CN105063233A

CN105063233A - 一种黄麻炭疽病抗性基因区段的snp分子标记

Info

Publication number: CN105063233A
Application number: CN201510607272.2A
Authority: CN
Inventors: 张立武; 祁建民; 高红; 陶爱芬; 徐建堂; 林荔辉; 方平平; 林培清
Original assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Current assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Priority date: 2015-09-23
Filing date: 2015-09-23
Publication date: 2015-11-18
Anticipated expiration: 2035-09-23
Also published as: CN105063233B

Abstract

本发明属于黄麻的育种技术领域，涉及一种黄麻炭疽病抗性基因区段的SNP分子标记。其步骤为：通过黄麻重组自交系群体基因组DNA的提取，酶切，产物纯化测序、SNP筛查分析确定其基因型；采用单因素随机区组设计鉴定黄麻重组自交系群体炭疽病抗性性状；对该重组自交系群体进行遗传连锁图谱构建和QTL定位；根据QTL定位结果，发现QTL？<i>qAR</i>.N10解释的表型变异为20.13%，表现为主效QTL。其区段包含26个SNP分子标记，其核苷酸序列及变异位点如序列表SEQ？ID？NO.1-26所示。本发明为黄麻炭疽病抗性育种提供了新的分子标记，可用于黄麻抗炭疽病分子标记辅助选择育种。

Description

一种黄麻炭疽病抗性基因区段的SNP分子标记

技术领域

本发明属于黄麻的育种技术领域，涉及一种黄麻炭疽病抗性基因区段的SNP分子标记。

背景技术

单核苷酸多态性（SNP，SingleNucleotidePolymorphisms）是指在基因组上单个核苷酸的变异形成的遗传标记，包括转换、颠换、缺失/插入等。其数量多，多态性丰富。从理论上来看，每一个SNP位点都可以有4种不同的变异形式。SNP在CG序列上出现较为频繁，多是C转换为T，这是因为是CG序列中的胞嘧啶（C)常被甲基化，而后自发地脱氨成为胸腺嘧啶（T）。SNP是第三代遗传标志，作物许多重要农艺性状差异都可能与SNP有关。SNP被广泛应用于遗传图谱构建、基因定位、品种鉴定等领域。如在DNA水平上筛查和检测与奶山羊泌乳性状密切相关的分子遗传标记的专利申请“奶山羊SCD基因的单核苷酸多态性及其检测方法”（公开号CN101705290A）。

黄麻(Corchorusspp.)是继棉花之后最重要的天然纤维作物之一。目前，黄麻(Corchorusspp)广泛在亚热带和热带地区种植，主要分布在印度、孟加拉国、中国、乌兹别克斯坦、尼泊尔、越南、缅甸、津巴布韦、泰国与埃及等。由于黄麻韧皮部纤维具有可生物降解，可再生和天然纤维的特点，被称为黄金纤维。

众所周知，病虫害会大大降低了黄麻的产量与纤维品质。而炭疽病是影响黄麻生产的主要病害之一。炭疽菌在全国均有发生，尤其在温暖湿润的地区。炭疽菌可以危害到黄麻茎秆等，进而直接影响到黄麻的产量与品质，成为国内外黄麻生产和利用上的一大瓶颈。

目前，国内外黄麻SNP分子标记的研究仍十分有限，仅少数实验室开始了有关工作，如Biswas等进行黄麻SNP分子标记开发及其遗传连锁图谱构建(Biswas等，2015，MolecularBreeding，35（5）：1-10)。鉴于黄麻SNP分子标记数目多，还有大量的未被发现，且开展黄麻炭疽病SNP标记对于黄麻纤维产量和品质的改良具有重要的应用价值。因此，开展黄麻炭疽病抗性基因区段的SNP分子标记的研究，对于开发具有我国知识产权的SNP标记显得十分迫切和必要。

发明内容

本发明的目的在于提供了黄麻炭疽病抗性基因区段的SNP分子标记及其核苷酸序列，为黄麻炭疽病抗性育种提供了新的分子标记。

本发明实现的技术方案：

本发明通过黄麻重组自交系群体基因组DNA的提取，BfaI与MseI酶切，产物纯化测序、SNP筛查分析确定基因型，根据测序检测到的基因型利用EXCEL软件进行数据处理，MapQTL5.0软件用于基因型与炭疽病抗性表型的显著性差异分析，得到26个SNP分子标记。所述黄麻SNP分子标记编号为Marker10514，Marker15132，Marker15713，Marker23360，Marker19857，Marker13539，Marker19482，Marker16051，Marker27006，Marker17579，Marker35896，Marker19650，Marker35678，Marker27385，Marker28811，Marker32863，Marker23852，Marker25102，Marker33314，Marker28047，Marker35589，Marker32497，Marker27955，Marker26827，Marker30248，Marker32758，各编号所对应的黄麻SNP分子标记及其核苷酸序列为SEQIDNO.1-26所示。

黄麻炭疽病抗性QTLqAR.A10区段的26个SNP标记序列如下所示。

Marker10514：

GGTCATATAAACGGTCAATCTCTATGAAATTCTCGCGTTGCATAATCGATTTGGGTCAATTCAGTCCAAAAT[A/G]TTTTGGATTATTTACAT

Marker15132：

ACCAATACATTCTTGTATATATACTAAA[T/C]AGTATTTGAAACATCTATTATCCTTTCCTTTCACATAAATGTTGTAATAAATTCTATCCCC

Marker15713：

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Marker23360：

ATTCGAAGTCAAATTGACTAAAACACCAAATAATGAAAACTTTCTCTCGAATAATAAGT[C/T]GAGCTGAATTTGAGTTTCATTATACTCAAC

Marker19857：

CCTGATAATAGGAAAATGAGAAAAAAATGTTTTTCTTAT[A/-]GATGTTATGGAGCTTTCTATAATTCTTTTATCTGCTATTCAAGTGATAGT

Marker13539：

AAAAAAACTCCAAATTATGCAGGTCTCTGCCAGTGGAATGTGCT[-/T]ACTTACAGGCTTTTTGGTATAAGATGATATATTGTTTTCCACAGA

Marker19482：

AAAGATTCTAGATGCTTATGTTTGCCTTGTGGTCCTCATTTCTCAAACACAATTTTTTTCA[T/C]ATAGACTTTTGCTTGTTCTCACTCTGTG

Marker16051：

GGTTGCGT[A/T]TGGTTTCGTGGTATGTAGTGGGAAAGTGTGGTAAGTCCTAGGAAAGTGTTACTTTTTTTTCACTTGTATTTCTCTTGTATT

Marker27006：

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Marker17579：

TCAGTATATATTTTTTGTTTTTGGTAAGTATGACTAATGGACATTA[C/G]GTAGAGTTGCCGAAACCCAAAATATCTACCTCCATTTTATTGT

Marker35896：

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Marker19650：

TGCACGTTATCT[G/T]GTACTTCTAGTTATTGGCTCTCTCTTGTTTGTCTATGTTTACAAACACGTGAAATTTTTATTTTTTTTTTATTTCAT

Marker35678：

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Marker27385：

GAAAATTTTGAAATGAATTGTCAATTTCATTTGGTTCCCATATA[T/C]ACGTTTCTTGATCTAATCTATGGAGAGATTCATTCAGTAAGTACA

Marker28811：

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Marker32863：

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Marker23852：

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Marker25102：

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Marker33314：

TTTCACGTAAAGTAATTTATTTCAACCCC[C/T]TCAAACTTATATGTATGTGATTTCATTTTTGTTTCAATCTACTGTAGGTATGTGATCTGA

Marker28047：

AAAAAAATAACTTCTTCGTTTTGTAGCAAACATTATGAACATCAC[-/G]AAGGCCAACAAGCGGTTGATTCAAGTGGTTTGACACTTGTTCCCC

Marker35589：

TTAGACTAGGCACCAAAAATCAAGCAAAACAGAGTCGAGGCC[-/T]TCGGGCTTGTCACGCTTCTAATATTGTTTATCCTATTTTTGTTCCTAA

Marker32497：

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Marker27955：

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Marker26827：

TGATGGGAGAACAATCAAGTGGCCTGTATGGAATTTTT[T/-]GCATCAGTTTTTCCATTATAGAACCTAGCATCCACTACATGGGATTCAACC

Marker30248：

ATCAATCATCTTTCCTACC[G/A]TAACAACTTATAAAGCTAATGCAATATGGAGGAAATGTCTGAAGGTTCGAATCTACAAATGTAAATTCAA

Marker32758：

GCAGGTCTCAGTTTCGAGACCCTGCGTAGCCAGCTGCCCCT[A/G]TTGCCCATGACGTGTCATGACTAGTCATCCCATGTAGCAAAACTCCAC

本发明的具体步骤是：

(1)黄麻重组自交系群体构建：利用优良栽培品种“黄麻179”与野生品系“爱店野黄麻”为亲本构建F₁，通过连续自交，得到89份株系的重组自交系群体。

(2)基因组DNA提取：采用CTAB法提取黄麻重组自交系群体89份株系及其亲本的基因组DNA。

(3)SNP分子标记的开发：SNP标记分型按照北京百迈客生物科技有限公司公司SLAF标记操作说明进行（CN103088120A）。完成多态性标记开发后，首先对亲本编码基因型，一个字母代表一种基因型，确定分离类型后，再检测子代基因型，用相应字母表示。假设双亲均为杂合且没有公共基因型，分离类型定义为ab×cd，父本基因型为ab，母本基因型为cd，子代检测到a和c两个基因型即定位ac。

(4)黄麻SNP遗传连锁图谱构建：用Joinmap软件进行两点连锁分析，获得一张包含913个SLAF标记的遗传连锁图，包含11个连锁群，图谱总长1621cM，标记间平均图距1.6cM。

(5)黄麻重组自交系群体炭疽病抗性性状鉴定：2014年夏于福建农林大学试验田播种89个重组自交系及亲本。采用单因素随机区组设计，3次重复，单行区，行长1.2m，株行距0.1m×0.3m。每个株系30株，重复3次。待黄麻长到50cm左右时，将准备好的最强致病力的FJ2菌株菌饼采用伤口接种。接种15d后进行病斑测量。

(6)分子标记与抗病基因的连锁分析：采用软件MapQTL5.0多QTL模型（MQM）作图法，进行黄麻炭疽病抗性的QTL定位和检测。

本发明的积极效果如下：

(1)分离并鉴定了26个黄麻的SNP分子标记，经在国际基因数据库中检索，证明为新的DNA标记。

(2)利用上述开发的SNP分子标记用于144份黄麻品系的抗性种质筛选，发现18份抗病株系。进一步利用大田接种鉴定其抗性，发现鉴定结果与田间抗病吻合率达97.3％。

附图说明

图1黄麻重组自交系群体炭疽病抗性病斑长度频率分布图。

图2黄麻炭疽病抗性基因区段的SNP分子标记局部连锁图。

图3黄麻炭疽病抗性QTLqAR.A10检测。左边纵轴为LOD值，右边纵轴为解释的表型变异，横轴为标记名称。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步的说明，其目的仅在于更好理解本发明的内容而非限制本发明的保护范围。

实施例1：开发了26个与炭疽病抗性基因连锁的SNP分子标记，如图2所示。

实施例2：利用上述开发的SNP分子标记用于黄麻抗性种质筛选。供试材料为144份黄麻品系。筛选出编号为98、45、76、122、124、20、101、27等18份抗病株系，占总数的12.5%。说明不同的黄麻株系间对炭疽病的抗性有明显差异。为了进一步确认大田接种的准确性，选取不同抗性的7个株系，在温室内进行接种鉴定。调查其发病情况，发现与大田接种差异不大。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCELISTING

<110>福建农林大学

<120>一种黄麻炭疽病抗性基因区段的SNP分子标记

<130>26

<160>26

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>91

<212>DNA

<213>Marker10514

<400>1

ggtcatataaacggtcaatctctatgaaattctcgcgttgcataatcgatttgggtcaat60

tcagtccaaaatagttttggattatttacat91

<210>2

<211>91

<212>DNA

<213>Marker15132

<400>2

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tcacataaatgttgtaataaattctatcccc91

<210>3

<211>91

<212>DNA

<213>Marker15713

<400>3

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tattctgattgtaatgagatttcacacagaa91

<210>4

<211>91

<212>DNA

<213>Marker23360

<400>4

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tgagctgaatttgagtttcattatactcaac91

<210>5

<211>90

<212>DNA

<213>Marker19857

<400>5

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<210>6

<211>90

<212>DNA

<213>Marker13539

<400>6

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<210>7

<211>91

<212>DNA

<213>Marker19482

<400>7

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<210>8

<211>91

<212>DNA

<213>Marker16051

<400>8

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acttttttttcacttgtatttctcttgtatt91

<210>9

<211>91

<212>DNA

<213>Marker27006

<400>9

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<210>10

<211>91

<212>DNA

<213>Marker17579

<400>10

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<210>11

<211>91

<212>DNA

<213>Marker35896

<400>11

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<210>12

<211>91

<212>DNA

<213>Marker19650

<400>12

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<210>13

<211>90

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<213>Marker35678

<400>13

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<210>14

<211>91

<212>DNA

<213>Marker27385

<400>14

gaaaattttgaaatgaattgtcaatttcatttggttcccatatatcacgtttcttgatct60

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<210>15

<211>93

<212>DNA

<213>Marker28811

<400>15

tttgttttcattgagaaaataggtatcgagaaagtttctcaattggactaactagaaatt60

ataataggttgaaaaaaatattcatcatttgcg93

<210>16

<211>91

<212>DNA

<213>Marker32863

<400>16

atagtttggtccagttattgccttgatcattatcattcatcaccctaaaaaacaccattt60

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<210>17

<211>91

<212>DNA

<213>Marker23852

<400>17

tttggtgtaattgggatctgttttgaacaagatttgaaagggagagaggtgtttgcaagt60

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<210>18

<211>91

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<400>18

aatttagcacagatggggcattgaattggaaagtaagggatgtctgtggcttgtcaaagg60

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<210>19

<211>91

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<213>Marker33314

<400>19

tttcacgtaaagtaatttatttcaacccccttcaaacttatatgtatgtgatttcatttt60

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<210>20

<211>91

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<213>Marker28047

<400>20

aaaaaaataacttcttcgttttgtagcaaacattatgaacatcacgaaggccaacaagcg60

gttgattcaagtggtttgacacttgttcccc91

<210>21

<211>91

<212>DNA

<213>Marker35589

<400>21

ttagactaggcaccaaaaatcaagcaaaacagagtcgaggccttcgggcttgtcacgctt60

ctaatattgtttatcctatttttgttcctaa91

<210>22

<211>92

<212>DNA

<213>Marker32497

<400>22

acggtagaattaggcagagcaagtagcattagacctggtttgggaaaagctaatttttag60

atgtttttgcgtttcaaaagtacttttggaca92

<210>23

<211>91

<212>DNA

<213>Marker27955

<400>23

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<210>24

<211>90

<212>DNA

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<400>24

tgatgggagaacaatcaagtggcctgtatggaattttttgcatcagtttttccattatag60

aacctagcatccactacatgggattcaacc90

<210>25

<211>91

<212>DNA

<213>Marker30248

<400>25

atcaatcatctttcctaccgataacaacttataaagctaatgcaatatggaggaaatgtc60

tgaaggttcgaatctacaaatgtaaattcaa91

<210>26

<211>91

<212>DNA

<213>Marker32758

<400>26

gcaggtctcagtttcgagaccctgcgtagccagctgcccctagttgcccatgacgtgtca60

tgactagtcatcccatgtagcaaaactccac91

Claims

1.一种黄麻炭疽病抗性基因区段的SNP分子标记，其特征在于：所述黄麻的SNP分子标记编号为Marker10514，Marker15132，Marker15713，Marker23360，Marker19857，Marker13539，Marker19482，Marker16051，Marker27006，Marker17579，Marker35896，Marker19650，Marker35678，Marker27385，Marker28811，Marker32863，Marker23852，Marker25102，Marker33314，Marker28047，Marker35589，Marker32497，Marker27955，Marker26827，Marker30248，Marker32758，各编号所对应的黄麻微卫星DNA分子标记序列为SEQIDNO.1-26所示。

2.权利要求1所述的黄麻炭疽病抗性基因区段的SNP分子标记在黄麻不同材料的炭疽病抗性鉴定中的应用。