力下，40℃干燥回收的固体24小时，提供2-肼基腺苷(66g，0.22摩尔；88％摩尔产率)。

根据方法A和方法B获得的化合物1显示相同的化学-物理特性：

¹H-NMR(DMSO-d6).δ3.55(m,1H),3.62(m,1H),3.0-4.0(2bs与以前的系统部分重叠；3H),3.80(dd,1H),4.15(dd,1H),4.60(t,1H),5.10(bs,2H),5.90(d,1H),6.90(brs,2H),7.25(s,1H),7.98(s,1H)。

MS(ESI阳性)：可检测的质子化的分子离子，m/z＝298.4。

IR(ATR).cm^-1:3504,3435,3324,3156,2941,2913,1643,1585,1476,1049,1030。

实施例2

乙基1-{9-[(4S,2R,3R,5R)-3,4-二羟基-5-(羟甲基)草脲胺-2-基]-6-氨基嘌呤-2-基}吡唑-4-羰酸盐，其也被鉴定为2-(4-乙氧基羰基吡唑-1-基)腺苷(化合物2)

添加(乙氧基羰基)丙二醛(19g，120毫摩尔)到溶于MeOH/AcOH(450ml)的1:1混合物中的2-肼基腺苷(25g，80毫摩尔)悬浮液中，在80℃加热混合物3h。通过过滤收集形成的沉淀，用乙醇与二乙醚洗涤，提供作为醋酸盐的30g化合物(2)(74毫摩尔；92％摩尔产率)。

¹H-NMR(DMSO-d6)δ1.25(t,3H),1.98(s,2.3H醋酸盐),3.58(m,1H),3.68(m,1H),3.90(dd,1H),4.15(dd,1H),4.25(q,2H),4.60(t,1H),5.0(bs,1H),5.20(bs,1H),5.50(bs,1H),5.90(d,1H),7.80(brs,2H),8.08(s,1H),8.4(s,1H),8.9(s,1H)。

IR(ATR).cm^-1:3486,3334,3195,2982,2941,1712,1660,1609,1489,1018,982。

MP:161.4℃

MS(ESI阳性)：可检测的质子化的分子离子，m/z＝406.5。

实施例3

非晶形(1-{9-[(4S,2R,3R,5R)-3,4-二羟基-5-(羟甲基)草脲胺-2-基]-6-氨基嘌呤-2-基}吡唑-4-基)-N-甲基氨甲酰(化合物3)

在20℃-25℃搅拌下，将化合物2(21g，52毫摩尔)悬浮于溶于绝对乙醇(210ml)中的33％甲胺溶液中。在压力反应器中，在80℃-85℃、搅拌下加热混合物30小时。这段时间后，在40℃下，真空(12mmHg)浓缩反应混合物到大约85％的初始体积(即到大约178ml的最终反应体积)。使反应温度达到20℃-25℃，然后用绝对乙醇(200ml)稀释。在20℃-25℃下持续搅拌混合物30分钟，通过过滤回收沉淀，用绝对乙醇(200ml)在过滤器上洗涤沉淀，并在60℃真空干燥72小时，提供99.7％的色谱纯度(通过HPLC确定)。

¹H-NMR(DMSOd6)δ2.76(d,3H,4.6Hz；CH ₃-NH),3.67和3.57(m,2H；CH ₂OH),3.96(m,1H；CH-CH₂),4.17(m,1H；3’CH-OH),4.62(m,1H；2’CH-OH),5.02(dd,1H,5.7Hz；OH),5.23(bs,1H；OH),5.50(d,1H,6.2Hz；2’OH),5.94(d,1H,6.2Hz；O-CH-N),7.77(bs,2H；NH₂),8.07(s,1H；＝N-N-CH＝),8.35(q,1H；NH),8.41(s,1H；N-CH＝N),8.95(s,1H；CH＝N)。这些光谱数据与建议的结构和文献数据一致(US8106183)。

XRD(图1)。具有6个卤素的非晶形类伽腺苷：P1(4.0402,32％,宽度大约2.0002),P2(14.0802,33％,宽度大约3.3002),P3(18.4002,52％,宽度大约3.3002),P4(21.5202,57％,宽度大约2.6662),P5(24.2202,68％,宽度大约1.6662),P6(26.4802,100％,宽度大约4.9982)。

DSC(图6)。245.6℃时一个主要的放热峰(236.6℃激发)，接着是280.4℃时一个吸热峰。

IR(ATR).cm^-1:3317,3216,2933,1640,1604,1574,1404,1340,1284,1130,1087,1059,1019,975,912,863,724。

MS(ESI阳性)：可检测的质子化的分子离子，m/z＝391.5。

实施例4

(1-{9-[(4S,2R,3R,5R)-3,4-二羟基-5-(羟甲基)草脲胺-2-基]-6-氨基嘌呤-2-基}吡唑-4-基)-N-甲基氨甲酰(化合物3半乙醇合物)的多晶形F

将获自实施例3的非晶形化合物3(17g)在20-25℃、氮气环境、搅拌下，在绝对乙醇(340ml)中匀浆8-10小时。这段时间后，通过过滤回收固体，在过滤器上用绝对乙醇(250ml)洗涤，60℃下真空干燥72小时，提供以13g多晶形F中的化合物3(67％摩尔产率)。该化合物的HPLC纯度是99.7％。

¹H-NMR(DMSOd6)δ1.07(t,0.85H,CH ₃CH₂OH),2.76(d,3H,4.6Hz；CH ₃-NH),3.45(dd,0.57H,CH₃ CH ₂OH)3.67and3.57(m,2H；CH ₂OH),3.96(m,1H；CH-CH₂),4.17(m,1H；3’CH-OH),4.45(t,0.44H,CH₃CH₂ OH),4.62(m,1H；2’CH-OH),5.02(dd,1H,5.7Hz；OH),5.23(bs,1H；OH),5.50(d,1H,6.2Hz；2’OH),5.94(d,1H,6.2Hz；O-CH-N),7.77(bs,2H；NH₂),8.07(s,1H；＝N-N-CH＝),8.35(q,1H；NH),8.41(s,1H；N-CH＝N),8.95(s,1H；CH＝N)。

XRD(图2)。2值(相对强度):6.42(40％),10.38(30％),12.20(29％),12.80(21％),13.80(36％),16.24(40％),16.84(24％),19.28(30％),19.96(23％),20.20(24％),20.70(42％),22.00(32％),22.58(19％),23.38(19％),23.80(31％),25.04(100％),25.60(48％),26.28(22％),27.18(73％),28.48(22％)。

DSC：189℃时的主要吸热峰。

IR(ATR).cm^-1:3498,3348,3309,3127,3081,2972,2938,1639,1620,1583,1485,1450,1407,1335,1287,1279,1211,1132,1121,1050,1036,1012,980,969,919,903,886,809,790,722,665。

计算C₁₅H₁₈N₈O₅.1/2C₂H₆O₁的元素分析数据。理论值：C＝46.49％,H＝5.12％,O＝21.29％,N＝27.11％。实测值:C＝46.55％,H＝5.15％,O＝21.35％,N＝26.95％。

实施例5

(1-{9-[(4S,2R,3R,5R)-3,4-二羟基-5-(羟甲基)草脲胺-2-基]-6-氨基嘌呤-2-基}吡唑-4-基)-N-甲基氨甲酰(化合物3三氟乙醇化物)的多晶形E

将根据实施例3获得的1g(2.56毫摩尔)非晶形化合物3，在20℃-25℃、氮气环境、搅拌下，溶于2,2,2-三氟乙醇(100ml)中，并持续搅拌30分钟。这段时间以后，过滤溶液(0.45μm截断)；40℃真空浓缩滤液至残余物，提供多晶形E中的化合物3(980mg)。

¹H-NMR(DMSOd6)δ2.78(d,3H,4.6Hz；CH ₃-NH),3.67和3.57(m,2H；CH ₂OH),3.93(dd,CF₃ CH ₂OH).3.98(m,1H；CH-CH₂),4.19(bs,1H；3’CH-OH),4.62(d,1H；2’CH-OH),5.02(dd,1H,5.7Hz；OH),5.23(bs,1H；OH),5.50(d,1H,6.2Hz；2’OH),5.94(d,1H,6.2Hz；O-CH-N),6.08(bs,CF₃CH₂ OH),7.77(bs,2H；NH₂),8.07(s,1H；＝N-N-CH＝),8.35(q,1H；NH),8.41(s,1H；N-CH＝N),8.95(s,1H；CH＝N)。

XRD(图3)。2值(相对强度):4.98(100％),12.08(31％),14.66(52％),17.60(33％),17.96(31％),19.20(69％),19.62(93％),20.24(41％),20.78(34％),21.08(33％),21.52(36％),23.18(37％),24.10(42％),24.24(39％),25.08(38％),25.52(46％),26.02(85％),26.64(62％),27.36(54％),27.66(59％),27.84(64％),28.74(39％)。

DSC：145℃时宽的吸热峰。

IR(ATR).cm^-1:3341,3270,3127,2920,1643,1578,1537,1519,1488,1449,1423,1413,1369,1342,1276,1197,1141,1090,1060,1023,980,947,901,852,826,807,788。

计算C₁₅H₁₈N₈O₅.C₂H₃O₁F₃的元素分析数据。理论值：C＝41.64％,H＝4.32％,O＝19,57％,N＝22.85％,F＝11.62％。实测值:C＝41.84％,H＝4.52％,O＝19,56％,N＝22.65％,F＝11.42％。

实施例6

来自非晶形化合物3的(1-{9-[(4S,2R,3R,5R)-3,4-二羟基-5-(羟甲基)草脲胺-2-基]-6-氨基嘌呤-2-基}吡唑-4-基)-N-甲基氨甲酰(无水化合物3)的多晶形G

将获自实施例3的非晶形化合物3(500mg；1.28毫摩尔)，在80℃、氮气环境、搅拌下，在绝对乙醇(10ml)中匀浆70小时。这段时间后，使反应混合物达到20℃-25℃，通过过滤回收固体，在过滤器上用绝对乙醇(5ml)洗涤，60℃真空干燥24小时，提供多晶形G中的450mg化合物3(90％摩尔产率)。该化合物的HPLC纯度是99.8％。

¹H-NMR(DMSOd6)δ2.76(d,3H,4.6Hz；CH ₃-NH),3.66和3.56(m,2H；CH ₂OH),3.96(m,1H；CH-CH₂),4.18(m,1H；3’CH-OH),4.62(m,1H；2’CH-OH),5.04(dd,1H,5.7Hz；OH),5.26(bs,1H；OH),5.52(d,1H,6.2Hz；2’OH),5.94(d,1H,6.2Hz；O-CH-N),7.78(bs,2H；NH₂),8.07(s,1H；＝N-N-CH＝),8.36(q,1H；NH),8.42(s,1H；N-CH＝N),8.96(s,1H；CH＝N)。

XRD(图4)2值(相对强度):8.24(100％),14.90(23％),17.70(20％),18.16(21％),19.84(20％),21.92(30％),26.16(44％),27.68(34％),30.44(21％)

DSC：264.6℃时主要的吸热峰。

IR(ATR).cm^-1:3329,3292,3225,3159,3142,3100,3021,2926,2893,1665,1635,1595,1559,1487,1439,1417,1394,1357,1340,1322,1234,1214,1197,1126,1075,1054,1045,1032,1012,992,976,919,859,850,817,790,744,715,671。

计算C₁₅H₁₈N₈O₅的元素分析数据。理论值：C＝46.15％,H＝4.65％,O＝20.49％,N＝28.71％。实测值:C＝46.11％,H＝4.67％,O＝20.52％,N＝28.75％

实施例7

来自化合物2的(1-{9-[(4S,2R,3R,5R)-3,4-二羟基-5-(羟甲基)草脲胺-2-基]-6-氨基嘌呤-2-基}吡唑-4-基)-N-甲基氨甲酰(无水化合物3)的多晶形G

将化合物2(25.2g，62.4毫摩尔)在20℃-25℃、搅拌下悬浮于溶于绝对乙醇(252ml)中的33％甲胺溶液中。在压力反应器中，80℃-85℃搅拌下，将混合物加热70小时(反应容器上记录的压力是3Bar)。这段时间后，将反应混合物40℃下真空浓缩到大约85％的初始体积(即到大约214ml的最终反应体积)。使反应温度达到20℃-25℃，然后用绝对乙醇(240ml)稀释。在20℃-25℃下持续搅拌混合物30分钟，通过过滤回收沉淀，用绝对乙醇(240ml)在过滤器上洗涤沉淀，并在60℃真空干燥72小时，提供无水形态的19.7g化合物3(50.5毫摩尔；80％)，其色谱纯度为99.8％(通过HPLC确定)。

获得的化合物3的化学-物理特性与从实施例6获得的相同。

实施例8

根据US8106183制备(1-{9-[(4S,2R,3R,5R)-3,4-二羟基-5-(羟甲基)草脲胺-2-基]-6-氨基嘌呤-2-基}吡唑-4-基)-N-甲基氨甲酰的多晶形A。

根据US8106183的实验4制备化合物3的多晶形A。获得的样品通过XRD光谱学进行分析，而且相当于类伽腺苷一水合物多晶形A(图5)。

记录化合物3的多晶形A、E、F和非晶形的稳定性数据

将根据实施例3-6获得的化合物3的合格的多晶形A、E、F和非晶形，在80℃、惰性环境下与90％RH和20-25℃下储存96小时。在72和96小时分析在80℃、惰性环境下储存的样品的纯度(HPLC)和固体状态(XRD)；并在96小时以后分析在90％RH和20-25℃下储存的样品的纯度(HPLC)和固体状态(XRD)。

表1和2中显示了对色谱纯度的变化获得的稳定性数据(HPLC数据)；通过XRD对在80℃、惰性环境下储存96小时的样品检查晶形E、F和非晶形的固体状态的稳定性(图8-11)。

表1.在80℃、惰性环境下，类伽腺苷的不同多晶形的HPLC稳定性数据

时间(hours)	A形	E形	F形	卤素非晶形	G形
						0	99.5	99.6	99.8	99.7	99.8
72	99.5	99.4	99.7	99.7	99.8
						96	99.5	99.6	99.7	99.7	99.8

表2.在90％RH和20-25℃储存的类伽腺苷的不同多晶形的HPLC稳定性数据

时间(hours)	A形	E形	F形	卤素非晶形	G形
						0	99.5	99.6	99.8	99.7	99.8
96	99.5	99.7	99.8	99.7	99.8

Claims

1.一种制备下式类伽腺苷Regadenoson的非晶形的方法，

根据以下方案：

其包括以下步骤：

a)使2-(4-乙氧基羰基吡唑-1-基)腺苷与甲胺溶于线性或分支C₁-C₄醇的干溶液反应，以提供反应混合物；

b)在压力反应器中，在包括60℃-100℃之间的温度下，持续搅拌所述反应混合物，以达到将所述2-(4-乙氧基羰基吡唑-1-基)腺苷转变成(1-{9-[(4S,2R,3R,5R)-3,4-二羟基-5-(羟甲基)草脲胺-2-基]-6-氨基嘌呤-2-基}吡唑-4-基)-N-甲基氨甲酰；

c)从所述反应混合物除去未反应的甲胺；

d)以1℃-2℃/min的冷却速率将来自步骤c)的所述反应混合物冷却至10℃-25℃；

e)用干C₁-C₄醇1:1稀释来自步骤d)的所述反应混合物，以提供非晶形(1-{9-[(4S,2R,3R,5R)-3,4-二羟基-5-(羟甲基)草脲胺-2-基]-6-氨基嘌呤-2-基}吡唑-4-基)-N-甲基氨甲酰的沉淀；

f)过滤步骤e)的所述非晶形的沉淀以进行分离，以及如果需要

g)干燥所述沉淀。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述步骤a)中的所述C₁-C₄醇是乙醇。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述乙醇是干的。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述步骤a)中的所述甲胺是10％到40％之间的浓度。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述步骤a)中的所述2-(4-乙氧基羰基吡唑-1-基)腺苷是0.5M到0.1M之间的摩尔浓度。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述步骤b)中的反应温度包括80℃-85℃之间，压力为大约3bar，反应时间为大约30小时。

7.根据权利要求2-6中任一项所述的方法，其中步骤c)通过在40℃真空下蒸馏除去甲胺来进行，步骤d)通过在20℃-25℃下冷却反应混合物来进行，步骤e)通过用无水乙醇1:1稀释反应混合物，并在20℃-25℃下持续搅拌反应混合物30分钟-60分钟来进行。

8.具有一分子三氟乙醇的类伽腺苷Regadenoson溶剂化物(E形)。

9.一种制备如权利要求8所述的类伽腺苷Regadenoson溶剂化物的方法，包括：

a.将非晶形类伽腺苷在包括15℃-50℃之间的温度下在干三氟乙醇中处理0.5小时-1.0小时，以提供反应混合物；

b.过滤所述反应混合物，回收滤液；

c.真空浓缩所述滤液，以提供残余物；

d.优选在与浓缩相同的温度下，在真空下保持所述残留物。

10.根据权利要求9所述的方法，其中步骤a)中非晶形类伽腺苷与三氟乙醇之间的相对比率是1％w/w，将溶液在20℃-25℃下持续搅拌0.5小时，在步骤c)中蒸发的温度是大约40℃，且在步骤d)中保持该温度48小时。

11.具有0.5分子乙醇的类伽腺苷Regadenoson溶剂化物(F形)。

12.一种制备如权利要求11所述的类伽腺苷Regadenoson溶剂化物的方法，包括：

a.在惰性环境下处理无水乙醇w/w中的非晶形类伽腺苷，以提供悬浮液；

b.在包括15℃-40℃之间的温度下保持所述悬浮液8小时-15小时，以获得沉淀；

c.回收所述沉淀；以及如果需要

d.干燥所述回收的沉淀。

13.根据权利要求12所述的方法，其中步骤a)中所述非晶形类伽腺苷与乙醇之间的相对比率为5％w/w，在步骤b)中在20℃-25℃下持续搅拌所述悬浮液8小时-10小时，且在步骤d)中的所述干燥条件是60℃下72小时。

14.结晶的无水类伽腺苷Regadenoson(G形)。

15.一种制备如权利要求14所述的结晶的无水类伽腺苷Regadenoson的方法，包括：

a.优选以4％w/v-7％w/v的浓度，在包括70-78℃之间的温度下，处理干乙醇中的非晶形类伽腺苷足够的时间以使所述非晶形类伽腺苷转变成热力学更稳定的G形，一般为60小时-90小时，以提供反应混合物；

b.冷却所述反应混合物降至20℃-25℃，以提供沉淀；

c.分离所述沉淀，例如通过过滤；

d.在40℃-60℃下真空干燥所述分离的沉淀24小时-72小时。

16.一种制备如权利要求14所述的结晶的无水类伽腺苷Regadenoson的方法，包括：

a.使2-(4-乙氧基羰基吡唑-1-基)腺苷与甲胺溶于线性或分支C₁-C₄醇的干溶液反应，以提供反应混合物；

b.在压力反应器中，在包括60-100℃之间的温度下持续搅拌所述反应混合物，以便将所述化合物2转变为(1-{9-(4S,2R,3R,5R)-3,4-二羟基-5-(羟甲基)草脲胺-2-基]-6-氨基嘌呤-2-基}吡唑-4-基)-N-甲基氨甲酰；

c.继续反应足够的时间以将类伽腺苷转变为热力学更稳定的晶形；

d.从所述反应混合物除去未反应的甲胺；

e.以1℃-2℃/min的冷却速率，将来自步骤d)的所述反应混合物冷却至10℃-25℃；

f.用干C₁-C₄醇1:1稀释来自步骤e)的所述反应混合物，以提供结晶的无水类伽腺苷的沉淀；

g.分离步骤f)的所述沉淀；以及如果需要

h.干燥所述沉淀。

17.一种药物组合物，尤其以可注射的制剂形式，其包括权利要求8或11所述的类伽腺苷Regadenoson溶剂化物或权利要求14所述的结晶的无水类伽腺苷Regadenoson或其混合物。