CN105107027A - 纤维蛋白凝胶-聚乳酸复合支架及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种纤维蛋白凝胶-聚乳酸复合支架及其制备方法，其中制备方法包括：获取聚乳酸多孔支架；将聚乳酸多孔支架用氢氧化钠进行表面活化处理；将表面处理后的聚乳酸多孔支架用聚丙烯酸钠进行表面接枝；向表面接枝后的聚乳酸多孔支架的孔隙内填充纤维蛋白凝胶。本发明的制备方法，采用聚乳酸多孔支架和纤维蛋白凝胶这两者进行组合得到复合支架，并且根据实施中的目的要求，分别对聚乳酸多孔支架进行表面改性和接枝处理，提升其亲和性和细胞吸附性，并增强水分保持能力，利于保证纤维凝胶的形态和功效水平，且具有更好地机械性能。

Description

纤维蛋白凝胶-聚乳酸复合支架及其制备方法

技术领域

本发明属于3D细胞培养技术领域，具体涉及一种纤维蛋白凝胶-聚乳酸复合支架及其制备方法。

背景技术

3D细胞培养技术是在细胞培养过程中，为细胞提供一个更加接近体内生存条件的三维微环境，使细胞能够具有高质量、高密度的细胞繁殖的优势；这些微环境的构建方式，通常有支架、微球载体等等方式实现。而目前临床效果较好的支架基材都是胶原、蚕丝蛋白、纤维蛋白、海藻酸盐、透明质酸、壳聚糖等原材料。但是这些材料在使用中尽管相比具有良好的生物相容性，但是来源非常受限，且受制于材料自身的因素难以控制。

相比上述支架采用的原始基材的不足，越来越多地倾向于采用合成高分子聚合物的材质作为组织工程用于细胞培养支架，聚合物的支架具有比较好的力学性能，适于大量生产；但是聚合物本身所含有的单体引发剂等都是具有细胞毒性的物质，且亲水性差，与细胞的相容性不足。而相对聚合物材质的缺陷，纤维蛋白凝胶具有良好的生物相容性，以其分子之间的非共价键，调整水分含量后可以调节孔径的大小，适于促进细胞的生长，但纤维蛋白易失重发生不可逆变形。由于上述材料各自都存在的不足，造成材料在使用的过程中都无法全面满足细胞培养的最适要求。

发明内容

本发明实施的目的在于克服现有的缺陷，提供一种机械性能更强、细胞亲和性、吸附性以及保水性更佳的纤维蛋白凝胶-聚乳酸复合支架及其制备方法。

为了实现上述发明目的，本发明实施例的技术方案如下：

一种纤维蛋白凝胶-聚乳酸复合支架的制备方法，包括如下步骤：

获取聚乳酸多孔支架；

将所述聚乳酸多孔支架用氢氧化钠进行表面活化处理；

将所述表面处理后的聚乳酸多孔支架用聚丙烯酸钠进行表面接枝；

向表面接枝后的所述聚乳酸多孔支架的孔隙内填充纤维蛋白凝胶。。

本发明的制备方法，采用聚乳酸多孔支架和纤维蛋白凝胶这两者进行组合得到复合支架，并且根据实施中的目的要求，分别对聚乳酸多孔支架进行表面改性和接枝处理，提升其亲和性和细胞吸附性，并增强水分保持能力，利于保证纤维凝胶的形态和功效水平，且具有更好地机械性能。

本发明进一步还提出一种采用上述纤维蛋白凝胶-聚乳酸复合支架的制备方法制备得到的纤维蛋白凝胶-聚乳酸复合支架；具有较高的细胞亲和性和吸附性，以及水分保持能力，利于保证纤维凝胶的形态和功效水平，且具有更好地机械性能。

附图说明

下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：

图1为本发明实施例制备的纤维蛋白凝胶-聚乳酸复合支架的激光共聚焦显微镜扫描图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实例提出一种纤维蛋白凝胶-聚乳酸复合支架的制备方法，包括如下步骤：

S10，获取聚乳酸多孔支架，并将聚乳酸多孔支架用氢氧化钠进行表面处理；

S20，将表面处理后的聚乳酸多孔支架用聚丙烯酸钠进行表面接枝；

S30，在表面接枝后的聚乳酸多孔支架的孔隙内填充纤维蛋白凝胶。

本发明的上述制备方法的过程和内容，是在聚合物的聚乳酸多孔支架的基础上进一步填充纤维蛋白凝胶，通过纤维蛋白凝胶的良好的生物相容性，以其分子之间的非共价键，调整水分含量后可以调节孔径的大小，从而弥补单一聚合物亲水性和相容性的不足；并且聚乳酸多孔支架还进行了水解，表面活化，能与纤维蛋白凝胶更加稳定紧密的结合，增强对填充在内的纤维蛋白凝胶的保持能力，降低凝胶形变和失重、干化等发生的程度；同时，采用保水性能比较强的聚丙烯酸钠进行接枝改性，提升支架的保水性，一方面通过保水维持支架表面的润湿性，更加利于细胞的亲和，另一方面还能通过水分的缓释进一步稳定或者保持填充的纤维蛋白凝胶的品质；最终相对于单纯的PLLA支架(聚乳酸支架)，本发明的复合支架，改善PLLA支架的生物相容性的同时也增强了PLLA支架的机械性能，并且还能在长效时间内延缓纤维蛋白凝胶的降解和流失，效果更加持久稳定。

其中，上述步骤S10中，本发明采用聚乳酸多孔支架作为基础，通过实验和考察，聚乳酸多孔支架自身本身具有良好的抗拉强度及延展度，适于用作本发明填充的骨架基材，进行复合填充。但是其本身也具有非常大的缺陷，就是其表面钝化较高，直接进行凝胶填充时两者结合性比较差，而且聚乳酸的降解单体如果释放，会使培养环境酸度过高，降解产物容易引起周围组织的无菌性炎症反应，不利于细胞培养。所以本发明中首先用氢氧化钠进行表面处理，在氢氧化钠的作用下，支架表面的聚乳酸分子主链酯键会发生部分水解，这样增加表面羧基含量，增加其表面的活性和结合力。

并且，在该步骤中的表面处理，采用的是将聚乳酸多孔支架用氢氧化钠进行热浸泡的方式进行，本身氢氧化钠也会对支架本身进行水解，所以处理的时间长或者是氢氧化钠的浓度太高，那么对本身聚合物直接的主体纤维结构会有比较大的破坏。所以在这一步骤S10中，本发明控制实施的过程中采用氢氧化钠的浓度为0.2～0.8mol/L，而热浸泡的过程中温度控制40～50度；处理的时间不能长，处理5min～10min左右即可。同时，由于在实施的过程中，由于本身聚乳酸支架的主要改性的部分要是在内部的多孔的表面上，但是浸泡的过程中，氢氧化钠渗流至内部细小孔隙非常慢，而且基于表面张力等等可能渗透不进去；所以在这一情形下，本发明实施中在支架浸泡在氢氧化钠中之后对整体的溶液加压，通过加压处理将氢氧化钠压至多孔内。

在上述步骤S10之后，步骤S20进一步将表面处理后的聚乳酸多孔支架进行表面接枝，在其表面上接枝聚丙烯酸钠分子。采用聚丙烯酸钠接枝的目的在于，虽然对聚乳酸多孔支架的表面进行了修饰，但是其整体上的主体还偏重于细胞的粘附性很差，不利于细胞培养中对细胞的粘附和固定。而再结合采用聚丙烯酸钠接枝，那么聚丙烯酸钠的接枝更加进一步提升其表面的结合性，利于细胞的吸附和固定。更重要地，采用聚丙烯酸钠的接枝还有两层重要的意义，首先聚丙烯酸比较认可和采用最多吸水树脂，聚丙烯酸分子由于其结构特异，能够吸附相当于其几时多倍体积的水的量，在保持有水量以后，支架本身一方面可以持续润湿，更加便于保持之后填充和结合在支架孔隙内的凝胶的品质，保持水分有利于细菌的吸附；其次，在聚合的基础上，本发明采用的接枝的聚丙烯酸钠是碱性单体的聚合，可以抑制聚乳酸的降解单体释放乳酸造成培养环境酸度过高的缺陷，相应能够较好地抑制细胞组织的无菌性炎症反应。

但是在这一实施过程中，接枝所采用的聚丙烯酸钠不适合用常规的大分子量(4000～5000)高聚合度的聚丙烯酸钠进行，而是适合采用低分子量的类型进行，以降低大分子长链产生的空间位阻和一些其他的排斥等等问题，基本上达到本发明中上述效果和目的即可，而应当尽量避免产生其他方面的性质变化或者带来其他的问题；因此在实施中，本发明上述采用的聚丙烯酸钠采用分子量为400～600左右聚合度的聚丙烯酸钠即可。而且为了避免接枝量过多引起其他性状变化，接枝的量和比例多控制在聚乳酸多孔支架表面积3％以内。

实施过程中可以直接将多孔支架在偶氮二异丁腈的引导下，与400～600左右聚合度的聚丙烯酸钠于液相中自行反应共价结合即可。

在接枝处理之后，步骤S30进一步将表面接枝后的聚乳酸多孔支架的孔隙内填充上纤维蛋白凝胶，从而最终形成复合支架。该步骤中，纤维蛋白凝胶的填充方式可以采用将纤维蛋白原和凝血酶滴加在湿润处理的聚乳酸多孔支架的表面，由于重力作用和毛细作用，纤维蛋白原溶液和凝血酶溶液会导入到支架中；用滤纸轻轻除去支架表面液体，将支架放入37℃的恒温烘箱中，充分孵育10～15分钟，待纤维蛋白原完全固化成凝胶之后即可。

本发明的制备方法，采用聚乳酸多孔支架和纤维蛋白凝胶这两者进行组合得到复合支架，并且根据实施中的目的要求，分别对聚乳酸多孔支架进行表面改性和接枝处理，提升其亲和性和细胞吸附性，并增强水分保持能力，利于保证纤维凝胶的形态和功效水平，且具有更好地机械性能。

为使本发明的上述实施的技术细节和过程方法能更易于本领域技术人员的理解和实施参考，同时凸显出本发明所制备得到的多孔复合支架的品质，以下通过具体的实施例进行举例说明。

实施例1

S11，取出聚乳酸多孔支架20g(购买自西安瑞捷生物科技有限公司，孔径为200μm、孔隙率为93％)，将支架手术剪剪切至厚度在1～2mm之间；

S12，将剪碎的多孔支架置于大烧杯中，并向烧杯中添加0.5mol/L的氢氧化钠至将支架全部浸没；

S13，将烧杯封口之后抽真空，然后再通入空气，使氢氧化钠尽量流进至支架的孔径内；

S14，之后置于50度的水浴中保持5min后取出，弃除氢氧化钠并用蒸馏水洗涤2～3次。

S21，重新向步骤S14的烧杯中添加约2～3倍体积的水，浸泡5min；

S22，向步骤S21的烧杯中加入一定量的AIBN(偶氮二异丁腈，购自日本帝人化成)并同时添加对应于支架质量1/20的聚丙烯酸(分子量400～600之间的混合)，水浴加热至30度，反应30min；

S23，去除残留液体，洗涤2～3次。

S31，纤维蛋白原的提取：

将新鲜的冰冻人血浆30h放置于-20℃的冰箱中冻存48小时，取出后放置于4℃冰箱中18～24h；当血浆中出现较多冰渣时，将此化冻的血浆转移至入50ml离心管中，4℃、8000g的条件下离心30分钟；

离心后，弃去上清液，用生理盐水溶解离心管底部的白色沉淀物，得到胶原蛋白原溶液；其中，生理盐水的量添加按照沉淀物估算质量配制成10～40mg/ml浓度的纤维蛋白原溶液添加；

S32，用凝血酶(购自sigma)制备凝血酶的氯化钙溶液(10U/ml)；

S33，将步骤S31的纤维蛋白原溶液加入至步骤S23的烧杯中的支架上，在纤维蛋白原溶液量较少的情况下，可以慢慢滴加的方式滴加至支架的表面；

在纤维蛋白原溶液量较多的情况下，可以多添加一些至将支架浸没；

S34，将步骤S32的凝血酶的氯化钙溶液添加至步骤S33烧杯中的支架上；由于重力作用和毛细作用,纤维蛋白原溶液和凝血酶溶液会导入到支架中，然后用用滤纸轻轻除去支架表面液体，将支架放入37℃的恒温烘箱中孵育10分钟，直至纤维蛋白原凝结。

为了验证上述所制备得到的支架的品质，然后用一个重复的相同对照，但是其中的纤维蛋白原用荧光素标记后，同样按照上述步骤进行制备；将最后制备的复合支架在激光共聚焦显微镜下观察支架的复合结构，其结果如图1所示，图1中亮色部分为纤维蛋白凝胶，暗色部分为聚乳酸多孔支架，整体上是两者相互间杂的形态。

进一步，为了验证本发明所制备的复合支架的性能，按照如下步骤和方法进行试验：

A、纤维蛋白凝胶填充支架的机械性能测试：

将上述步骤S34所制备得到的复合支架，用万能测试仪测定填充支架的力学性能，压头的速度为1mm/min。电脑记录应力应变曲线，根据样品形变20～60％范围的应力，确定填充支架的压缩模量，重复3次。

然后每次重复中用本发明中上述实施例1中采用购买自西安瑞捷生物科技有限公司的聚乳酸多孔支架作为对照，机械性能对比测试的数据结果如下：

形变范围(％)	聚乳酸多孔支架/MPa	复合支架/MPa
			0	0.0	0.0
5	0.3±0.1	0.1±0.1
			10	0.4±0.2	0.2±0.1
15	0.5±0.1	0.3±0.2
			20	0.5±0.1	0.3±0.1
25	0.6±0.2	0.4±0.1
			40	0.7±0.1	0.5±0.1
60	0.7±0.1	0.5±0.1

B、纤维蛋白凝胶及其复合支架中的纤维蛋白在PBS中的失重测试：

按照上述方法步骤，分别利用不同浓度的纤维蛋白原溶液10、20、40mg/ml，制备不同溶度的纤维蛋白凝胶和纤维蛋白凝胶填充的复合支架；将支架放入消毒过的PBS中，一定时间后，进行称重。随着天数时间，失重的情况如下表：

当然，为了与纤维蛋白凝胶做对比，在该测试中按照相对应的纤维蛋白原溶液10、20、40mg/ml直接用凝血酶的氯化钙溶液处理至凝结，而不进行填充。

从上述检测的结果中可以看出，没有进行填充的对照组，纤维蛋白凝胶在PBS中快速失重，最初的3天中己经有50％的蛋白从凝胶中释放出来。而相同的实验条件下，本发明纤维蛋白凝胶填充到PLLA支架后，即使35天后，仍然有70％的凝胶留在支架中；纤维蛋白凝胶在PBS中极易被盐溶液所溶解，从而从凝胶中逃逸出来，从而破坏了凝胶的三维网状结构，导致凝胶的崩解。但是当纤维蛋白凝胶被填充到PLLA支架后，由于PLLA支架中有大量的圆形连通的孔,并且孔壁上也具有大量的微孔，可以有效附着纤维蛋白凝胶，避免了凝胶的崩解；从而有效地减缓了纤维蛋白凝胶的溶解和降解。本发明的复合支架的各方面的性能上都具有明显的优势。

在上述制备方法步骤过程的基础上，本发明进一步还提出一种有上述方法直接制备得到的纤维蛋白凝胶-聚乳酸复合支架；采用本发明的方法制备得到的支架，具有较高的细胞亲和性和吸附性，以及水分保持能力，利于保证纤维凝胶的形态和功效水平，且具有更好地机械性能。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包括在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种纤维蛋白凝胶-聚乳酸复合支架的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

获取聚乳酸多孔支架；

将所述聚乳酸多孔支架用氢氧化钠进行表面活化处理；

将所述表面处理后的聚乳酸多孔支架用聚丙烯酸钠进行表面接枝；

向表面接枝后的所述聚乳酸多孔支架的孔隙内填充纤维蛋白凝胶。

2.如权利要求1所述的纤维蛋白凝胶-聚乳酸复合支架的制备方法，其特征在于，所述表面活化处理过程中氢氧化钠的浓度为0.2～0.8mol/L。

3.如权利要求1或2所述的纤维蛋白凝胶-聚乳酸复合支架的制备方法，其特征在于，所述表面活化处理过程中反应温度控制40～50度。

4.如权利要求1或2所述的纤维蛋白凝胶-聚乳酸复合支架的制备方法，其特征在于，所述表面活化处理过程中处理时间为5min～10min。

5.如权利要求1或2所述的纤维蛋白凝胶-聚乳酸复合支架的制备方法，其特征在于，将所述表面处理后的聚乳酸多孔支架用聚丙烯酸钠进行表面接枝步骤中，所述聚丙烯酸钠的分子量为400～600。

6.如权利要求1或2所述的纤维蛋白凝胶-聚乳酸复合支架的制备方法，其特征在于，将所述表面处理后的聚乳酸多孔支架用聚丙烯酸钠进行表面接枝步骤中，所述聚乳酸多孔支架的表面接枝的面积占支架表面积的3％。

7.一种如权利要求1至6任一项所述的纤维蛋白凝胶-聚乳酸复合支架的制备方法制备的纤维蛋白凝胶-聚乳酸复合支架。