CN105125564A - Salpichrolide T在制备血管保护药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了Salpichrolide？T在制备血管保护药物中的应用，属于药物领域。研究发现Salpichrolide？T对H₂O₂氧化损伤ECV-304细胞具有保护作用，还具有清除自由基和活性氧的抗氧化特性，可以进一步研究开发成血管保护的药物。

Description

Salpichrolide T在制备血管保护药物中的应用

技术领域

本发明涉及化合物SalpichrolideT的新用途，具体涉及SalpichrolideT在制备血管保护药物中的应用。

背景技术

VivianaE.Nicotra等人首次分离纯化出化合物SalpichrolideT，并将成果发表在著名天然产物杂志JournalofNaturalProduct上(WithanolideswithPhytotoxicActivityfromTwoSpeciesoftheGenusSalpichroa:S.origanifoliaandS.tristisvar.lehmannii，J.Nat.Prod.，2013，76，2219-2225)。

目前尚未有该化合物关于血管保护的活性报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种SalpichrolideT的医药用途。

上述目的是通过如下技术方案实现的：

SalpichrolideT在制备血管保护药物中的应用，所述SalpichrolideT化学结构式如下，

具体实施方式

下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容。

实施例1：SalpichrolideT的分离制备及结构确证

SalpichrolideT的制备方法同文献报道的制备方法(WithanolideswithPhytotoxicActivityfromTwoSpeciesoftheGenusSalpichroa:S.origanifoliaandS.tristisvar.lehmannii，J.Nat.Prod.，2013，76，2219-2225)。

结构确证：白色无定形粉末；综合HR-ESI-MS，该化合物的分子式为C₂₈H₃₄O₆，不饱和度为12。核磁共振氢谱数据δ_H(ppm，DMSO-d₆，400MHz)：H-2(6.02，dd，J＝10.3，3.0)，H-3(6.78，ddd，J＝10.3，5.0，2.3)，H-4(3.14，dt，J＝19.6，2.8)，H-4(1.92，dd，J＝19.6，5.0)，H-6(3.23，d，J＝5.0)，H-7(2.68，m)，H-7(1.83，m)，H-8(2.80，m)，H-9(2.21，td，J＝12.1，1.8)，H-11(2.88，ddd，J＝11.4，5.0，1.8)，H-11(1.32，m)，H-12(4.93，dd，J＝10.8，5.0)，H-15(7.12，d，J＝8.3)，H-16(7.09，dd，J＝8.3，1.5)，H-18(7.43，br，s)，H-19(1.40，s)，H-20(2.79，m)，H-21(1.24，d，J＝7.0)，H-22(3.87，ddd，J＝11.3，5.8，2.5)，H-23(1.85，m)，H-23(1.58，m)，H-26(4.98，d，J＝9.0)，H-27(1.38，s)，H-28(1.37，s)，26-OH(3.43，d，J＝9.0)；核磁共振碳谱数据δ_C(ppm，DMSO-d₆，100MHz)：202.2(C，1-C)，128.8(CH，2-C)，142.6(CH，3-C)，34.2(CH₂，4-C)，64.5(C，5-C)，58.8(CH，6-C)，30.2(CH₂，7-C)，33.5(CH，8-C)，33.7(CH，9-C)，48.3(C，10-C)，36.1(CH₂，11-C)，69.8(CH，12-C)，139.7(C，13-C)，137.2(C，14-C)，126.1(CH，15-C)，127.2(CH，16-C)，141.2(C，17-C)，125.9(CH，18-C)，14.2(CH₃，19-C)，43.2(CH，20-C)，17.3(CH₃，21-C)，67.4(CH，22-C)，33.4(CH₂，23-C)，64.9(C，24-C)，63.7(C，25-C)，91.7(CH，26-C)，16.5(CH₃，27-C)，18.8(CH₃，28-C)。结构确证数据与文献报道一致，因此可以确定本发明制备的化合物即为文献报道的SalpichrolideT。

实施例2：SalpichrolideT的药理作用试验

一、材料和仪器

血管内皮细胞(ECV-304)由山东大学医学院免疫教研室馈赠。SalpichrolideT自制，制备方法见实施例1，HPLC归一化纯度大于98％。RPMI-1640干粉培养基、胰蛋白酶购于美国Gibeo公司。胎牛血清购于天津TBD公司。MTT、琼脂糖、AnnexinV-FITC购于美国Sigma公司。LDH、MDA、SOD、GSH-Px测定试剂盒购于南京建成生物工程研究所。DMSO购于中国医药(集团)上海化学试剂有限公司。苏木素购于福州迈新生物技术有限公司。Rhodamine123购于美国Solarbic公司。阳性药川芎嗪购自上海源叶生物科技有限公司。

倒置光学显微镜(日本OlymPus公司)，二氧化碳培养箱(美国FormaScientific公司)，电子分析天平(ER-182A型)(日本A&D公司)，超净工作台(ZHJH-1209型)(上海智城分析仪器制造有限公司)，流式细胞仪(FACSVantage型)(美国BeetonDiehnson公司)，恒温振荡器(江苏太仓市实验设备厂)，1420Vietor³多标记分析仪(美国PerkinElmerLifescience公司)，721型可见紫外光栅分光光度计(上海精密科学有限公司)，电热恒温水浴箱(上海医疗仪器三厂生产)，酶联免疫检测仪(MK3Multiskan)(上海ThermoLabsystem分析仪器公司)。

二、试验方法

1、细胞培养

ECV-304细胞以RPMI-1640培养基于37℃，5％CO₂培养箱中传代培养。镜下观察，待细胞汇合率达到70％以上时用胰蛋白酶消化传代，以生长稳定的第3-5代细胞制备细胞悬液。

2、细胞分组及处理

取生长良好的ECV-304细胞制成细胞悬液，接种于96孔、24孔、6孔细胞培养板或培养皿中，37℃，5％CO₂培养24h。随机分为六组：①正常组；②H₂O₂模型组(150μmol/L)；③川芎嗪(TMP)(50μmol/L)+H₂O₂组；④SalpichrolideT(10μmol/L)+H₂O₂组；⑤SalpichrolideT(50μmol/L)+H₂O₂组；⑥SalpichrolideT(100μmol/L)+H₂O₂组。

3、实验项目及检测指标

3.1MTT法检测细胞活力

将生长良好的ECV-304细胞制备成5×10⁴/mL的细胞悬液，按每孔100μL接种于96孔板，置37℃，5％CO₂孵育24h。细胞分组及处理上。继续培养6h和12h后，每孔加入10μLMTT溶液(终浓度0.5mg/L)置37℃，5％CO₂培养箱孵育4h后，每孔加入100μLDMSO，静置10min后振荡60s，30min内置酶联免疫检测仪上检测570nm处吸光度值(OD₅₇₀)。

按公式：细胞损伤抑制率＝(用药组OD₅₇₀-模型组OD₅₇₀)/(正常组OD₅₇₀-模型组OD₅₇₀)×100％，计算细胞损伤抑制率。

3.2LDR释放率测定

取生长良好的ECV-304细胞制成l×10⁵/mL的细胞悬液接种于24孔板，置37℃，5％CO₂孵育24h。细胞分组及处理同上。继续培养6h和12h，收集培养上清液。PBS洗涤2次后，每孔加入0.5mL细胞裂解液(150mmol/LNaCl，150mmol/LTris-HCI，lmmol/LEDTA，1％TritonX-100)，于4℃静置15min后振荡数分钟，10000rpm，4℃离心10min收集细胞裂解液，参照LDH试剂盒说明书分别测定上清液和细胞裂解液中的LDH活性。

按公式：LDH释放率＝上清液中LDH活性/(上清液中LDH活性+细胞裂解液中LDH活性)`×100％，计算LDH释放率。

3.3酶生化法测定MDA含量、SOD活力、GSH-Px活力

取生长良好的ECV-304细胞制成1×10⁵/mL的细胞悬液接种于24孔板，置37℃，5％CO₂孵育24h。细胞分组及处理同上。继续培养12h，收集培养上清液。按MDA、SOD、GSH-Px检测试剂盒说明书测定细胞MDA含量、SOD活力、GSH-Px活力。

4、数据处理

MicrosoftExcel自带的统计软件进行处理，实验数据以表示，组间差异用t检验。

三、结果及结论

1、SalpichrolideT对H₂O₂损伤ECV-304细胞生存率的影响

正常活细胞线粒体能量代谢过程中产生琥珀酸脱氢酶，可将淡黄色MTT还原成不溶于水的蓝紫色的甲腊结晶，结晶数量与活细胞数成正比。本实验结果显示：ECV-304细胞经H₂O₂(150μmol/L)氧化损伤6h和12h后，细胞OD值明显降低且与正常组相比具有统计学意义(P<0.01)，表明细胞活力下降。而SalpichrolideT对细胞具有保护作用，能显著抑制H₂O₂对细胞的氧化损伤，提高存活率。作用6h，50、100μmol/LSalpichrolideT对细胞损伤抑制率分别为16.67％(P<0.05)和28.21％(P<0.01)。作用12h，10、50、100μmol/LSalpichrolideT对细胞损伤抑制率提高为24.85％(P<0.05)，29.64％(P<0.01)和38.47％(P<0.01)。见表1(**P<0.01vsNormal；^#P<0.05，^#P<0.01vsH₂O₂group；^▲P<0.05，^▲▲P<0.01vsTMPgroup，下同)。

2、SalpichrolideT对H₂O₂损伤ECV-304细胞LDH释放率的影响

乳酸脱氢酶能催化乳酸生成丙酮酸，丙酮酸与2,4-二硝基苯肼反应生成丙酮酸二硝基苯腙，在碱性溶液中呈棕红色，通过比色测定反应产物可间接求出乳酸脱氢酶活力。结果表明：与正常组相比，模型组ECV-304细胞LDH释放率显著增高(P<0.01)。与模型组比，SalpichrolideT各组细胞LDH释放率均减少：10、50、100μmol/LSalpichrolideT作用6h，细胞的LDH释放率降为20.54％(P<0.01)和21.22％(P<0.01)；50、100μmol/LSalpichrolideT作用12h，细胞的LDH释放率降为33.64％(P<0.01)和29.53％(P<0.01)。SalpichrolideT随浓度的增加，对氧化损伤ECV-304细胞的保护作用也逐渐增强，呈现出一定的量效关系。结果见表2。

3、SalpichrolideT对H₂O₂损伤ECV-304细胞MDA含量、SOD、GSH-Px活力的影响

实验结果表明：与正常组比模型组ECV-304细胞培养液中MDA含量显著增高(P<0.01)。与模型组相比，10、50、100μmol/LSalpichrolideT组细胞MDA生成量均明显减少，分别为3.00±0.79nmol/mL(P<0.05)，2.86±0.75nmol/mL(P<0.05)和2.69±0.45nmol/mL(P<0.01)。SalpichrolideT各浓度组组间对照显示，随浓度的增加，SalpichrolideT对ECV-304细胞脂质过氧化损伤的保护作用也逐渐增强，呈现一定的量效关系。结果见表3。

实验结果表明：与正常组相比，模型组ECV-304细胞SOD活性显著降低(P<0.01)。与模型组相比，50、100μmol/LSalpichrolideT均可增强ECV-304细胞的SOD活性，SOD活性分别提高为17.9±l.34U/mL(P<0.05)和19.25±0.81U/mL(P<0.01)。且随浓度的增加，细胞的SOD活性也逐渐提高，表明SalpichrolideT可增强ECV-304细胞的抗氧自由作用，具一定量效关系；10μmol/LSalpichrolideT虽也可提高SOD活性，但不具有显著统计学意义。见表3。

实验结果表明：与正常组相比，模型组ECV-304细胞培养液中GSH-Px活性显著降低(P<0.01)。与模型组相比，10、50、100μmol/LSalpichrolideT组细胞GSH-Px活性均显著提高，分别为73.8±10.3U/mL(P<0.05)，92.2±8.5U/mL(P<0.01)和102.5±10.3U/mL(P<0.01)。且随SalpichrolideT浓度的增加，ECV-304细胞的GSH-Px活性也逐渐提高，表明细胞抗氧化作用的能力也逐渐增强，呈现一定的量效关系。结果见表3。

总结：本实验采用H₂O₂作为外源性自由基生成系统，能够诱导血管内皮细胞(ECV-304)氧化应激损伤，促进细胞凋亡。通过MTT法和LDH活性检测证实SalpichrolideT对H₂O₂氧化损伤细胞具有保护作用；通过细胞上清液MDA含量、SOD活性、GSH-Px活性的测定，证实SalpichrolideT有清除自由基和活性氧的抗氧化特性。

表1SalpichrolideT对H₂O₂损伤ECV-304细胞生存率的影响(n＝8)

表2SalpichrolideT对H₂O₂损伤ECV-304细胞LDH释放率的影响(n＝8)

表3SalpichrolideT对H₂O₂损伤ECV-304细胞MDA含量、SOD、GSH-Px活力的影响(n＝8)

Claims (1)

1.SalpichrolideT在制备血管保护药物中的应用，所述SalpichrolideT化学结构式如下，