CN105112490B - 一种改良的烟草花粉活力检测方法 - Google Patents

Abstract

一种改良的烟草花粉活力检测方法，具体包括以下步骤：在每1 ml烟草种子油脂加入60~100 mg烟草花粉混合均匀；将加热后的固体培养基用载玻片薄层涂布于载玻片上；用移液枪吸取10 µl的含有烟草花粉的烟草种子油脂，置于冷却的固体培养基上，用玻璃棒均匀涂布；把载玻片放置于加两层湿润滤纸的培养皿中，然后把培养皿放入培养箱中25℃下暗培养，4h后显微镜下观察花粉萌发情况，统计花粉活力。本发明花粉在烟草种子油脂中分散性好，涂布于固体培养基上花粉不叠加，便于计数和统计花粉活力；烟草种子油脂可促进花粉萌发，缩短了花粉活力检测的时间，提高花粉活力检测效率。

Description

一种改良的烟草花粉活力检测方法

技术领域

本发明属于植物花粉活力研究技术领域，具体涉及一种能提高烟草花粉分散性，缩短花粉萌发时间的烟草花粉活力检测方法。

背景技术

在烟草杂交育种或制种中，通常需要提前采集父本花粉，经过一段时间贮藏，在花粉使用前，进行花粉活力检测，以检验花粉的萌发受精能力，从而为烟草杂交育种和制种提供科学依据。目前烟草花粉活力检测方法主要有花粉染色法、花粉授粉结实法、花粉离体萌发法等。花粉染色法简便快捷，但由于能使未成熟和衰老的花粉着色，而这些花粉不一定具有受精能力，致使花粉活力测定值偏高，花粉活力测定结果不准确；花粉授粉结实法是根据结实情况判断花粉活力，结果比较准确，但由于授粉到柱头上的花粉量多，无法定量判断花粉活力，同时需要的时间较长；花粉离体萌发法是较为理想的检测烟草花粉活力的方法，测定结果较为稳定，更能反应花粉活力的实际状况，该方法是将花粉散落在固体或者液体培养基中进行花粉活力检测，烟草上采用固体培养基检测花粉活力时经常会遇到花粉易叠加聚集，花粉粒计数及活力统计困难的问题；采用液体培养基检测花粉活力，花粉分散性较好，但花粉萌发需要的时间较长。如何同时提高花粉分散性，缩短花粉萌发时间是花粉活力检测工作中亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种简单、快速、可靠的改良烟草花粉活力检测方法，在提高花粉分散性的同时缩短花粉萌发时间，提高花粉活力检测效率。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现。

一种改良的烟草花粉活力检测方法，先将烟草花粉分均匀散于烟草种子油脂中，烟草种子油脂中烟草花粉的含量为60~100 mg/ml，然后吸取含有烟草花粉的烟草种子油脂，涂布于培养基上，培养后观察花粉萌发情况，进行活力统计。

上述改良的烟草花粉活力检测方法，具体包括以下步骤：

（1）按照每1 ml烟草种子油脂加入60~100 mg烟草花粉的量，称取烟草花粉，加入到烟草种子油脂中，混合均匀；

（2）配制固体培养基，将加热后的固体培养基用载玻片薄层涂布于载玻片上；

（3）用移液枪吸取10 µl的含有烟草花粉的烟草种子油脂，置于冷却的固体培养基上，用玻璃棒均匀涂布；

（4）把载玻片放置于加两层湿润滤纸的培养皿中，然后把培养皿放入培养箱中25℃下暗培养，4h后显微镜下观察花粉萌发情况，统计花粉活力。

经过大量实验证明，本发明具有以下突出优点：

1、花粉在烟草种子油脂中分散性好，涂布于固体培养基上花粉不叠加，便于计数和统计花粉活力；

2、烟草种子油脂可促进花粉萌发，缩短了花粉活力检测的时间，提高花粉活力检测效率。

具体实施方式

实施例1

配制含10%蔗糖+100 ppm硼酸的液体培养基。液体培养基花粉萌发法：称取云烟87花粉于液体培养基中，配制成花粉含量为120 mg/ml的液体培养基和花粉的混合液，然后放入到培养箱中25℃下暗培养，分别于培养1h、2h、3h、4h和5h后，搅拌均匀用移液枪吸取10 µl含有花粉的液体培养基于载玻片上，盖上盖玻片于显微镜下观察花粉萌发情况，统计花粉管长度和花粉萌发率。

改良花粉萌发法：取液体培养基加入2%琼脂粉，加热使琼脂粉完全溶解后，用载玻片蘸取培养基薄层涂布于载玻片上，称取云烟87花粉于烟草种子油脂中，配制成花粉含量为120 mg/ml的烟草种子油脂和花粉的混合液，用移液枪吸取10 µl含有花粉的烟草种子油脂于冷却的固体培养基上，用玻璃棒均匀涂布，把载玻片放置于加两层湿润滤纸的培养皿中，分别于培养1h、2h、3h、4h和5h后取样于显微镜下观察花粉萌发情况，统计花粉管长度和花粉萌发率。

固体培养基花粉萌发法：取液体培养基加入2%琼脂粉，加热使琼脂粉完全溶解后，用载玻片蘸取培养基薄层涂布于载玻片上，称取1.2 mg云烟87花粉（相当于10 µl烟草种子油脂和花粉的混合液中花粉含量）均匀散落在固体培养基上，把载玻片放置于加两层湿润滤纸的培养皿中，分别于培养1h、2h、3h、4h和5h后于显微镜下观察花粉萌发情况，统计花粉管长度和花粉萌发率。

结果表明：显微镜下观察，液体培养基花粉萌发法视野内花粉分散性好于固体培养基花粉萌发法，但视野内花粉数量多，花粉容易叠加，影响花粉计数和活力统计；改良花粉萌发法视野内花粉分散性优于液体培养基花粉萌发法，视野内会出现花粉叠加现象，影响花粉计数和活力统计；固体培养基花粉萌发法视野内花粉分散性差，花粉容易叠加，影响花粉计数和活力统计。

改良花粉萌发法在1h、2h和3h时花粉萌发率分别为0.34%、2.30%和5.21%，而液体培养基花粉萌发法和固体培养基花粉萌发法花粉萌发率为0；4h时改良花粉萌发法花粉萌发率达到53.38%，花粉管长度平均为137.41µm，液体培养基花粉萌发法和固体培养基花粉萌发法花粉萌发率达到34.36%和43.46%，花粉管长度分别为74.27µm和114.78µm；5h时改良花粉萌发法花粉萌发率达到53.43%，花粉管长度平均为147.30µm，液体培养基花粉萌发法和固体培养基花粉萌发法花粉萌发率达到35.49%和53.32%，花粉管长度分别为79.17µm和121.75µm，实验数据见表1。

表1 花粉在不同培养时间内花粉活力变化

实施例2

重复实施例1，有以下不同点：烟草种子油脂和液体培养基中烟草花粉的含量为100 mg/ml。

结果表明：显微镜下观察，液体培养基花粉萌发法视野内花粉分散性好于固体培养基花粉萌发法，但视野内花粉数量多，花粉容易叠加，影响花粉计数和活力统计；改良花粉萌发法视野内花粉分散性优于液体培养基花粉萌发法，花粉不叠加，花粉易计数；固体培养基花粉萌发法视野内花粉分散性差，花粉容易叠加，影响花粉计数和活力统计。

改良花粉萌发法在1h、2h和3h时花粉萌发率分别为0.32%、1.94%和5.16%，而液体培养基花粉萌发法和固体培养基花粉萌发法花粉萌发率为0；4h时改良花粉萌发法花粉萌发率达到53.36%，花粉管长度平均为137.29µm，液体培养基花粉萌发法和固体培养基花粉萌发法花粉萌发率达到34.23%和42.36%，花粉管长度分别为74.18µm和114.53µm；5h时改良花粉萌发法花粉萌发率达到53.42%，花粉管长度平均为147.28µm，液体培养基花粉萌发法和固体培养基花粉萌发法花粉萌发率达到35.44%和53.18%，花粉管长度分别为78.28µm和121.41µm，实验数据见表2。

表2 花粉在不同培养时间内花粉活力变化

实施例3

重复实施例1，有以下不同点：烟草种子油脂和液体培养基中烟草花粉的含量为80mg/ml。

结果表明：显微镜下观察，液体培养基花粉萌发法视野内花粉分散性优于固体培养基花粉萌发法，但视野内花粉数量多，花粉容易叠加，影响花粉计数和活力统计；改良花粉萌发法视野内花粉分散性优于液体培养基花粉萌发法，花粉不叠加，花粉易计数；固体培养基花粉萌发法视野内花粉分散性差，花粉容易叠加，影响花粉计数和活力统计。

改良花粉萌发法在1h、2h和3h时花粉萌发率分别为0.31%、1.83%和5.03%，而液体培养基花粉萌发法和固体培养基花粉萌发法花粉萌发率为0；4h时改良花粉萌发法花粉萌发率达到53.08%，花粉管长度平均为136.89µm，液体培养基花粉萌发法和固体培养基花粉萌发法花粉萌发率达到34.03%和42.14%，花粉管长度分别为73.78µm和112.76µm；5h时改良花粉萌发法花粉萌发率达到53.11%，花粉管长度平均为146.24µm，液体培养基花粉萌发法和固体培养基花粉萌发法花粉萌发率达到35.16%和52.83%，花粉管长度分别为78.13µm和120.32µm，实验数据见表3。

表3 花粉在不同时间花粉活力变化

实施例4

重复实施例1，有以下不同点：烟草种子油脂和液体培养基中烟草花粉的含量为60mg/ml。

结果表明：显微镜下观察，改良花粉萌发法和液体培养基花粉萌发法视野内花粉分散性均好于固体培养基花粉萌发法，花粉不叠加，花粉易计数，但视野范围内花粉数少，花粉活力统计时需增加观察视野数；固体培养基花粉萌发法视野内花粉分散性差，花粉容易叠加，影响花粉计数和活力统计。

改良花粉萌发法在1h、2h和3h时花粉萌发率分别为0.28%、1.79%和4.61%，而液体培养基花粉萌发法和固体培养基花粉萌发法的花粉萌发率为0；4h时改良花粉萌发法花粉萌发率达到52.52%，花粉管长度平均为136.17µm，液体培养基花粉萌发法和固体培养基花粉萌发法花粉萌发率达到32.51%和41.92%，花粉管长度分别为72.64µm和111.56µm；5h时改良花粉萌发法花粉萌发率达到52.64%，花粉管长度平均为145.63µm，液体培养基花粉萌发法和固体培养基花粉萌发法花粉萌发率达到33.81%和52.15%，花粉管长度分别为78.04µm和118.64µm，实验数据见表4。

表4 花粉在不同时间花粉活力变化

实施例5

重复实施例1，有以下不同点：烟草种子油脂和液体培养基中烟草花粉的含量为40mg/ml。

结果表明：显微镜下观察，改良花粉萌发法和液体培养基花粉萌发法视野内花粉分散性均好于固体培养基花粉萌发法，花粉不叠加，花粉易计数，但视野范围内花粉数过少，花粉活力统计时需增加观察视野数；固体培养基花粉萌发法视野内花粉分散性差，花粉容易叠加，影响花粉计数和活力统计。

改良花粉萌发法在1h、2h和3h时花粉萌发率分别为0.21%、1.43%和4.23%，而液体培养基花粉萌发法和固体培养基花粉萌发法花粉萌发率为0；4h时改良花粉萌发法花粉萌发率达到49.89%，花粉管长度平均为134.02µm，液体培养基花粉萌发法和固体培养基花粉萌发法花粉萌发率达到25.46%和39.76%，花粉管长度分别为63.53µm和108.37µm；5h时改良花粉萌发法花粉萌发率达到50.18%，花粉管长度平均为141.21µm，液体培养基花粉萌发法和固体培养基花粉萌发法花粉萌发率达到28.41%和49.64%，花粉管长度分别为68.38µm和118.37µm，实验数据见表5。

表5 花粉在不同时间花粉活力变化

Claims (1)

1.一种改良的烟草花粉活力检测方法，其特征在于：先将烟草花粉均匀分散于烟草种子油脂中，烟草种子油脂中烟草花粉的含量为60~100 mg/ml，然后吸取含有烟草花粉的烟草种子油脂，涂布于培养基上，培养后观察花粉萌发情况，进行活力统计， 具体包括以下步骤：

（1）按照每1 ml烟草种子油脂加入60~100 mg烟草花粉的量，称取烟草花粉，加入到烟草种子油脂中，混合均匀；

（2）配制固体培养基，将加热后的固体培养基用载玻片薄层涂布于载玻片上；

（3）用移液枪吸取10 µl的含有烟草花粉的烟草种子油脂，置于冷却的固体培养基上，用玻璃棒均匀涂布；

（4）把载玻片放置于加两层湿润滤纸的培养皿中，然后把培养皿放入培养箱中25℃下暗培养，4h后显微镜下观察花粉萌发情况，统计花粉活力。