CN105078945A - Pedinophyllol B在制备血管保护性药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了Pedinophyllol?B在制备血管保护性药物中的应用,属于药物领域。通过MTT法和LDH活性检测证实Pedinophyllol?B对H2O2氧化损伤ECV-304细胞具有保护作用;通过细胞上清液MDA含量、SOD活性、GSH-Px活性的测定,证实Pedinophyllol?B有清除自由基和活性氧的抗氧化特性,可以进一步研究开发成制备血管保护性药物。
Description
技术领域
本发明涉及化合物PedinophyllolB的新用途,具体涉及PedinophyllolB在制备神经保护药物中的应用。
背景技术
NaLiu等人首次分离纯化出化合物PedinophyllolB,并将成果发表在著名天然产物杂志JournalofNaturalProduct上(HighlyOxygenatedent-Pimarane-TypeDiterpenoidsfromtheChineseLiverwortPedinophylluminterruptumandTheirAllelopathicActivities,J.Nat.Prod.,2013,76,1647-1653)。
目前尚未有该化合物的活性报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种PedinophyllolB的医药用途。
上述目的是通过如下技术方案实现的:
PedinophyllolB在制备血管保护性药物中的应用,所述PedinophyllolB化学结构式如下,
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容。
实施例1:PedinophyllolB的分离制备及结构确证
PedinophyllolB的制备方法同文献报道的制备方法(HighlyOxygenatedent-Pimarane-TypeDiterpenoidsfromtheChineseLiverwortPedinophylluminterruptumandTheirAllelopathicActivities,J.Nat.Prod.,2013,76,1647-1653)。
结构确证:分子式为C20H28O3,不饱和度为7。核磁共振氢谱数据δH(ppm,DMSO-d6,500MHz):H-2(2.82,dt,J=4.9,13.3),H-2(2.23,m),H-3(1.79-1.83,m),H-5(2.39,dd,J=3.8,12.6),H-6(2.28,m),H-7(6.80,d,J=4.8),H-11(1.96,dt,J=17.9,2.5),H-11(2.36,m),H-12(1.73,m),H-12(2.24,m),H-15(5.70,dd,J=10.7,17.6),H-16(5.07,d,J=10.7),H-16(4.83,d,J=17.6),H-17(1.23,s),H-18(1.02,s),H-19(1.19,s),H-20(1.19,s);核磁共振碳谱数据δC(ppm,DMSO-d6,150Hz):218.5(C,1-C),37.1(CH2,2-C),41.5(CH2,3-C),32.7(C,4-C),44.2(CH,5-C),24.6(CH2,6-C),137.8(CH,7-C),138.4(C,8-C),76.8(C,9-C),54.1(C,10-C),26.8(CH2,11-C),31.1(CH2,12-C),50.8(C,13-C),203.1(C,14-C),142.5(CH,15-C),115.1(CH2,16-C),24.8(CH3,17-C),32.0(CH3,18-C),22.4(CH3,19-C),15.4(CH3,20-C)。结构确证数据与文献报道一致,因此可以确定本发明制备的化合物即为文献报道的PedinophyllolB。
实施例2:PedinophyllolB的药理作用试验
一、材料和仪器
血管内皮细胞(ECV-304)由山东大学医学院免疫教研室馈赠。PedinophyllolB自制,HPLC归一化纯度大于98%。RPMI-1640干粉培养基、胰蛋白酶购于美国Gibeo公司。胎牛血清购于天津TBD公司。MTT、琼脂糖、AilllexinV-FITC购于美国Sigma公司。LDH、MDA、SOD、GSH-Px测定试剂盒购于南京建成生物工程研究所。DMSO购于中国医药(集团)上海化学试剂有限公司。苏木素购于福州迈新生物技术有限公司。Rhodamine123购于美国Solarbic公司。阳性药川芎嗪购自上海源叶生物科技有限公司。
倒置光学显微镜(日本OlymPus公司),二氧化碳培养箱(美国FormaScientific公司),电子分析天平(ER-182A型)(日本A&D公司),超净工作台(2HJH-1209型)(上海智城分析仪器制造有限公司),流式细胞仪(FACSVantage型)(美国BeetonDiehnson公司),恒温振荡器(江苏太仓市实验设备厂),2420Vietor3多标记分析仪(美国Perki此lmerLifeseienee公司),721型可见紫外光栅分光光度计(上海精密科学有限公司),电热恒温水浴箱(上海医疗仪器三厂生产),酶联免疫检测仪(MK3Multiskan)(上海ThLabsystem仪器公司)。
二、试验方法
1、细胞培养
ECV-304细胞以RPMI-1640培养基于37℃,5%CO2培养箱中传代培养。镜下观察,待细胞汇合率达到70%以上时用胰蛋白酶消化传代,以生长稳定的第3-5代细胞制备细胞悬液。
2、细胞分组及处理
取生长良好的ECV-304细胞制成细胞悬液,接种于96孔、24孔、6孔细胞培养板或培养皿中,37℃,5%CO2培养24h。随机分为六组:①正常组;②H2O2模型组(150μmol/L);③川芎嗪(TMP)(50μmol/L)+H2O2组;④PedinophyllolB(10μmol/L)+H2O2组;⑤PedinophyllolB(50μmol/L)+H2O2组;⑥PedinophyllolB(100μmol/L)+H2O2组。
3、实验项目及检测指标
3.1MTT法检测细胞活力
将生长良好的ECV-304细胞制备成5×104/mL的细胞悬液,按每孔100μL接种于96孔板,置37℃,5%CO2孵育24h。细胞分组及处理上。继续培养6h和12h后,每孔加入10μLMTT溶液(终浓度0.5mg/L)置37℃,5%CO2培养箱孵育4h后,每孔加入100μLDMSO,静置10min后振荡60s,30min内置酶联免疫检测仪上检测570nm处吸光度值(OD570)。
按公式:细胞损伤抑制率=(用药组OD570-模型组OD570)/(正常组OD570-模型组OD570)×100%,计算细胞损伤抑制率。
3.2LDR释放率测定
取生长良好的ECV-304细胞制成l×105/mL的细胞悬液接种于24孔板,置37℃,5%CO2孵育24h。细胞分组及处理同上。继续培养6h和12h,收集培养上清液。PBS洗涤2次后,每孔加入0.5mL细胞裂解液(150mmol/LNaCl,150mmol/LTris-HCI,lmmol/LEDTA,1%TritonX-100),于4℃静置15min后振荡数分钟,10000rpm,4℃离心10min收集细胞裂解液,参照LDH试剂盒说明书分别测定上清液和细胞裂解液中的LDH活性。
按公式:LDH释放率=上清液中LDH活性/(上清液中LDH活性+细胞裂解液中LDH活性)`×100%,计算LDH释放率。
3.3酶生化法测定MDA含量、SOD活力、GSH-Px活力
取生长良好的ECV-304细胞制成1×105/mL的细胞悬液接种于24孔板,置37℃,5%CO2孵育24h。细胞分组及处理同上。继续培养12h,收集培养上清液。按MDA、SOD、GSH-Px检测试剂盒说明书测定细胞MDA含量、SOD活力、GSH-Px活力。
4、数据处理
MicrosoftExcel自带的统计软件进行处理,实验数据以表示,组间差异用t检验。
三、结果及结论
1、PedinophyllolB对H2O2损伤ECV-304细胞生存率的影响
正常活细胞线粒体能量代谢过程中产生琥珀酸脱氢酶,可将淡黄色MTT还原成不溶于水的蓝紫色的甲腊结晶,结晶数量与活细胞数成正比。本实验结果显示:ECV-304细胞经H2O2(150μmol/L)氧化损伤6h和12h后,细胞OD值明显降低且与正常组比具有统计意义(P<0.01),表明细胞活力下降。而PedinophyllolB对细胞具有保护作用,能显著抑制H2O2对细胞的氧化损伤,提高存活率。作用6h,50、100μmol/LPedinophyllolB对细胞损伤抑制率分别为16.67%(P<0.05)和28.21%(P<0.01)。作用12h,10、50、100μmol/LPedinophyllolB对细胞损伤抑制率提高为24.85%(P<0.05),29.64%(P<0.01)和38.47%(P<0.01)。见表1(**P<0.01vsNormal;#P<0.05,#P<0.01vsH2O2group;▲P<0.05,▲▲P<0.01vsTMPgroup,下同)。
2、PedinophyllolB对H2O2损伤ECV-304细胞LDH释放率的影响
乳酸脱氢酶能催化乳酸生成丙酮酸,丙酮酸与2,4-二硝基苯肼反应生成丙酮酸二硝基苯腙,在碱性溶液中呈棕红色,通过比色测定反应产物可间接求出乳酸脱氢酶活力。实验结果表明:与正常组相比,模型组ECV-304细胞LDH释放率显著增高(P<0.01)。与模型组比,PedinophyllolB各组细胞LDH释放率均减少:10、50、100μmol/LPedinophyllolB作用6h,细胞的LDH释放率降为20.54%(P<0.01)和21.22%(P<0.01);50、100μmol/LPedinophyllolB作用12h,细胞的LDH释放率降为33.64%(P<0.01)和29.53%(P<0.01)。PedinophyllolB随浓度的增加,对氧化损伤ECV-304细胞的保护作用也逐渐增强,呈现出一定的量效关系。结果见表2。
3、PedinophyllolB对H2O2损伤ECV-304细胞MDA含量、SOD、GSH-Px活力的影响
实验结果表明:与正常组比模型组ECV-304细胞培养液中MDA含量显著增高(P<0.01)。与模型组相比,10、50、100μmol/LPedinophyllolB组细胞MDA生成量均明显减少,分别为3.00±0.79nmol/ml(P<0.05),2.86±0.75nmol/m1(P<0.05)和2.69±0.45nmol/ml(P<0.01)。PedinophyllolB各浓度组组间对照显示,随浓度的增加,PedinophyllolB对ECV-304细胞脂质过氧化损伤的保护作用也逐渐增强,呈现一定的量效关系。结果见表3。
实验结果表明:与正常组比,模型组ECV-304细胞SOD活性显著降低(P<0.01)。与模型组相比,50、100μmol/LPedinophyllolB均可增强ECV-304细胞的SOD活性,SOD活性分别提高为17.9±l.34U/ml(P<0.05)和19.25±0.81U/ml(P<0.01)。且随浓度的增加,细胞的SOD活性也逐渐提高,表明PedinophyllolB可增强ECV-304细胞的抗氧自由作用,具一定量效关系;10μmol/LPedinophyllolB虽也可提高SOD活性,但不具有显著统计意义。见表3。
实验结果表明:与正常组相比,模型组ECV-304细胞培养液中GSH-Px活性显著降低(P<0.01)。与模型组相比,10、50、100μmol/LPedinophyllolB组细胞GSH-Px活性均显著提高,分别为73.8±10.3U/mL(P<0.05),92.2±8.5U/mL(P<0.01)和102.5±10.3U/mL(P<0.01)。且随PedinophyllolB浓度的增加,ECV-304细胞的GSH-Px活性也逐渐提高,表明细胞抗氧化作用的能力也逐渐增强,呈现一定的量效关系。结果见表3。
总结,本实验采用H2O2作为外源性自由基生成系统,能够诱导血管内皮细胞(ECV-304))氧化应激损伤,促进细胞凋亡。通过MTT法和LDH活性检测证实PedinophyllolB对H2O2氧化损伤细胞具有保护作用;通过细胞上清液MDA含量、SOD活性、GSH-Px活性的测定,证实PedinophyllolB有清除自由基和活性氧的抗氧化特性。
表1PedinophyllolB对H2O2损伤ECV-304细胞生存率的影响(n=8)
表2PedinophyllolB对H2O2损伤ECV-304细胞LDH释放率的影响(n=8)
表3PedinophyllolB对H2O2损伤ECV-304细胞MDA含量、SOD、GSH-Px活力的影响(n=8)
Claims (1)
1.PedinophyllolB在制备血管保护性药物中的应用,所述PedinophyllolB化学结构式如下,
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