CN105061611B - 一种分子量11400d和19490d高纯度漆籽多糖的制备方法 - Google Patents
一种分子量11400d和19490d高纯度漆籽多糖的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种分子量11400D和19490D高纯度漆籽多糖的制备方法。以漆树籽粕为原料、经过脱脂、水提醇沉、脱蛋白、DEAE‑52离子交换层析和凝胶柱层析，不浓度的盐进行梯度洗脱，经过透析脱盐，冷冻干燥得到纯度为95%以上的分子量为11400D和19490D的漆树籽粕多糖。其中分子量11400D多糖组分中鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖的摩尔比为41.93:21.8:1.01:9.24，分子量19490D多糖组分中鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖的摩尔比为38.31:16.44:1.1。该方法提供的漆籽多糖纯度高、制备方法简单，原料天然，适合工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种分子量11400D和19490D高纯度漆籽多糖的制备方法，属于天然药物、食品领域。
背景技术
漆树（Rhus verniciflua stokes），为漆树科（Anacardiaceae）漆树属（(Toxicodendron）的一种落叶乔木。 漆树是我国重要的特用经济林，生漆是天然树脂涂料，素有“涂料之王”的美誉。主要分布在北纬25～42°，东经95～125°之间的山区，其中秦巴山地和云贵高原为漆树分布集中地区。生漆是漆树分泌物，为天然树脂涂料，素有“涂料之王”的美誉。
漆籽为漆树的果实，其中果皮为蜡质层，可以提取漆蜡，内核为种子，可榨取漆油，在我国现有的漆树资源中，每年的漆籽产量约为200多万吨。目前对漆籽的研究主要集中在漆脂的提取及精制加工等方面，董艳鹤等[2-3]研究了热回流提取漆蜡的单因素和正交试验，优化漆蜡提取的最佳工艺，并采用GC-MS色谱分析了陕西野漆树和江西引种日本野漆树中漆蜡脂肪酸的化学成分，两个产地的漆蜡主要脂肪酸组成为棕桐酸、油酸和硬脂酸等。并进一步研究了漆蜡的脱色精制工艺，采用该方法制得的漆蜡的白度达85.2。漆树籽粕是漆籽压榨完后主要的剩余物，目前对它的开发利用尚属空白。为了扩大漆树产业的规模化，延伸漆树资源的产业链，因此开展漆树籽粕中多糖的提取和分离研究，对于漆树资源的开发利用具有指导意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种分子量11400D和19490D高纯度漆籽多糖的制备方法，通过对漆树籽粕多糖的分离纯化，得到纯度为95%以上的漆树籽粕多糖成分。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一个目的在于提供一种分子量11400D和19490D高纯度漆籽多糖的制备方法，所述的分子量11400D和19490D多糖含量为95%，所述的分子量11400D多糖由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖和半乳糖组成，所述的分子量19490D多糖由鼠李糖、阿拉伯糖和半乳糖组成。
所述的一种分子量11400D和19490D高纯度漆籽多糖的制备方法，其特征在于由以下步骤组成：
第一步
将漆树籽粕干燥、粉碎，按质量比1:5~1:30(g:mL)，加入石油醚或正己烷，常温或加热回流提取2~3次，每次2h~10h，过滤，滤液合并，于40~60℃下减压蒸发回收溶剂，滤渣经过减压干燥，得到脱脂籽粕；
第二步
将脱脂籽粕，按质量比1:5~1:30(g:mL)，加入蒸馏水，加热回流提取2~3次，温度60～90℃，提取时间1h~5h，过滤，滤液合并，于50～70℃下减压浓缩，浓缩液按体积比1～10:30（v/v）的比例加入无水乙醇，进行醇沉，离心得到沉淀，沉淀进行干燥，即为漆树籽粕粗多糖；
第三步
将漆树籽粕粗多糖，按质量比1:3~1:5(g:mL)，加入蒸馏水，配制成3mg/mL的漆树籽粕粗多糖水溶液，按体积比1:5~1:10(v/v)，加入Sevag试剂萃取3～5次，分离，取水层，合并，经真空干燥或冷冻干燥，得到漆树籽粕多糖提取物；
第四步
将上述得到的漆树籽粕多糖提取物，用蒸馏水配制成浓度为50mg/mL的多糖水溶液，采用DEAE-纤维素-52层析柱进行分离，依次采用2倍柱体积（BV）的蒸馏水、1BV的0.1mol/L NaCl、1BV的0.3mol/L NaCl、1BV的0.5mol/L NaCl和1BV的0.7mol/L NaCl溶液进行阶梯式洗脱，以10mL为一管进行分管收集；收集液进行多糖含量检测，绘制洗脱曲线，根据洗脱曲线收集各部位多糖洗脱液；将合并的各部位的洗脱液，采用分子量为3000道尔顿的透析袋进行透析除盐24h～48h，浓缩透析液，经真空干燥或冷冻干燥，得到漆树籽粕多糖组分JP2和JP3；
第五步
将上述得到的漆树籽粕多糖组分JP2和JP3，用蒸馏水分别配制成浓度为5～10mg/mL的多糖水溶液，再分别采用葡聚糖凝胶柱层析进行分离，采用2倍柱体积（BV）的蒸馏水进行洗脱，以10mL为一管进行分管收集；收集液进行多糖含量检测，绘制洗脱曲线，根据洗脱曲线收集各部位多糖洗脱液，经真空干燥或冷冻干燥，得到漆树籽粕多糖组分JP2-1和JP3-1；
第六步
将漆树籽粕多糖组分JP2-1和JP3-1进行HPLC分析，多糖组分JP2-1为分子量11400D的漆籽多糖，多糖组分JP3-1为分子量19490D的漆籽多糖。
3. 分子量11400D多糖组分中鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖的摩尔比为41.93:21.8:1.01:9.24，分子量19490D多糖组分中鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖的摩尔比为38.31:16.44:1.1。
4.第一步中的漆树籽粕是来源于野漆树、漆树和缅红漆品种的一种漆籽经过压榨后的籽粕。
5.第一步中的加热回流提取的温度为40～80℃。
6.第五步中的葡聚糖凝胶选自G50、G100、G150、G200和G250中的一种或几种。
7.第六步中HPLC分析，其色谱条件为：色谱柱为Ultrahydrogel Linear（7.8×300mm,10μm）,保护柱为Ultrahydrogel(6×40mm,6μm)，流动相为0.1mol/L的硝酸钠水溶液，示差检测器，流速为1mL/min，温度为50℃，进样量20μL。
本发明的有益效果：
本发明所提供一种分子量11400D和19490D高纯度漆籽多糖的制备方法，还具有以下特点：
（1）本发明操作工艺简单，通过脱脂、提取、醇沉、离子色谱和凝胶色谱分离，得到纯度为95%的分子量为11400D和19490D的高纯度漆籽多糖；
（2）本发明对分子量11400D和19490D的漆树籽粕多糖的单糖组成及比例进行了初步分析，为以后漆树籽粕多糖的分子结构的进一步深入研究提供理论基础。
附图说明
图1为漆树籽粕多糖提取物的DEAE-52洗脱曲线图；
图2为漆树籽粕多糖组份JP2-1的HPLC图；
图3为漆树籽粕多糖组份JP3-1的HPLC图。
具体实施方式
以下实施例为本发明的一些举例，不应被看做是对本发明的限定。
实施例1 苯酚硫酸法测定多糖含量
葡萄糖标准曲线制作：称取葡萄糖0.01g，用蒸馏水定溶于50 mL容量瓶中，取8个10 mL试管标号（空白，1，2，…7），吸取标准葡萄糖溶液0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.7，0.9 mL，分别置于1-7号试管，补加蒸馏水至终体积为1.0 mL，再加入5%（w/w）苯酚1.0 mL，震荡摇匀，缓慢加入浓硫酸3.5 mL,迅速震荡摇匀，室温下显色25分钟后吸取250 μL到96孔板，每样三个孔，490 nm处测定吸光度，取平均值，蒸馏水为空白对照。以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线；得到标准曲线的线性方程为y=0.0081x-0.0139（R2=0.9992），表明两变量线性相关性较好。
粗多糖含量测定：精确称取0.05 g粗多糖于50 mL容量瓶中，用蒸馏水定溶，分别吸取0.3，0.5，0.7，0.9 mL溶液与10mL试管中，补加蒸馏水至终体积为1.0mL，再加入5%（w/w）苯酚1.0 mL，震荡摇匀，缓慢加入浓硫酸3.5 mL,迅速震荡摇匀，室温下显色25分钟后吸取250 μL到96孔板，每样三个孔，490 nm处测定吸光度，取平均值。
实施例2
取500g的漆树籽粕，按照质量比1:5(g:mL)加入石油醚，常温提取3次，每次10h，过滤，滤液合并，于40℃下回收溶剂，滤渣经过减压干燥，得到脱脂籽粕；将脱脂籽粕，按质量比1:5(g:mL)，加入蒸馏水，于60℃下，加热回流提取5h，提取3次，过滤，滤液合并，于50℃下减压浓缩，浓缩液按体积比1:10加入无水乙醇，进行醇沉，离心得到沉淀，沉淀进行干燥，得到漆树籽粕粗多糖。将漆树籽粕粗多糖，按质量比1:3（g:mL），加入蒸馏水，配制成3mg/mL的漆树籽粕粗多糖水溶液，按体积比1:5(V/V)，加入Sevag试剂萃取5次，分离，取水层，合并，经真空干燥，得到漆树籽粕多糖提取物。
实施例3
取500g的野漆树籽粕，按照质量比1:10(g:mL)加入正己烷，常温提取2次，每次8h，过滤，滤液合并，于60℃下回收溶剂，滤渣经过减压干燥，得到脱脂籽粕；将脱脂籽粕，按质量比1:10(g:mL)，加入蒸馏水，于80℃下，加热回流提取2h，提取2次，过滤，滤液合并，于70℃下减压浓缩，浓缩液按体积比1:20加入无水乙醇，进行醇沉，离心得到沉淀，沉淀进行干燥，得到漆树籽粕粗多糖。将漆树籽粕粗多糖，按质量比1:5（g:mL），加入蒸馏水，配制成3mg/mL的漆树籽粕粗多糖水溶液，按体积比1:8(V/V)，加入Sevag试剂萃取4次，分离，取水层，合并，经冷冻干燥，得到漆树籽粕多糖提取物。
实施例4
取500g的缅红漆籽粕，按照质量比1:30(g:mL)加入正己烷，于40℃下加热回流提取2次，每次4h，过滤，滤液合并，于60℃下回收溶剂，滤渣经过减压干燥，得到脱脂籽粕；将脱脂籽粕，按质量比1:20(g:mL)，加入蒸馏水，于90℃下，加热回流提取2h，提取2次，过滤，滤液合并，于50℃下减压浓缩，浓缩液按体积比1:30加入无水乙醇，进行醇沉，离心得到沉淀，沉淀进行干燥，得到漆树籽粕粗多糖。将漆树籽粕粗多糖，按质量比1:5（g:mL），加入蒸馏水，配制成3mg/mL的漆树籽粕粗多糖水溶液，按体积比1:10(V/V)，加入Sevag试剂萃取5次，分离，取水层，合并，经真空干燥，得到漆树籽粕多糖提取物。
实施例5
取500g的漆树籽粕，按照质量比1:20(g:mL)加入石油醚，于80℃下加热回流提取2次，每次2h，过滤，滤液合并，于60℃下回收溶剂，滤渣经过减压干燥，得到脱脂籽粕；将脱脂籽粕，按质量比1:30(g:mL)，加入蒸馏水，于60℃下，加热回流提取4h，提取3次，过滤，滤液合并，于60℃下减压浓缩，浓缩液按体积比1:20加入无水乙醇，进行醇沉，离心得到沉淀，沉淀进行干燥，得到漆树籽粕粗多糖。将漆树籽粕粗多糖，按质量比1:4（g:mL），加入蒸馏水，配制成3mg/mL的漆树籽粕粗多糖水溶液，按体积比1:8(V/V)，加入Sevag试剂萃取3次，分离，取水层，合并，经冷冻干燥，得到漆树籽粕多糖提取物。
实施例6
将漆树籽粕多糖提取物，用蒸馏水配制成浓度为50mg/mL的多糖水溶液，采用DEAE-纤维素-52层析柱进行分离，依次采用2倍柱体积（BV）的蒸馏水、1BV的0.1mol/LNaCl、1BV的0.3mol/L NaCl、1BV的0.5mol/L NaCl和1BV的0.7mol/L NaCl溶液进行阶梯式洗脱，以10mL为一管进行分管收集；收集液进行多糖含量检测，绘制洗脱曲线，根据洗脱曲线收集各部位多糖洗脱液；将合并的各部位的洗脱液，采用分子量为3000道尔顿的透析袋进行透析除盐24h，浓缩透析液，经真空干燥，得到漆树籽粕多糖组分JP2和JP3。
实施例7
将漆树籽粕多糖提取物，用蒸馏水配制成浓度为50mg/mL的多糖水溶液，采用DEAE-纤维素-52层析柱进行分离，依次采用2倍柱体积（BV）的蒸馏水、1BV的0.1mol/LNaCl、1BV的0.3mol/L NaCl、1BV的0.5mol/L NaCl和1BV的0.7mol/L NaCl溶液进行阶梯式洗脱，以10mL为一管进行分管收集；收集液进行多糖含量检测，绘制洗脱曲线，根据洗脱曲线收集各部位多糖洗脱液；将合并的各部位的洗脱液，采用分子量为3000道尔顿的透析袋进行透析除盐36h，浓缩透析液，经冷冻干燥，得到漆树籽粕多糖组分JP2和JP3。
实施例8
将漆树籽粕多糖提取物，用蒸馏水配制成浓度为50mg/mL的多糖水溶液，采用DEAE-纤维素-52层析柱进行分离，依次采用2倍柱体积（BV）的蒸馏水、1BV的0.1mol/LNaCl、1BV的0.3mol/L NaCl、1BV的0.5mol/L NaCl和1BV的0.7mol/L NaCl溶液进行阶梯式洗脱，以10mL为一管进行分管收集；收集液进行多糖含量检测，绘制洗脱曲线，根据洗脱曲线收集各部位多糖洗脱液；将合并的各部位的洗脱液，采用分子量为3000道尔顿的透析袋进行透析除盐48h，浓缩透析液，经真空干燥，得到漆树籽粕多糖组分JP2和JP3。
实施例9
将漆树籽粕多糖组分JP2和JP3，用蒸馏水分别配制成浓度为5mg/mL的多糖水溶液，再分别采用葡聚糖凝胶G-50柱层析进行分离，采用2倍柱体积（BV）的蒸馏水进行洗脱，以10mL为一管进行分管收集；收集液进行多糖含量检测，绘制洗脱曲线，根据洗脱曲线收集各部位多糖洗脱液，经真空干燥，得到漆树籽粕多糖组分JP2-1和JP3-1。
实施例10
将漆树籽粕多糖组分JP2和JP3，用蒸馏水分别配制成浓度为5mg/mL的多糖水溶液，再分别采用葡聚糖凝胶G-100柱层析进行分离，采用2倍柱体积（BV）的蒸馏水进行洗脱，以10mL为一管进行分管收集；收集液进行多糖含量检测，绘制洗脱曲线，根据洗脱曲线收集各部位多糖洗脱液，经冷冻干燥，得到漆树籽粕多糖组分JP2-1和JP3-1。
实施例11
将漆树籽粕多糖组分JP2和JP3，用蒸馏水分别配制成浓度为5mg/mL的多糖水溶液，再分别采用葡聚糖凝胶G-150柱层析进行分离，采用2倍柱体积（BV）的蒸馏水进行洗脱，以10mL为一管进行分管收集；收集液进行多糖含量检测，绘制洗脱曲线，根据洗脱曲线收集各部位多糖洗脱液，经真空干燥，得到漆树籽粕多糖组分JP2-1和JP3-1。
实施例12
将漆树籽粕多糖组分JP2和JP3，用蒸馏水分别配制成浓度为10mg/mL的多糖水溶液，再分别采用葡聚糖凝胶G-200柱层析进行分离，采用2倍柱体积（BV）的蒸馏水进行洗脱，以10mL为一管进行分管收集；收集液进行多糖含量检测，绘制洗脱曲线，根据洗脱曲线收集各部位多糖洗脱液，经冷冻干燥，得到漆树籽粕多糖组分JP2-1和JP3-1。
实施例13
将漆树籽粕多糖组分JP2和JP3，用蒸馏水分别配制成浓度为10mg/mL的多糖水溶液，再分别采用葡聚糖凝胶G-250柱层析进行分离，采用2倍柱体积（BV）的蒸馏水进行洗脱，以10mL为一管进行分管收集；收集液进行多糖含量检测，绘制洗脱曲线，根据洗脱曲线收集各部位多糖洗脱液，经真空干燥，得到漆树籽粕多糖组分JP2-1和JP3-1。
实施例14 HPLC分析
色谱柱为Ultrahydrogel Linear（7.8×300mm,10μm），保护柱为Ultrahydrogel(6×40mm,6μm)，流动相为0.1mol/L的硝酸钠水溶液，示差检测器，流速为1mL/min，温度为50℃，进样量20μL。准确称取已知相对分子质量的标准葡聚糖，配成2 mg/mL溶液，按照上面的测试条件进行HPLC分析。以多糖标样的保留时间（TR）作为横坐标，多糖样品相对分子质量的对数为纵坐标，绘制标准曲线；得到标准曲线的线性方程为lgMw= 12.785-0.9225t（R=0.9979）。
经HPLC分析，JP2-1和JP3-1的纯度为95%和96%，JP2-1的分子量为11400D，JP3-1的分子量为19490D。
实施例15
对上述得到的多糖进行单糖组成分析：分别称取葡萄糖、鼠李糖、甘露糖、木糖、半乳糖和阿拉伯糖标准品3.0 mg于带塞试管中，依次加入羟基氯化胺10 mg、吡啶0.5 mL，将其摇匀后水浴30 min，冷却后再加入0.6 mL的C4H6O3于90 ℃下水浴酰化反应30 min，对所得酰基化单糖溶液GC分析。
称取多糖组份JP2-1和JP3-1各5 mg分别溶于20 mL质量分数为3%的硫酸溶液中水浴水解一定时间。冷却后用碳酸盐完全中和，抽滤离心后所得上清液即为水解液。将水解后单糖溶液于65 ℃下真空旋干，依次加入羟基氯化胺10 mg、吡啶0.5 mL，将其摇匀后水浴30min，冷却后再加入0.6 mL的C4H6O3于90 ℃下水浴酰化反应30 min，对所得酰基化单糖溶液GC分析。
GC分析条件：Agilent HP-5色谱柱(30 m×320 μm×0.25 μm)，气化室温度250℃，检测器温度280 ℃，升温步骤为180 ℃→1.5 ℃/min→220 ℃(1 min)→5℃/ min→250 ℃(3 min)，检测器：FID检测器，氮气流速为24 mL/min，氢气流速为60 mL/min，空气流速为350 mL/min，吹扫流量为3.0 mL/min，色谱柱流量1 mL/min。
分子量11400D多糖组分中鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖的摩尔比为41.93:21.8:1.01:9.24，分子量19490D多糖组分中鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖的摩尔比为38.31:16.44:1.1。
Claims (6)
1.一种分子量11400D和19490D高纯度漆籽多糖的制备方法, 其特征在于，所述的分子量11400D和19490D多糖含量均为95%，所述的分子量11400D多糖由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖和半乳糖组成，所述的分子量19490D多糖由鼠李糖、阿拉伯糖和半乳糖组成。
2.根据权利要求1所述的一种分子量11400D和19490D高纯度漆籽多糖的制备方法，其特征在于由以下步骤组成：
第一步
将漆树籽粕干燥、粉碎，按质量体积比1:5~1:30g/mL，加入石油醚或正己烷，常温或加热回流提取2~3次，每次2h~10h，过滤，滤液合并，于40~60℃下减压蒸发回收溶剂，滤渣经过减压干燥，得到脱脂籽粕；
第二步
将脱脂籽粕，按质量体积比1:5~1:30g/mL，加入蒸馏水，加热回流提取2~3次，温度60～90℃，提取时间1h~5h，过滤，滤液合并，于50～70℃下减压浓缩，浓缩液按体积比1～10:30v/v的比例加入无水乙醇，进行醇沉，离心得到沉淀，沉淀进行干燥，即为漆树籽粕粗多糖；
第三步
将漆树籽粕粗多糖，按质量体积比1:3~1:5 g/mL ，加入蒸馏水，制成漆树籽粕粗多糖水溶液，按体积比1:5~1:10 v/v ，加入Sevag试剂萃取3～5次，分离，取水层，合并，经真空干燥或冷冻干燥，得到漆树籽粕多糖提取物；
第四步
将上述得到的漆树籽粕多糖提取物，用蒸馏水配制成浓度为50mg/mL的多糖水溶液，采用DEAE-纤维素-52层析柱进行分离，依次采用2倍柱体积（BV）的蒸馏水、1BV的0.1mol/LNaCl、1BV的0.3mol/L NaCl、1BV的0.5mol/L NaCl和1BV的0.7mol/L NaCl溶液进行阶梯式洗脱，以10mL为一管进行分管收集；收集液进行多糖含量检测，绘制洗脱曲线，根据洗脱曲线收集各部位多糖洗脱液；将合并的各部位的洗脱液，分别采用分子量为3000道尔顿的透析袋进行透析除盐24h～48h，浓缩透析液，经真空干燥或冷冻干燥，得到漆树籽粕多糖组分JP2和JP3；
第五步
将上述得到的漆树籽粕多糖组分JP2和JP3，用蒸馏水分别配制成浓度为5～10mg/mL的多糖水溶液，再分别采用葡聚糖凝胶柱层析进行分离，采用2倍柱体积（BV）的蒸馏水进行洗脱，以10mL为一管进行分管收集；收集液进行多糖含量检测，绘制洗脱曲线，根据洗脱曲线收集各部位多糖洗脱液，经真空干燥或冷冻干燥，得到漆树籽粕多糖组分JP2-1和JP3-1；
第六步
将漆树籽粕多糖组分JP2-1和JP3-1进行HPLC分析，多糖组分JP2-1为分子量11400D的漆籽多糖，多糖组分JP3-1为分子量19490D的漆籽多糖。
3.根据权利要求1所述一种分子量11400D和19490D高纯度漆籽多糖的制备方法，其特征在于分子量11400D多糖组分中鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖的摩尔比为41.93:21.8:1.01:9.24，分子量19490D多糖组分中鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖的摩尔比为38.31:16.44:1.1。
4.根据权利要求2所述一种分子量11400D和19490D高纯度漆籽多糖的制备方法，其特征在于第一步中的加热回流提取的温度为40～80℃。
5.根据权利要求2所述一种分子量11400D和19490D高纯度漆籽多糖的制备方法，其特征在于第五步中的葡聚糖凝胶选自G50、G100、G150、G200和G250中的一种或几种。
6.根据权利要求2所述一种分子量11400D和19490D高纯度漆籽多糖的制备方法，其特征在于第六步中HPLC分析，其色谱条件为：7.8×300mm，10μm的Ultrahydrogel Linear色谱柱，6×40mm,6μm的Ultrahydrogel保护柱，流动相为0.1mol/L的硝酸钠水溶液，示差检测器，流速为1mL/min，温度为50℃，进样量20μL。
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