CN105092495A - 一种生物土壤结皮中藻类生物量的测定方法 - Google Patents

一种生物土壤结皮中藻类生物量的测定方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种生物土壤结皮中藻类生物量的测定方法，涉及生物学领域。该方法包括藻类结皮样品采样、过筛、清洗、藻类培养、叶绿素a和b的测定、标准曲线绘制和藻类生物量（自然发育）测定步骤。其中藻类培养采用BG11培养基进行培养，所用藻中为混合藻类；叶绿素a和b的测定采用混合液法提取叶绿素（提取液：无水乙醇：丙酮：水=4.5:4.5:1）；标准曲线回归了藻类叶绿素a和b总量与藻类生物量间的关系；自然发育藻类生物量的测定通过叶绿素a和b总量与培养藻类生物量间的标准曲线进行换算。本发明实现了藻类结皮与维管束植物生物量间的直接比较，为更准确的计算藻类结皮生产力及其在生态系统中的作用提供了可靠途径。

Description

一种生物土壤结皮中藻类生物量的测定方法
技术领域
本发明涉及一种生物土壤结皮中藻类生物量的测定方法，适用于藻类结皮生物量的测定，其目的是实现藻类结皮与维管束植物生物量间的比较，属于生物学领域。
背景技术
生物土壤结皮是荒漠生态系统的主要构建者和生态系统工程师，是荒漠生态系统组成和地表景观的重要特征。他们是土壤表层微小颗粒被那些生存在浅层土壤里(或有时生活在土表层)，甚至到高出土表几毫米处的细菌、微小真菌、蓝藻、硅藻或绿藻、地衣和苔藓植物，以及许多景观中常见的非维管束植物成分利用菌丝体、假根和分泌物“胶结”形成的复杂而相对稳定团聚结构，厚度介于3-10mm。生物土壤结皮的覆盖在干旱区占活体覆盖面积的40%，在一些受干扰较少的极端环境群落中，生物土壤结皮甚至达到了70%的活体盖度。大多数荒漠生态系统是由非生物因素调控和胁迫的系统，尤其因受水分的限制，地表不可能支撑大面积、相对均一而连续分布的维管束植物群落；植物群落斑块状的分布为生物土壤结皮的拓殖和覆盖提供了空间和适宜的生态位，维管束植物和生物土壤结皮形成了镶嵌分别的格局。
在生物土壤结皮的研究中，采用叶绿素a+b的含量评估其生物量的方法被广泛认可。然而，由于生物土壤结皮结皮和土壤紧密的胶结在一起很难直接称取其生物量，因此，无法比较藻类结皮和维管束植物生物量间的关系，也无法准确评估藻类结皮生物量对生态系统生产力的贡献率。鉴于此，如何测量藻类结皮实际生物量，将是比较藻类结皮和维管束植物生物量关系的关键技术。
发明内容
基于上述，本发明的目的在于提供一种生物土壤结皮中藻类生物量的测定方法，用于测定藻类结皮实际生物量。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现：
一种生物土壤结皮中藻类生物量的测定方法，其步骤是：
a.藻类结皮样品采样：选择发育良好的藻类结皮，用铁铲将藻类结皮沿地表轻轻铲下，并装入信封；
b.过筛：用手将采集的藻类结皮样品揉碎，过0.2mm筛子，待用；
c.清洗：取过筛后的藻类结皮样品20g，浸泡在50ml蒸馏水中，静置20min。将浸泡后的藻类结皮样品放在纱布上，在蒸馏水中慢慢漂洗，直至样品中的杂质和土壤全部清洗干净，剩下的为混合藻类悬浮液;
d.藻类培养：取混合藻类悬浮液2-5ml，加入装有300mlBG11培养液的三角烧瓶中，置于转速为140转/min摇床上进行初步培养，室内温度控制在25-30℃，光强控制在550lx-650lx，室内培养时间7-10天后，将进行了初步培养的藻类悬浮液转移至室外进行培养；室外培养装置为100L的塑料收纳箱，每个箱子中装有BG11培养液60L，并有增氧设施1套；室外培养7-8天即可收获；将收获的藻类置于阴凉通风处，自然干燥后得到干燥藻类，待用；
e.叶绿素a和b的测定：将上述的干燥藻类，先置于65℃烘箱中，待样品质量恒定后取出，置于研钵中，研磨成粉末状，叶绿素a和b的测定采用混合液法提取叶绿素，叶绿素的提取采用混合液法（提取液：无水乙醇：丙酮：水=4.5:4.5:1）；分别称取研磨后的藻粉0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、2.0、5.0g，将称好的藻粉放入盛有10mL提取液试管内，塞上橡皮塞，每处理设3次重复；放入45℃的恒温箱中，保持24h，直至藻粉变成白色；取出，比色，测定D645、D652、D663的吸光值；计算叶绿素含量（mg/g，Fw）；叶绿素a含量（mg/g，Fw）=（12.71*D663-2.59*D645）*V/1000/m；叶绿素b含量（mg/g，Fw）=（22.88*D645-4.67*D663）*V/1000/m；叶绿素总量（mg/g，Fw）=（20.29*D645+8.04*D663）*V/1000/m。其中，m表示藻粉干重；V表示提取液体积；
f.标准曲线绘制：对叶绿素a+b与已知藻类生物量进行回归，选取回归系数最高的方程作为标准曲线；
g.自然发育藻类生物量的测定：采取单位面积的藻类结皮，采用f）步骤，描述的叶绿素的测定方法测定叶绿素a+b，根据标准曲线计算出藻类结皮的生物量。
上述藻类培养中的BG11培养液，每升BG11培养液组分如下为：MgSO4·7H2O0.07g，K2HPO40.04g，CaCl2·2H2O0.036g，NaNO31.5g，柠檬酸0.006g，柠檬酸铁胺0.006g，乙二胺四乙酸钠盐（EDTA）0.001g，CaCO30.02g；微量元素A5+Co溶液1mL；其中，A5+Co溶液中每升蒸馏水中加入H3BO32.86g，MnCl2·4H2O1.86g，ZnSO4·7H2O0.22g，Na2MoO4·2H2O0.39g，CuSO4·5H2O0.08g，Co(NO3)2·6H2O0.05g。
本发明的优点是：
1.操作简单，藻种容易采集，藻类培养避免了传统培养的提纯过程，培养方法简单，培养环境容易实现。
2.结果准确，采用混合藻类进行培养，保证了藻种组成结构与自然发育结构的接近，确保了试验结果的准确性。叶绿素的测定采用纯藻进行，排除了杂质和土壤对重量干扰，结果更接近真实值
3.该方法实现了生物土壤结皮真实生物量的测定；
4.该方法实现了生物土壤结皮与维管束植物间生物量的比较；
5.适用范围广，试验重复性好，该方法适用于不同地区、不同生境条件下发育的藻类结皮。
附图说明
图1叶绿素a+b和藻类生物量间的标准曲线。
具体实施方式
本发明适用于适宜于不同地区、不同生境条件下发育的藻类结皮生物量的测定，下面结合实例作进一步说明：
实例1：沙丘丘间低地发育的藻类结皮生物量的测定
2014年8月，在宁夏回族自治区中卫市中科院沙坡头国家站1990年建立的人工植被固沙区，在沙丘丘间低地采集发育良好的藻类结皮样品10个，每个样品的面积为9cm2。采样用自制的3cm*3cm*0.5cm的方形不锈钢框；具体的方法，如：藻类结皮样品采样、过筛、清洗、藻类培养、叶绿素a和b的测定、标准曲线绘制和自然发育藻类生物量的测定分述如下：
a.采样时首先将采样框用力按如土壤中，至采样框完全进入土壤中，用75%酒精消毒过的铲子轻轻取出不锈钢框内约50cm2藻类结皮，装入信封中待用；
b.操作前需用75%酒精对手套进行消毒，并佩戴手套，用手从信封中取出藻类结皮样品，将采集的藻类结皮样品揉碎，过0.2mm筛子，待用；
c.清洗：取过筛后的藻类结皮样品20g，浸泡在50ml蒸馏水中，静置20min。将浸泡后的藻类结皮样品放在普通医用纱布上，在蒸馏水中慢慢漂洗，直至样品中的杂质和土壤全部清洗干净，剩下的为混合藻类悬浮液;
d.藻类培养：取混合藻类悬浮液2-5ml，加入装有300mlBG11培养液的三角烧瓶中，每升BG11培养液组分为：MgSO4·7H2O0.07g，K2HPO40.04g，CaCl2·2H2O0.036g，NaNO31.5g，柠檬酸0.006g，柠檬酸铁胺0.006g，乙二胺四乙酸钠盐（EDTA）0.001g，CaCO30.02g；微量元素A5+Co溶液1mL；其中，A5+Co溶液中每升蒸馏水中加入H3BO32.86g，MnCl2·4H2O1.86g，ZnSO4·7H2O0.22g，Na2MoO4·2H2O0.39g，CuSO4·5H2O0.08g，Co(NO3)2·6H2O0.05g。将装有BG11培养液的三角烧瓶置于转速为140转/min摇床上进行初步培养，室内温度控制在25-30℃，光强控制在600lx室内培养时间7-10天后，将进行了初步培养的藻类悬浮液转移至室外进行培养；室外培养装置为100L的塑料收纳箱，每个箱子中装有BG11培养液60L，并有增氧设施1套（如家用观赏鱼增氧泵）；藻类悬浮液在室外培养一周即可收获；将收获的藻类置于阴凉通风处，自然干燥后得到干燥藻类，待用；
e.叶绿素a和b的测定：将上述的干燥藻类，先置于65℃烘箱中，待样品质量恒定后取出，置于研钵中，研磨成粉末状，分别称取研磨后的藻粉0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、2.0、5.0g，每个藻粉的量设3次重复；将称好的藻粉放入盛有10mL提取液试管内，叶绿素a和b的测定采用混合液法提取叶绿素，提取液：无水乙醇：丙酮：水=4.5:4.5:1；尔后塞上橡皮塞，放入45℃的恒温箱中，保持24h，直至藻粉变成白色；取出，比色，用紫外分光光度计测定645、652、663处波长的吸光值；计算叶绿素含量（mg/g，Fw）；叶绿素a含量（mg/g，Fw）=（12.71*D663-2.59*D645）*V/1000/m；叶绿素b含量（mg/g，Fw）=（22.88*D645-4.67*D663）*V/1000/m；叶绿素总量（mg/g，Fw）=（20.29*D645+8.04*D663）*V/1000/m。其中，m表示藻粉干重；V表示提取液体积；根据标准曲线（标准曲线如图1所示），计算藻类结皮生物量。从野外采取的10个藻类结皮样品的生物量如下：208.98、231.89、229.15、222.59、217.17、213.96、213.42、230.48、215.26、221.61g/m2；丘间低地的藻类结皮的平均生物量为220.45g/m2。
f.标准曲线绘制：对叶绿素a+b与已知藻类生物量进行回归，选取回归系数最高的方程作为标准曲线；
h.自然发育藻类生物量的测定：采取单位面积的藻类结皮，采用f）步骤，描述的叶绿素的测定方法测定叶绿素a+b，根据标准曲线计算出藻类结皮的生物量。
实例2：沙丘顶部发育的藻类结皮生物量的测定
2014年8月，在宁夏回族自治区中卫市中科院沙坡头国家站1990年建立的人工植被固沙区，在沙丘顶部低地采集发育良好的藻类结皮样品10个，每个样品的面积为9cm2。采样用自制的3cm*3cm*0.5cm的方形不锈钢框；具体的方法，如：藻类结皮样品采样、过筛、清洗、藻类培养与实施例1相同。
叶绿素a和b的测定：叶绿素的提取采用混合液法（提取液：无水乙醇：丙酮：水=4.5:4.5:1）。将采集的藻类结皮样品放入盛有10mL提取液试管内，塞上橡皮塞，每处理设3次重复；放入45℃的恒温箱中，保持24h，直至藻粉变成白色；取出，比色，测定D645、D652、D663的吸光值；计算叶绿素含量（mg/g，Fw）；叶绿素a含量（mg/g，Fw）=（12.71*D663-2.59*D645）*V/1000；叶绿素b含量（mg/g，Fw）=（22.88*D645-4.67*D663）*V/1000；叶绿素总量（mg/g，Fw）=（20.29*D645+8.04*D663）*V/1000。其中，V表示提取液体积。根据标准曲线（标准曲线如图1所示）计算藻类结皮生物量。10个藻类结皮样品的生物量如下：156.64、243.39、219.44、214.03、179.87、229.18、216.50、230.12、216.81、215.46；丘顶的藻类结皮的平均生物量为212.14g/m2。
实例1中沙丘丘间低地发育的藻类结皮平均生物量为220.45g/m2。而实例2沙丘顶的藻类结皮的平均生物量为212.14g/m2。在相同的实验条件下，实例1与实施例2藻类结皮的平均生物量不同，这主要与地形和环境有关。实例1处于两沙丘丘间低地，土壤水分含量高、风蚀量小，藻类结皮的平均生物量高；而实例2处于沙丘顶土壤水分含量低、风蚀量大、日照强度大，所以沙丘顶的藻类结皮的平均生物量低的原因在于此。

Claims (2)

1.一种生物土壤结皮中藻类生物量的测定方法，其步骤是：
a.藻类结皮样品采样：选择发育良好的藻类结皮，用铁铲将藻类结皮沿地表轻轻铲下，并装入信封；
b.过筛：用手将采集的藻类结皮样品揉碎，过0.2mm筛子，待用；
c.清洗：取过筛后的藻类结皮样品20g，浸泡在50ml蒸馏水中，静置20min；将浸泡后的藻类结皮样品放在纱布上，在蒸馏水中慢慢漂洗，直至样品中的杂质和土壤全部清洗干净，剩下的为混合藻类悬浮液;
d.藻类培养：取混合藻类悬浮液2-5ml，加入装有300mlBG11培养液的三角烧瓶中，置于转速为140转/min摇床上进行初步培养，室内温度控制在25-30℃，光强控制在550lx-650lx，室内培养时间7-10天后，将进行了初步培养的藻类悬浮液转移至室外进行培养；室外培养装置为100L的塑料收纳箱，每个箱子中装有BG11培养液60L，并有增氧设施1套；室外培养7-8天即可收获；将收获的藻类置于阴凉通风处，自然干燥后得到干燥藻类，待用；
e.叶绿素a和b的测定：将上述的干燥藻类，先置于65℃烘箱中，待样品质量恒定后取出，置于研钵中，研磨成粉末状，分别称取研磨后的藻粉0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、2.0、5.0g，每个藻粉的量为3次重复；将称好的藻粉放入盛有10mL提取液试管内，叶绿素a和b的测定采用混合液法提取叶绿素，提取液为：无水乙醇：丙酮：水=4.5:4.5:1；尔后塞上橡皮塞；放入45℃的恒温箱中，保持24h，直至藻粉变成白色；取出，比色，用紫外分光光度计测定645、652、663处波长的吸光值；计算叶绿素含量（mg/g，Fw）；叶绿素a含量（mg/g，Fw）=（12.71*D663-2.59*D645）*V/1000/m；叶绿素b含量（mg/g，Fw）=（22.88*D645-4.67*D663）*V/1000/m；叶绿素总量（mg/g，Fw）=（20.29*D645+8.04*D663）*V/1000/m；其中，m表示藻粉干重；V表示提取液体积；
f.标准曲线绘制：对叶绿素a+b与已知藻类生物量进行回归，选取回归系数最高的方程作为标准曲线；
g.自然发育藻类生物量的测定：采取单位面积的藻类结皮，采用f）步骤，描述的叶绿素的测定方法测定叶绿素a+b，根据标准曲线计算出藻类结皮的生物量。
2.根据权利要求1所述一种生物土壤结皮中藻类生物量的测定方法，其特征是上述藻类培养中的BG11培养液，每升BG11培养液组分如下为：MgSO4·7H2O0.07g，K2HPO40.04g，CaCl2·2H2O0.036g，NaNO31.5g，柠檬酸0.006g，柠檬酸铁胺0.006g，乙二胺四乙酸钠盐（EDTA）0.001g，CaCO30.02g；微量元素A5+Co溶液1mL；其中，A5+Co溶液中每升蒸馏水中加入H3BO32.86g，MnCl2·4H2O1.86g，ZnSO4·7H2O0.22g，Na2MoO4·2H2O0.39g，CuSO4·5H2O0.08g，Co(NO3)2·6H2O0.05g。
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