CN105087539A - 纳豆激酶微胶囊的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种纳豆激酶微胶囊的制备方法，其步骤如下：一、将9.0mL浓度为1.0-2.6％的海藻酸钠溶液与0.10ml纳豆激酶溶液以及1.0mL浓度为0.10-0.60％的羧甲基纤维素钠混合均匀；二、将上述混合溶液打入浓度为0.10-0.60％的CaCl₂溶液中，凝固成小球后，静置0.5-2h，然后滤出小球，换相同浓度的CaCl₂溶液继续浸泡0.5-2h，再次滤出小球，随后用蒸馏水冲洗，再用滤纸吸干，即得纳豆激酶微胶囊。经过海藻酸钠/CMC包埋的纳豆激酶无论是在相同的温度还是pH，都比游离的纳豆激酶的相对酶活要高，并且起到一定的保护作用。海藻酸钠/CMC包埋的纳豆激酶具有以下优点：粒径小、外观规则，并且酶活的回收率高、硬度强。

Description

纳豆激酶微胶囊的制备方法

技术领域

本发明涉及一种保护纳豆激酶活性的方法。

背景技术

现如今，各种新型的抗血栓药物相继出现，例如Xa因子(FXa)抑制剂、二磷酸腺苷(ADP)受体阻滞剂、凝血酶抑制剂等。但这些传统的抗血栓药物有些缺点导致其不能得到很好的应用，比如不能口服给药只能静脉注射、易引起出血、来源紧张、价格昂贵等。1987年，由日本的须见洋行等人首先发现并命名的纳豆激酶，经验证具有极好的溶栓效果。

纳豆激酶，也被称作枯草芽孢杆菌酶，是一种极其有效的溶解血栓的酶。最初是从日本一种传统的发酵食品—纳豆中分离出来的，主要是由枯草芽孢杆菌(Bacillusnatto)产生的一种丝氨酸蛋白酶。纳豆激酶不仅能够预防和治疗血管栓塞性疾病，并且与其他药物相比，它也拥有很多的优点，例如：食用的安全性高；没有相应的免疫原性；人体可以对其消化吸收；使用方式可以是静脉注射或者是直接口服；药物的半衰时间长；生产的成本较低等优点。

包埋法是指将酶分子包埋在能够将其固定的材料中，以期达到保护酶活的作用。包埋法它仅仅是在酶蛋白的外层结合，形成外部包埋结构，从而起到对酶的保护作用，因此包埋材料不需要与酶的内部结构相结合，所以包埋方法无论是对酶的空间构象或者酶的活性所起到的影响较少，并且所得到的包埋的小球，酶活的回收率相对较高。

纳豆激酶在较高的温度以及强酸强碱的条件下酶活都会受到一定程度的影响，为保持其酶活，需要对其进行包埋。

发明内容

本发明的目的是提供一种纳豆激酶微胶囊的制备方法，利用海藻酸钠包埋纳豆激酶，可以更好的保护酶的活性，免受外界环境的影响。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种纳豆激酶微胶囊的制备方法，包括如下步骤：

一、将浓度为1.0-2.6％的海藻酸钠溶液9.0mL与0.10g纳豆激酶溶液以及1.0mL浓度为0.10-0.60％的羧甲基纤维素钠(CMC)混合均匀；

二、将上述混合溶液打入浓度为0.10-0.60％的CaCl₂溶液中，凝固成小球后，静置0.5-2.0h，然后滤出小球，换相同浓度的CaCl₂溶液继续浸泡0.5-2.0h，再次滤出小球，随后用蒸馏水冲洗3-6次，再用滤纸吸干，装袋，放入4℃层析柜中备用。

本发明中，纳豆激酶的分子量为28kDa，等电点为8.58，酶活为62520U/g。

本发明具有如下优点：

1、经过海藻酸钠/CMC包埋的纳豆激酶无论是在相同的温度还是pH，都比游离的纳豆激酶的相对酶活要高，并且起到一定的保护作用。

2、海藻酸钠/CMC包埋的纳豆激酶具有以下优点：粒径小、外观规则，并且酶活的回收率高、硬度强。

附图说明

图1为海藻酸钠浓度对包埋率的影响；

图2为海藻酸钠浓度对酶活回收率的影响；

图3为海藻酸钠浓度对包埋球直径的影响；

图4为羧甲基纤维素钠浓度对包埋率的影响；

图5为羧甲基纤维素钠浓度对酶活回收率的影响；

图6为CaCl₂浓度对包埋酶的影响；

图7为CaCl₂浓度对酶活回收率的影响；

图8为CaCl₂浓度对小球直径的影响；

图9为正交实验结果极差分析图；

图10为温度对包埋物的影响；

图11为pH对包埋物的影响；

图12为储存时间对包埋的纳豆激酶稳定性的影响；

图13为不同包埋材料的包埋小球的直径的大小；

图14为不同包埋材料对酶活的影响。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。

本发明提供了一种纳豆激酶微胶囊的制备方法，研究海藻酸钠对纳豆激酶的包埋，通过海藻酸钠的浓度、羧甲基纤维素钠的浓度以及CaCl₂的浓度对包埋率以及酶活回收率的影响，以期得到最优的包埋条件。

一、海藻酸钠/CMC包埋纳豆激酶的单因素实验

1、海藻酸钠浓度对包埋纳豆激酶的影响

海藻酸钠是一种天然多聚糖，是由海带中提取的天然多糖碳水化合物，并且具有以下的优点：浓缩溶液、形成凝胶和成膜的能力，可用于生物降解，且具有稳定、安全无毒等。海藻酸钠既可以与果胶形成连续、均质、透明的可食用薄膜，还可以与维生素C混合作为涂层，涂到食物表面，起到抑菌、减少化学变质的作用。海藻酸钠的可食性以及对包埋物的保护作用，将其作为纳豆激酶的包埋材料具有极好的作用。

(1)海藻酸钠浓度对包埋纳豆激酶包埋率的影响

研究不同浓度的包埋材料海藻酸钠对纳豆激酶的包埋率影响，实验条件：羧甲基纤维素钠浓度为0.40％、CaCl₂溶液浓度为0.30％、海藻酸钠浓度分别为1.0％、1.20％、1.40％、1.60％、1.80％、2.0％、2.20％、2.40％、2.60％。并以原始加入的纳豆激酶的蛋白量为包埋率100％，其他的蛋白量与其的比值为该海藻酸钠浓度下的包埋率。包埋率计算中，蛋白质含量的主要测定方法是采用BCA试剂盒法，取少量经超声处理的样品溶液，置于96孔板中，加入混合指示剂，放在恒温培养箱中，静置0.5h，取出置于酶标仪中，测定其在562nm处的吸光度值，经换算得到其蛋白含量。实验结果如图1所示。

由图1可知，海藻酸钠包埋纳豆激酶的包埋率随着海藻酸钠浓度的逐渐的升高也是逐渐上升的然后呈现下降的趋势。包埋率最高时的海藻酸钠浓度为1.60％。海藻酸钠浓度低时，包埋率相应较低，主要是因为加入的纳豆激酶的量达到过饱和状态，导致有部分纳豆激酶未被包上；海藻酸钠浓度高时，包埋率也相应较低，主要是因为海藻酸钠浓度过高，会影响纳豆激酶的释放，从而导致相应的包埋率也降低。

(2)海藻酸钠浓度对包埋纳豆激酶酶活回收率的影响

研究不同浓度的包埋材料海藻酸钠对纳豆激酶酶活回收率的影响，实验条件：羧甲基纤维素钠浓度为0.40％、CaCl₂溶液浓度为0.30％、海藻酸钠浓度分别为1.00％、1.20％、1.40％、1.60％、1.80％、2.00％、2.20％、2.40％、2.60％。采用琼脂糖-纤维蛋白平板法测定纳豆激酶的酶活，并以其中相应浓度的未经包埋的纳豆激酶的残余酶活为相对酶活100％，其他的不同浓度的海藻酸钠对应的残余酶活与其的比值为该海藻酸钠浓度时包埋的纳豆激酶的相对酶活。实验结果如图2所示。

由图2可知，随着海藻酸钠浓度的增加，酶活回收率呈现的趋势是先逐渐升高后下降然后逐渐趋于平缓，并且在海藻酸钠浓度为1.60％的时候，酶活回收率为最高91.65％，为所有包埋的海藻酸钠浓度中的最高值。当海藻酸钠的浓度过大时，其溶液粘度很大，所形成的凝胶颗粒的体积过大，从而影响酶与底物的充分结合。

(3)海藻酸钠浓度对包埋纳豆激酶形态的影响

主要研究不同浓度的海藻酸钠对包埋的纳豆激酶形态的影响，实验条件：羧甲基纤维素钠浓度0.40％、CaCl₂溶液浓度为0.30％、海藻酸钠浓度分别为1.00％、1.20％、1.40％、1.60％、1.80％、2.00％、2.20％、2.40％、2.60％。并对不同浓度下的直径进行测量。实验结果如图3所示。

由图3可知，随着海藻酸钠浓度的增加，包埋小球的直径也是在逐渐的上升。在所有的探究实验结果中，当海藻酸钠浓度为2.60％时，包埋小球的直径达到了4.23mm。海藻酸钠浓度越高，小球的直径也随之增加的主要原因是：小球是Ca²⁺与海藻酸钠相结合形成的海藻酸钙所起的作用，故当海藻酸钠浓度的逐渐增加时，在单位体积内能与Ca²⁺结合的位点数量也相应增加，从而能形成更多的海藻酸钙，进而便可以得到直径较大的包埋酶的颗粒。并且经海藻酸钠包埋纳豆激酶得到的小球，形状呈均匀的球形。因此，要想控制包埋小球的粒径的大小，海藻酸钠的浓度的大小是其中的一个重要的因素。

2、羧甲基纤维素钠对包埋纳豆激酶的影响

羧甲基纤维素钠是使用最多的一种纤维素种类。羧甲基纤维素钠主要有以下几个方面的应用：增稠剂、黏结剂、抗再沉凝剂等。

(1)羧甲基纤维素钠浓度对包埋纳豆激酶包埋率的影响

羧甲基纤维素钠以其优良的粘结力、安全性，故选为包埋纳豆激酶的粘结剂。研究不同浓度的羧甲基纤维素钠对纳豆激酶的包埋率以及酶活回收率的影响，实验条件：海藻酸钠浓度1.60％、CaCl₂溶液浓度为0.30％、羧甲基纤维素钠浓度为0.10％、0.20％、0.30％、0.40％、0.50％、0.60％、0.70％、0.80％。以原始加入的纳豆激酶的蛋白量为包埋率100％，其他的蛋白量与其的比值为该羧甲基纤维素浓度下的包埋率。实验结果如图4所示。

由图4可知，随着羧甲基纤维素钠浓度的逐渐升高，其对纳豆激酶的包埋率呈逐渐上升后下降的趋势，并且在羧甲基纤维素钠浓度为0.50％时，其对纳豆激酶的包埋率为所有浓度的最高值。

(2)羧甲基纤维钠对纳豆激酶酶活回收率的影响

研究不同浓度的羧甲基纤维素钠对纳豆激酶酶活回收率的影响，海藻酸钠浓度1.60％、CaCl₂溶液浓度为0.30％、羧甲基纤维素钠浓度为0.10％～0.80％。以其中相应浓度的未包埋的纳豆激酶的残余酶活为相对酶活100％，其他不同浓度的海藻酸钠对应的残余酶活与其的比值为该浓度时的相对酶活。实验结果如图5所示。

由图5可知，随着羧甲基纤维素浓度的增加，固定化纳豆激酶酶活回收率的变化趋势为先上升后下降。在羧甲基纤维素钠的浓度为0.50％时，其酶活回收率是最高的。其主要原因是，当羧甲基纤维素钠的浓度过高时，导致混合体系的粘度增加，故而使纳豆激酶的活力下降。

3、CaCl₂溶液的浓度对包埋纳豆激酶的影响

(1)浓度对包埋纳豆激酶包埋率的影响

研究不同浓度的CaCl₂对包埋纳豆激酶包埋率的影响，实验条件：海藻酸钠浓度1.60％、羧甲基纤维素钠溶液浓度为0.50％、CaCl₂浓度为0.10％、0.20％、0.30％、0.40％、0.50％、0.60％、0.70％、0.80％。以原始加入的纳豆激酶的蛋白量为包埋率100％，其他的蛋白量与其的比值为该CaCl₂浓度下的包埋率。实验结果如图6所示。

由图6可知，CaCl₂浓度的逐渐升高，海藻酸钠/CMC包埋纳豆激酶的包埋率是呈现先升高后降低的趋势。并在CaCl₂浓度为0.30％时，包埋纳豆激酶的包埋率达到最高。

(2)CaCl₂浓度对包埋纳豆激酶酶活回收率的影响

研究不同浓度的CaCl₂对包埋纳豆激酶酶活回收率的影响，实验条件：海藻酸钠浓度1.60％、羧甲基纤维素钠溶液浓度为0.50％、CaCl₂浓度为0.10％、0.20％、0.30％、0.40％、0.50％、0.60％、0.70％、0.80％。以其中相应浓度未包埋的纳豆激酶的残余酶活为相对酶活100％，其他不同浓度的CaCl₂对应的残余酶活与其的比值为该浓度时的相对酶活。实验结果如图7所示。

由图7可知，随着CaCl₂浓度的不断的增加，纳豆激酶的酶活回收率也随之相应的先升高后降低。并当CaCl₂浓度为0.30％时，其纳豆激酶的酶活回收率为77.10％；当CaCl₂浓度超过0.30％时，经包埋的纳豆激酶的酶活回收率的变化趋势逐渐趋于平缓。

经海藻酸钠/CMC包埋的纳豆激酶的酶活回收率，随着CaCl₂浓度的变化，其变化趋势是大致相同的。CaCl₂的浓度主要影响的是所形成的凝胶的交联程度，CaCl₂溶液的浓度越高，包埋酶颗粒的结构致密程度大大增加，凝胶内部的阻力也随之增大。因此，浓度大的CaCl₂溶液会明显降低包埋酶的酶活力。

(3)CaCl₂浓度对包埋纳豆激酶形态的影响

研究不同浓度的CaCl₂浓度对包埋纳豆激酶形态的影响，实验条件：海藻酸钠浓度1.60％、羧甲基纤维素钠溶液浓度为0.50％、CaCl₂浓度为0.10％、0.20％、0.30％、0.40％、0.50％、0.60％、0.70％、0.80％。使用游标卡尺测定其直径大小，实验结果如图8所示。

由图8可知，随着CaCl₂浓度的增加，其微球的大小逐渐减小，并且小球的硬度也相应增加。在CaCl₂浓度为0.60％时，得到的小球的平均直径为2.05mm，并且包埋小球的硬度也相应增加。

CaCl₂的浓度主要影响的是所形成的凝胶的交联程度，CaCl₂溶液的浓度越高，酶颗粒的结构致密程度大大增加，凝胶内部的阻力也随之增大。因此，浓度大的CaCl₂溶液会明显降低包埋酶的酶活力，所得到的包埋酶的颗粒也会越来越小。

二、海藻酸钠包埋纳豆激酶的正交试验

1、正交实验因素及实验结果

(1)海藻酸钠/CMC包埋纳豆激酶的正交实验因素

以单因素中的实验结果，选择海藻酸钠浓度为1.60％、羧甲基纤维素钠浓度为0.50％和CaCl₂浓度为0.30％作为正交实验较优点，进行包埋纳豆激酶的正交实验。以单因素的实验结果选择海藻酸钠浓度、羧甲基纤维素钠浓度和CaCl₂浓度进行包埋纳豆激酶的正交实验，实验选取L9(3⁴)正交实验，正交实验的因素如表4-1所示。

表1正交实验因素水平表

(2)海藻酸钠/CMC包埋纳豆激酶的正交实验因素

以纳豆激酶的酶活回收率作为测定指标，以得到最佳的实验因素条件。按照L9(3⁴)正交实验表设计的实验方案以及得到的实验结果如表2所示。

表2正交实验结果

由表2可知，影响纳豆激酶酶活回收率的因素按其影响大小的排序为：羧甲基纤维素钠浓度>海藻酸钠浓度>CaCl₂浓度。并且羧甲基纤维素钠浓度对酶活回收率的影响是最大的，其极差远远的大于其他两个因素。由正交试验的结果可知，包埋纳豆激酶的最优化条件是：海藻酸钠的浓度为1.80％，羧甲基纤维素钠的浓度为0.50％，CaCl₂浓度的浓度为0.30％。

由于此组合在正交表中并没有出现，故进行验证试验，所得的酶活回收率是该组合所得的残余酶活与实验编号为5的残余酶活的比值，其结果为105.23％。经验证，海藻酸钠浓度为1.80％、羧甲基纤维素钠浓度为0.50％、CaCl₂浓度为0.30％时，所得包埋酶的酶活回收率为最高，此条件为最佳优化条件。

2、正交实验结果的极差分析

对海藻酸钠/CMC包埋纳豆激酶的正交实验结果进行极差分析，并利用SPSS19.0对实验结果做方差分析，实验结果如表3以及图9所示。

表3方差分析

注：R²＝0.986(AdjR²＝0.956)；*，表示差异显著(sig<0.05)；0，表示差异不显著(sig>0.05)

由表3方差分析可以看出，海藻酸钠/CMC包埋纳豆激酶的正交实验，其相关系数为98.6％，校正相关系数为95.6％，相关性较高，说明本实验误差较小，实验各项均达到理想的水平。

三、海藻酸钠/CMC包埋物的稳定性研究

1、温度对海藻酸钠/CMC包埋物的影响

纳豆激酶在加热温度高于40℃时，其相对酶活急剧下降，故选择几个较高温度作为研究的指标，以比较海藻酸钠/CMC包埋物的酶活稳定性与游离的同样浓度的纳豆激酶的酶活稳定的差异，从而得到海藻酸钠对纳豆激酶受温度影响的作用。

选取四种不同的加热温度即40℃、50℃、60℃、70℃，并将相应浓度游离的纳豆激酶以及经海藻酸钠/CMC包埋的纳豆激酶放入相应温度水浴锅中，加热30min后，取出迅速冷去，以此来研究不同的加热温度对海藻酸钠/CMC包埋物稳定性的影响。实验结果是以25℃时游离纳豆激酶的残余酶活为相对酶活100％，其他的加热温度下的残余酶活与其的比值为该温度下的相对酶活。实验结果如图10所示。

由图10可知，在这四种不同的温度条件下，经过包埋的纳豆激酶的相对酶活要比游离的纳豆激酶的相对酶活相应较高，但不同的温度对酶活的保护力也是不同的。在温度为40℃时，游离的纳豆激酶的相对酶活是98.45％，包埋的纳豆激酶的相对酶活是99.24％。在温度为50℃时，游离的纳豆激酶的相对酶活是51.69％，包埋的纳豆激酶的相对酶活为71.67％，两者相差很大，是测试的温度中相差最大的一组。在温度60℃以及70℃时，包埋的与游离的纳豆激酶的相对酶活相比也有一定程度的提升。

由以上实验结果可知，经此方法包埋得到的包埋纳豆激酶在不同的温度条件下，相对于未包埋的纳豆激酶相对酶活都有所提升。故可知，经过对海藻酸钠的包埋，从而对纳豆激酶的酶活起到了相应程度的保护作用。

2、pH对海藻酸钠/CMC包埋物稳定性的影响

pH主要是通过改变纳豆激酶空间结构，从而使其酶活变性。故选取六个不同的pH即4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、9.5、10.5，配置相应pH下的缓冲溶液，并以该缓冲溶液配置相同浓度的纳豆激酶溶液。

研究不同的pH对包埋物酶活性的影响，并以pH＝6.5的缓冲溶液配置的相应浓度的游离纳豆激酶的残余酶的活性为相对酶活100％，其他条件下的残余酶活与其的比值即为该pH下的相对酶活。实验结果如图11所示。

由图12可知，在这六个不同的pH值的条件下，包埋的纳豆激酶的相对酶活都比游离的纳豆激酶的酶活要高一些。在pH＝4.5的条件下，游离的纳豆激酶的相对酶活78.80％，包埋酶的相对酶活是87.70％；在pH＝6.5的条件下，游离的纳豆激酶的相对酶活是100％，包埋酶的相对酶活是102.47％；在pH＝8.5的条件下，游离的纳豆激酶的相对酶活是38.09％，包埋酶的相对酶活是55.99％，在此pH下，经过海藻酸钠/CMC包埋的纳豆激酶与未包埋的纳豆激酶的酶活相差较大。

由以上的实验结果可知，在不同pH的溶液环境下，采用这种方法包埋的纳豆激酶的相对酶活得到了一定程度的保护。

3、海藻酸钠/CMC包埋物的储存稳定性研究

选取两种不同的温度即4℃和37℃为包埋纳豆激酶物质的储存稳定性的研究温度，将足够多的样品分别置于4℃层析柜以及37℃恒温培养箱中，并保证温度的稳定性，避免温度变化引起的误差。

储存的样品每隔2d分别取样一次，采用琼脂糖-纤维蛋白平板法测定酶活，测定其相应温度在该储存时间下的酶活回收率，共研究20d内的包埋物的酶活回收率。测定海藻酸钠/CMC包埋物在不同的温度下的储存稳定性，并以最初包埋的纳豆激酶的残余酶活为相对酶活100％，其他储存时间的经过海藻酸钠/CMC包埋的纳豆激酶的残余酶活与其的比值为该储存时间下的相对酶活。实验结果如图12所示。

由图12可知，包埋的纳豆激酶的酶活随着储存时间的延长，其酶活的回收率逐渐下降；并且储存温度的高低对包埋纳豆激酶的回收率影响也很大。在4℃的储存温度的条件下，储存时间为4d时，其酶活回收率为90.35％；储存时间为10h时，其酶活回收率为78.26％；储存时间为20d时，其酶活回收率为66.77％。在37℃的储存温度的条件下，储存时间为2d时，其酶活回收率为87.30％；储存时间为10h时，其酶活回收率为70.47％；储存时间为20h时，其酶活回收率为50.25％。由以上数据以及图4-13储存稳定性的趋势可知，较高温度的储存条件对包埋纳豆激酶的酶活回收率的影响要比低温储存时对包埋纳豆激酶的酶活回收率的影响要大，并且随着储存时间的延长，其差别的效果越大。在储存20d后，其包埋纳豆激酶的酶活回收率的差别能达到16.52％。

故由以上的实验结果可知，经此方法包埋的纳豆激酶适合在较低温度下进行储存，但储存时间过长时，也会对纳豆激酶的酶活产生一定的影响。

四、混合多糖制备纳豆激酶微胶囊的比较

卡拉胶、壳聚糖、海藻酸钠这三种天然高分子包埋材料，广泛的应用多种物质的包埋，故选用这三种材料对纳豆激酶进行包埋，比较其包埋的各项指标。

1、混合多糖包埋纳豆激酶的颗粒大小比较

采用三种不同材料对纳豆激酶进行包埋，主要是海藻酸钠与羧甲基纤维素、海藻酸钠与卡拉胶、壳聚糖这三种不同的材料进行复合。按照一定的操作方法使其对纳豆激酶进行包埋，得到小球，通过游标卡尺对包埋小球的直径。实验结果如图13所示。

由图13可知，经海藻酸钠与卡拉胶混合制备的包埋小球要比其他两种材料制备的小球的直径要大。海藻酸钠与羧甲基纤维素钠混合制备的包埋小球的平均直径为2.62mm，海藻酸钠与卡拉胶混合制备的包埋小球的平均直径为3.36mm，壳聚糖制备的小球为2.63mm。

2、混合多糖包埋纳豆激酶的形态的观察

(1)海藻酸钠/CMC包埋纳豆激酶的形态

经正交实验得到的包埋最优化条件包埋的纳豆激酶：用9.0mL浓度为1.80％的海藻酸钠溶液与0.10g纳豆激酶溶液，以及1.0mL的0.50％的羧甲基纤维素钠(CMC)混合，用磁力搅拌器混合均匀后。然后用2.5mL的注射器打入0.30％的CaCl₂溶液中，凝固成小球后，静置0.5h，然后滤出小球，换相同浓度的CaCl₂溶液继续浸泡一定的时间，再次滤出小球，随后用蒸馏水冲洗三次，再用滤纸吸干，装袋，放入4℃层析柜中备用。

经最优化条件制备的包埋的纳豆激酶大小均一，形太均一，且硬度强，能抵抗一定程度的外力。

(2)海藻酸钠/卡拉胶包埋纳豆激酶的形态

海藻酸钠/卡拉胶包埋纳豆激酶的条件为：海藻酸铵浓度为1.80％，卡拉胶浓度为1.0％，CaCl₂浓度为0.30％。配置含有1.80％的海藻酸钠以及1％的卡拉胶溶液10mL，加入0.10g纳豆激酶，然后用2.5mL的注射器打入0.30％的CaCl₂溶液中，凝固成小球后，静置0.5h，放入平板中备用。

经海藻酸钠与卡拉胶混合材料所得的包埋小球颗粒偏大，但形状规则，且有一定的硬度。

(3)壳聚糖包埋纳豆激酶的形态

壳聚糖包埋纳豆激酶的条件：壳聚糖浓度2.0％，V(NaOH溶液浓度为10％)：V(乙醇浓度为95％)＝4︰1，37℃水浴振荡。

壳聚糖包埋的纳豆激酶的小球粒度均匀、富有弹性，但硬度不够，易受到损害。

3、混合多糖包埋纳豆激酶的酶活大小的比较

采用三种不同的包埋材料对纳豆激酶进行包埋，主要是海藻酸钠与羧甲基纤维素、海藻酸钠与卡拉胶、壳聚糖这三种不同的材料进行复合。按照一定的操作方法使其对纳豆激酶进行包埋，并以相应浓度的自由纳豆激酶的残余酶活为相对酶活100％，三种不同材料的残余酶活与其的比值为该材料包埋的纳豆激酶的相对酶活。实验结果如图14所示。

由图14可知，经过三种不同材料包埋的纳豆激酶的相对酶活，相差无几。三种包埋的相对酶活的大小比较是：壳聚糖>海藻酸钠与羧甲基纤维素钠>海藻酸钠与卡拉胶。但是壳聚糖形成的包埋小球，因其硬度较小，易于受到外界条件的破坏，故还是选择海藻酸钠与羧甲基纤维素钠作为包埋材料。

五、结论

(1)海藻酸钠/CMC包埋纳豆激酶的单因素实验中，可知在海藻酸钠浓度为1.60％时，包埋纳豆激酶的包埋率以及酶活回收率为最高；羧甲基纤维素钠的浓度为0.50％时，其包埋率以及酶活回收率最高；CaCl₂浓度为0.30％时，其包埋率以及酶活回收率最高。

(2)海藻酸钠/CMC包埋纳豆激酶的正交实验结果可知，包埋纳豆激酶的最佳条件是：海藻酸钠浓度为1.80％；羧甲基纤维素钠的浓度为0.50％；CaCl₂浓度为0.30％。

(3)由海藻酸钠/CMC包埋物的稳定性可知，经过包埋的纳豆激酶无论是在相同的温度还是pH，都比游离的纳豆激酶的相对酶活要高，并且起到一定的保护作用；在包埋纳豆激酶的储存稳定性中，可知即使是经过包埋的小球，还是需要在较低温的环境中进行长期储存，从而能够保证纳豆激酶的酶活能够较高的保存。

(4)混合多糖的研究发现，海藻酸钠/CMC包埋的纳豆激酶，有以下优点：粒径小、外观规则并且酶活的回收率高、硬度强。

Claims (6)

1.一种纳豆激酶微胶囊的制备方法，其特征在于所述方法步骤如下：

一、将9.0mL浓度为1.0-2.6％的海藻酸钠溶液与0.10ml纳豆激酶溶液以及1.0mL浓度为0.10-0.60％的羧甲基纤维素钠混合均匀；

二、将上述混合溶液打入浓度为0.10-0.60％的CaCl₂溶液中，凝固成小球后，静置0.5-2h，然后滤出小球，换相同浓度的CaCl₂溶液继续浸泡0.5-2h，再次滤出小球，随后用蒸馏水冲洗，再用滤纸吸干，即得纳豆激酶微胶囊。

2.根据权利要求1所述的纳豆激酶微胶囊的制备方法，其特征在于所述海藻酸钠浓度为1.80％。

3.根据权利要求1所述的纳豆激酶微胶囊的制备方法，其特征在于所述羧甲基纤维素钠浓度为0.50％。

4.根据权利要求1所述的纳豆激酶微胶囊的制备方法，其特征在于所述CaCl₂浓度为0.30％。

5.根据权利要求1所述的纳豆激酶微胶囊的制备方法，其特征在于所述蒸馏水冲洗的次数为3-6次。

6.根据权利要求1所述的纳豆激酶微胶囊的制备方法，其特征在于所述纳豆激酶的酶活为62520U/g。