CN105085614A - 一种链丝菌素甲磺酸钠及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及链丝菌素甲磺酸钠，具体地，本发明涉及链丝菌素B甲磺酸钠。本发明还涉及链丝菌素B甲磺酸钠的制备方法、药物组合物，及其在医药领域的用途。本发明所述的链丝菌素甲磺酸钠(例如链丝菌素B甲磺酸钠)具有显著的抗肿瘤活性，尤其对肠癌具有显著的抑制作用，同时比链丝菌素的毒性小，具有广阔的成药前景。

Description

一种链丝菌素甲磺酸钠及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及链丝菌素甲磺酸钠化合物，具体地，本发明涉及链丝菌素B甲磺酸钠。本发明还涉及链丝菌素B甲磺酸钠的制备方法、药物组合物及其在医药领域的用途。

背景技术

链丝菌素(Streptothticin)是一类N-糖苷类抗生素，是最早发现的抗生素之一，其中链丝菌素F由Waksman和Woodruff于1942年从淡紫灰色链霉菌(Streptomyceslavendulae)的培养基中首先发现(Proc.Soc.Exptl.Biol.Med.49:207-210,1942)。

链丝菌素共包含7个化合物(如式Ⅰ所示)，各化合物的结构类似，是差一个β-赖氨酸的同系物，都包含一分子D-古洛糖胺(D-gulosamine)，一分子链里定内酰胺(Streptolidinelactam)和数量不等(1～7个)的β-赖氨酸。

链丝菌素具有较强的抑菌作用(Antibiotiki(Moscow),10(12):1066-9,1965；Antibiotiki(Moscow)14(1):48-51,1969；FiziologicheskiAktivnyeVeshchestva,12:93-6,1980；MeditsinskayaParazitologiyaiParazitarnyeBolezni,49(1):52-5,1980)，现已作为农药抗生素用于多种病害的防治中，如淡紫灰链霉菌海南变种(Streptomyceslavendulaevar.hainanensis)发酵而得的中生菌素(ZL200310103250.X)。

链丝菌素对肿瘤细胞也具有较强的抑制作用，如中国专利申请CN201310140325.5公开了链丝菌素B的抗肿瘤用途，其对人胃癌细胞BGC823具有显著的抑制作用，但研究中发现其毒性太大，成药前景较差。

发明内容

本发明的一个方面提供一种如式Ⅱ所示的链丝菌素甲磺酸钠或其立体异构体，其中n为1-7的整数：

在本发明的一个实施方案中，所述链丝菌素甲磺酸钠为链丝菌素B甲磺酸钠，即n为5，其结构如式Ⅲ所示：

本发明所述的链丝菌素甲磺酸钠(例如链丝菌素B甲磺酸钠)具有显著的抗肿瘤活性，尤其对肠癌具有显著的抑制作用，同时比链丝菌素的毒性小，具有广阔的成药前景。

本发明的另一个方面提供了一种链丝菌素甲磺酸钠的制备方法，步骤包括：a)链丝菌素加水溶解，加入甲醛溶液，使二者反应；b)向步骤a)的反应产物中加入亚硫酸氢钠溶液；c)步骤b)中的反应溶液，用凝胶过滤层析柱分离纯化；d)步骤c)中得到的产品低温冷冻干燥。

本发明所述的链丝菌素是指含量不小于50％的链丝菌素，优选不小于70％，更优选不小于90％。链丝菌素含量的测定方法采用UV-HPLC法，色谱条件如下：色谱柱：AllsphereSCX，5μm，GRACE，4.6×250mm；流速：1mL/min；检测波长：210nm；流动相：A：0.05mol/LNaH₂PO₄+5％乙腈，pH＝4.0；B：0.05mol/LNaH₂PO₄+1mol/LNaClO₄+5％乙腈，pH＝4.0。梯度洗脱程序如表1所示：

表1梯度洗脱表

本发明所述的链丝菌素可商业获得且不限来源，也可以来源自发酵生产，发酵所用菌种可选自申请CN201310140368.3公开的毒三素链霉菌(Streptomycestoxytricini)SIPI-2012406，保藏编号为CCTCCNO:M2013059。

本发明所述的链丝菌素甲磺酸钠的制备方法，其中，步骤a)中使用的链丝菌素与甲醛的摩尔比为1:12～1:30，优选为1:15；步骤b)中链丝菌素与亚硫酸氢钠的摩尔比为1:10～1:33，优选为1:20；步骤a)和步骤b)的反应温度为1～50℃，优选温度为15～30℃；步骤a)的反应时间为30～120分钟，优选60～90分钟，步骤b)的反应时间为2～24小时，优选8～18小时；步骤a)和步骤b)的反应pH控制在4.0～7.5，优选pH控制在5.5～6.5；步骤c)凝胶过滤层析柱的分子量分离范围为100～10000，优选分子量分离范围为100～7000；步骤d)分离纯化反应产物所使用的流动相为水或甲醇、乙醇、乙腈等有机溶剂，优选水。

在本发明的一个实施方案中提供了链丝菌素B甲磺酸钠的制备方法，步骤包括：a)链丝菌素B加水溶解,然后加入甲醛溶液，链丝菌素B与甲醛的摩尔比为1:12～1:30，优选1:12～1:18，更优选1:15,调节pH控制在4.0～7.5,优选pH控制在5.5～7.0,最优选6.5，反应温度为1～50℃，优选15～30℃，反应时间为30～120分钟，优选60～100分钟，最优选90分钟；b)加入亚硫酸氢钠溶液，链丝菌素B与亚硫酸氢钠的摩尔比为1:10～1:33，优选1:15～1:25，更优选1:20,调节pH控制在4.0～7.5,优选pH控制在5.5～7.0,最优选6.5，反应温度为1～50℃，优选15～30℃，反应时间为2～24小时，优选8～18小时，最优选12小时；c)步骤b)中的反应溶液，用凝胶过滤层析柱分离纯化，所述凝胶过滤层析柱分子量分离范围为100～10000，优选分子量分离范围为100～7000，纯化温度为15～30℃,纯化所用流动相为水或甲醇、乙醇、乙腈等有机溶剂，优选水；d)合并步骤c)中电导<700μs/cm的目标组分，低温冷冻干燥。

本发明所述的制备方法采用西佛氏碱反应制备链丝菌素甲磺酸钠，反应操作简单、反应完全、条件温和。分离纯化采用凝胶过滤层析法，操作简单、容易控制和放大、能耗低。

本发明所述的制备方法，因为反应中甲醛和亚硫酸氢钠相对链丝菌素过量，使得得到的产物链丝菌素甲磺酸钠的修饰率为100％，且只含有甲醛、亚硫酸氢钠等小分子杂质，易于通过凝胶过滤层析柱进行分离纯化。

本发明的再一个方面另提供了链丝菌素B甲磺酸钠或其立体异构体在医药领域的用途,其特征在于，所述用途为在制备治疗肿瘤药物中的用途，其中所述的肿瘤包括但不限于：肠癌、胰腺癌、胃癌、肾癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌(包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌)、前列腺癌、膀胱癌、上皮癌、食管癌、宫颈癌、子宫内膜癌、肾上腺皮质癌、基底细胞癌、腺癌、支气管癌、肝瘤、胆管癌、绒膜癌、胚胎癌、白血病、黑色素瘤、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、霍奇金氏淋巴瘤、非-霍奇金氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤或原发性脑瘤，优选地，所述肿瘤选自胃癌、肺癌、神经胶质瘤、肠癌或肝癌，更优选地，所述肿瘤选自肠癌。

本发明所述的链丝菌素B甲磺酸钠的抗肿瘤活性可以通过测定其相对肿瘤增殖率T/C(％)来鉴定。本发明运用HT29肠癌裸小鼠移植瘤模型评估链丝菌素B甲磺酸钠的抗肿瘤活性，移植瘤为HT29肿瘤，以多西他赛为阳性对照。体内抗肿瘤活性测定结果表明，链丝菌素B甲磺酸钠具有明显的抗肿瘤活性，相对肿瘤增殖率T/C(％)优于多西他赛。

本发明所述的链丝菌素B甲磺酸钠的急性毒性可以通过测定小鼠的半数致死率(LD50)来鉴定。采用尾部静脉注射从低剂量给药，给药后观察和记录动物体重变化和毒性反应。急性毒性测定结果表明，链丝菌素B甲磺酸钠的急性毒性较链丝菌素B有明显下降。在抗肿瘤的有效剂量内,链丝菌素B甲磺酸钠不会引起试验动物的死亡。链丝菌素B甲磺酸钠表现出明显的安全性优势。

本发明的还一个方面提供了链丝菌素B甲磺酸钠的药物组合物，其包含链丝菌素B甲磺酸钠和一种或多种药学上可接受的辅料。

本发明所述的药物组合物可通过将本发明的化合物与适宜的药学上可接受的辅料组合制备，所述辅料包括但不仅限于载体、稀释剂或赋形剂，且可配制成固体、半固体、液体或气体制剂，如片剂、丸剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、膏剂、乳剂、悬浮剂、溶液剂、栓剂、注射剂、吸入剂、凝胶剂、微球及气溶胶等等。

给予本发明所述的药物组合物的典型途径包括但不限于口服、直肠、透粘膜、经肠给药，或者局部、经皮、吸入、肠胃外、舌下、阴道内、鼻内、眼内、腹膜内、肌内、皮下、静脉内给药。优选的给药途径是口服给药。

可以通过常规的混合、填充或压片方法来制备固体口服组合物。例如，可通过下述方法获得：将本发明所述的化合物与固体赋形剂混合，任选地碾磨所得的混合物，如果需要则加入其它合适的辅料，然后将该混合物加工成颗粒，得到片剂。适合的赋形剂包括但不仅限于：稀释剂，例如淀粉、乳糖、蔗糖、微晶纤维素；润湿剂与黏合剂，例如蒸馏水、乙醇、羟丙基纤维素、羟丙甲纤维素、聚维酮、明胶、聚乙二醇；崩解剂，例如干淀粉、羧甲淀粉钠、低取代羟丙基纤维素、交联羧甲纤维素钠、交联聚维酮、海藻酸；润滑剂，例如硬脂酸镁、微粉硅胶、滑石粉、氢化植物油、聚乙二醇类、月桂醇硫酸钠等。片剂可以不包衣，也可以通过已知的方法包衣以延迟在胃肠道的崩解和吸收，达到在长时间内的持续性作用。

供口服的组合物也可采用硬明胶胶囊剂型，所述硬明胶胶囊剂型中，活性成分与惰性固体稀释剂混合，例如碳酸钙、磷酸钙或高岭土，或采用软明胶胶囊剂型，其中将活性成分与水或油性介质混合，例如花生油、液体石蜡或橄榄油。

本发明所述的液体制剂包括但不仅限于注射剂或输液，适合的赋形剂包括但不仅限于溶剂，例如注射用水、乙醇、植物油；增溶剂，例如聚山梨酯20、聚山梨酯40、聚山梨酯80；防腐剂，例如苯甲醇、三氯叔丁醇；抗氧化剂，例如亚硫酸钠、硫代硫酸钠；等渗调节剂，例如氯化钠、葡萄糖、甘油；缓冲剂，例如磷酸盐缓冲液；稳定剂，例如甘氨酸、肌酐、烟酰胺、辛酸钠等。可采用本领域公知的技术制备注射剂，例如将本发明化合物按处方配置后进行过滤、灌封、灭菌即得。

具体实施方式

以下实施例仅用于说明本发明的具体实施方式，而非任何对本发明的限制。

实施例1链丝菌素B甲磺酸钠制备方法与纯化

称取160mg链丝菌素B(约0.158×10^-3mol),HPLC法测定纯度达98％以上，加水溶解并定容至3mL,然后加甲醛溶液192μL(约2.366×10^-3mol),搅拌并用1mol/L的NaOH溶液调节pH至6.5，维持反应90min后，向其中加入616μL(2.367×10^-3mol)40％的亚硫酸氢钠溶液，然后再用1mol/L的NaOH溶液调节pH至6.5，并在搅拌下反应12h后停止反应。取此反应液，采用superdexpeptide10/300GL在AKTA层析系统上纯化，流动相为水。在整个操作过程中控制温度在15～30℃。合并电导＜700μs/cm的目标组分，用低温冷冻干燥法进行样品的干燥。所得链丝菌素B甲磺酸钠为217mg白色无定形粉末，收率为80.4％，修饰率为100％。

实施例2

实施例1中40％亚硫酸氢钠溶液体积增至823μL(摩尔量约为3.16×10^-3mol)，其他操作同实施例1，得链丝菌素B甲磺酸钠样品235mg，收率为87.1％，修饰率100％。

实施例3

实施例1中加入甲醛后的反应时间增至120min，其他操作同实施例1，得链丝菌素B甲磺酸钠样品198mg，收率为73.4％，修饰率100％。

实施例4

实施例1中加入亚硫酸氢钠后的反应时间增至18h，其他操作同实施例1，得链丝菌素B甲磺酸钠样品209mg，收率为77.5％，修饰率100％。

实施例5

实施例1中的反应温度保持在26～30℃，其他操作同实施例1，得链丝菌素B甲磺酸钠样品206mg，收率为76.4％，修饰率100％。

实施例6体内抗肿瘤活性测定

运用HT29肠癌裸小鼠移植瘤模型评估链丝菌素B和链丝菌素B甲磺酸钠静脉给药的抗肿瘤活性，以相对肿瘤增殖率T/C(％)作为抗肿瘤活性的评价指标，以多西他赛(DOC)为阳性对照。

具体步骤：

1)药物配制:

Control：生理盐水。

DOC：称取样品5mg，加入0.1mLEtOH和0.1mLEL(聚氧乙烯蓖麻油)，超声助溶用生理盐水稀释至5mL。

链丝菌素B：称取样品1.6mg，加入10mL生理盐水。

链丝菌素B甲磺酸钠：称取样品1.5mg，加入10mL生理盐水。

2)移植瘤

HT29细胞悬液接种裸小鼠皮下，体内传3代使用。

3)试验方法

无菌条件下，将HT29肿瘤剪成2-3mm^3，插块法接种于裸小鼠皮下。裸鼠移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径，待肿瘤生长至100-300mm^3后将动物随机分成6组：Contol、DOC、链丝菌素B和链丝菌素B甲磺酸钠。每组动物6只，各组d0\7\14天i.v.给药，阴性对照组同时给等量溶媒。使用测量瘤径的方法，动态观察受试物抗肿瘤的效应，每周测2-3次瘤体积，同时称重，记录数据；每日观察与记录小鼠一般表现。试验结束时取出瘤块，称重，拍照。试验结果以相对肿瘤增殖率T/C(％)作为抗肿瘤活性的评价指标。

4)相对肿瘤增殖率的计算方法

肿瘤体积(tumorvolume,TV)，计算公式为：TV＝1/2×a×b2，其中a、b分别表示长宽。

相对肿瘤体积(relativetumorvolume，RTV)，计算公式为：RTV＝TVt/TV0。其中TV0为分笼给药时(即d0)肿瘤体积，TVt为每一次测量时的肿瘤体积。

相对肿瘤增殖率T/C(％)，计算公式为：TRTV：治疗组RTV，CRTV：阴性对照组RTV。

5)结果

表2各样品对移植于裸鼠的人体肿瘤肠癌HT29T/C(％)的影响

体内抗肿瘤活性测定结果表明，在不引起实验动物死亡的前提下，20mg/kg的链丝菌素B甲磺酸钠对人体肿瘤肠癌HT29表现出有效的抗肿瘤活性，静脉给药第18天T/C为35％。

实施例7急性毒性测定

采用尾部静脉注射(i.v.)给药方法，测定链丝菌素B和链丝菌素B甲磺酸钠对小鼠的半数致死剂量LD50。

具体步骤为:

1)实验动物

小鼠：ICR，雄性，来源：上海西普尔-必凯实验动物有限公司，合格证号：SCXK(沪)2013-0016，实验体重：18-22g。

2)试验方法

ICR小鼠20只，雄性，分为4组，每组5只；设链丝菌素B(1.0mg/mL)和链丝菌素B甲磺酸钠(1.0mg/mL)，1次/周，连续给药3-4次，观察毒性反应，如果动物体重不出现明显下降，则增加给药剂量，直至动物出现毒性反应为主。

3)试验结果

表3各样品对正常小鼠的急性毒性

结果表明，链丝菌素B甲磺酸钠的急性毒性比链丝菌素B降低了约50倍，且在抗肿瘤的有效剂量内链丝菌素B甲磺酸钠不会引起试验动物的死亡。

实施例8含链丝菌素B甲磺酸钠的药物组合物

1、片剂的制备

将上述物料混合，然后采用直接压片法制成片剂。

2、胶囊的制备

将上述物料混合，并将混合物填充到明胶胶囊中制备胶囊。

Claims (7)

1.一种如式Ⅲ所示的链丝菌素B甲磺酸钠，或其立体异构体：

2.一种制备权利要求1的链丝菌素B甲磺酸钠或其立体异构体的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

a)链丝菌素B加水溶解，加入甲醛溶液，链丝菌素B与甲醛的摩尔比为1:12～1:30，pH控制在4.0～7.5，反应温度为1～50℃，反应时间为30～120分钟；

b)向步骤a)的反应产物中加入亚硫酸氢钠溶液，链丝菌素B与亚硫酸氢钠的摩尔比为1:10～1:33，pH控制在4.0～7.5，反应温度为1～50℃，反应时间为2～24小时；

c)用凝胶过滤层析柱分离纯化步骤b)中的反应溶液，所述凝胶过滤层析柱分子量分离范围为100～10000，纯化温度为15～30℃，纯化所用流动相选自水、甲醇、乙醇或乙腈；

d)合并步骤c)中电导<700μs/cm的目标组分，低温冷冻干燥。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

a)链丝菌素B加水溶解，加入甲醛溶液，链丝菌素B与甲醛的摩尔比为1:12～1:18，pH控制在5.5～7.0，反应温度为15～30℃，反应时间为60～100分钟；

b)向步骤a)的反应产物中加入亚硫酸氢钠溶液，链丝菌素B与亚硫酸氢钠的摩尔比为1:15～1:25，pH控制在5.5～7.0，反应温度为15～30℃，反应时间为8～18小时；

c)用凝胶过滤层析柱分离纯化步骤b)中的反应溶液，所述凝胶过滤层析柱分子量分离范围为100～7000，纯化温度为15～30℃，纯化所用流动相选自水、甲醇、乙醇或乙腈；

d)合并步骤c)中电导<700μs/cm的目标组分，低温冷冻干燥。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

a)链丝菌素B加水溶解，加入甲醛溶液，链丝菌素B与甲醛的摩尔比为1:15，pH控制在6.5，反应温度为15～30℃，反应时间为90分钟；

b)向步骤a)的反应产物中加入亚硫酸氢钠溶液，链丝菌素B与亚硫酸氢钠的摩尔比为1:20，pH控制在6.5，反应温度为15～30℃，反应时间为12小时；

c)用凝胶过滤层析柱分离纯化步骤b)中的反应溶液，所述凝胶过滤层析柱分子量分离范围为100～7000，纯化温度为15～30℃，纯化所用流动相选自水；

d)合并步骤c)中电导<700μs/cm的目标组分，低温冷冻干燥。

5.一种药物组合物，其含有权利要求1所述的链丝菌素B甲磺酸钠或其立体异构体，以及一种或多种药学上可接受的辅料。

6.权利要求1所述的链丝菌素B甲磺酸钠或其立体异构体或权利要求5所述的药物组合物在制备治疗肿瘤药物中的用途，所述肿瘤选自胃癌、肺癌、神经胶质瘤、肠癌或肝癌。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述肿瘤选自肠癌。