CN105061578A - 一种重组人自身抗原Scl-70 - Google Patents

一种重组人自身抗原Scl-70 Download PDF

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human autoantigen
autoantigen
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李海侠
李欣
陈泳钗
王小明
夏坤
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Southern Hospital Southern Medical University
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Southern Hospital Southern Medical University
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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Abstract

本发明公开了一种重组人自身抗原Scl-70，抗原核心氨基酸序列如SEQ？ID？NO：1所示，核心氨基酸序列的至少一端连接有保护肽。本发明的重组人自身抗原，肽链长度短，易于表达和纯化；能够一次性获得较大量且纯度较高的抗原，使用成本低，经济效益好。重组抗原反应活性很强，有助于ANA检测试剂的开发。

Description

一种重组人自身抗原Scl-70
技术领域
本发明涉及一种重组人自身抗原。
背景技术
自身免疫性疾病（AutoimmuneDiseases，AID）是泛指机体免疫效应细胞或免疫效应分子，针对自身组织或细胞出现异常免疫应答反应，导致组织损坏或功能障碍的疾病，是一类发病率高，可侵袭全身系统，严重危害人类健康的、致残率、致死率高的疾病。
在AID疾病的各种检测项目中，由于抗核抗体（ANA）与AID密切相关，是自身免疫反应的重要靶位，因此抗核抗体检测在AID疾病中一直处于重要位置，是临床上一项极其重要的筛选试验。随着人们认识的不断加深，抗核抗体（Antinuclearantibody，ANA）的定义已由原来传统的针对细胞核扩展到现在的整个细胞，指抗细胞内所有抗原成分的自身抗体的总称。目前已发现了具有不同临床意义的三十多种ANA，常见的如抗dsDNA抗体和抗Sm抗体是系统性红斑狼疮的标志性抗体，而抗SS-A（Ro）抗体和抗SS-B（La）抗体则多出现于干燥综合症患者等。
目前常用的检测方法主要有两种，间接免疫荧光法（IIF）和ELISA法。IIF法一直是临床常规的筛选试验，尽管该方法检测灵敏度高，但是需要手工操作和显微镜观察，影响因素较多，尤其是经验不丰富者容易判断错误，而且因为操作时间长，临床上常采用批量检测，因而也常出现一周或二周才出一次报告的情况，不利于疾病的早期诊断。EILSA法，因可进行半定量检测，临床经常根据其浓度的变化判定病人的好转与否，从而制定下一步的治疗方案，因此在临床也得到了广泛的使用。由于ELISA方法也是批量检测，因此也存在标本量少时不能极时出结果，开包装的试剂盒放置时间长易影响检测结果从而影响临床诊治的缺点。针对上述临床存在之问题，在当今检验医学发展提出的POCT（PointOfCareTesting），即即时检验新领域背景下，致力于开发一种新的检测试剂即荧光免疫层析快速检测试剂盒，使用小型荧光免疫分析仪进行检测，花费时间在15分钟左右，因此简单、便捷，标本即到即检，既能解决病人等待时间长之问题，又能解决临床医生执行自身免疫性疾病临床诊断的路径问题，可以在临床推广使用，以提高自身免疫疾病的诊治水平。
人自身抗原是制备ANA检测试剂的关键所在。天然人自身抗原提取纯化困难，难以获得高纯度的样品，导致其使用成本高，这些问题限制了ANA检测试剂的开发。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有良好抗原活性的重组人自身抗原。
本发明所采取的技术方案是：
一种重组人自身抗原，其核心氨基酸序列为：
kaqtearkqmskeeklkikeenekllkeygfcimdnhkerianfkieppglfrgrgnhpkmgmlkrrimpediiincskdakvpspppghkwkevrhdnkvtwlvswteniqgsikyimlnpssrikgekdwqkyetarrlkkcvdkirnqyredwkskemkvrqravalyfidklalragnekeegetadtvgccslrvehinlhpeldgqeyvvefdflgkdsiryynkvpvekrvfknfeksmmnlqtkidakkeqladarrdlksakadakvmkdaktkkvveskkkavqrleeqlmklevqatdreenkqialgtsklnyldpritvawckkwgvpiekiynktqrekfawaidmadedyef（SEQIDNO：1），核心氨基酸序列的至少一端连接有保护肽。
作为上述重组人自身抗原的进一步改进，保护肽的长度为4～20个氨基酸。
作为上述重组人自身抗原的进一步改进，特别的，N端保护肽的序列为：cdftqmsqyf（SEQIDNO：2）。
作为上述重组人自身抗原的进一步改进，特别的，抗原的序列为：
cdftqmsqyfkaqtearkqmskeeklkikeenekllkeygfcimdnhkerianfkieppglfrgrgnhpkmgmlkrrimpediiincskdakvpspppghkwkevrhdnkvtwlvswteniqgsikyimlnpssrikgekdwqkyetarrlkkcvdkirnqyredwkskemkvrqravalyfidklalragnekeegetadtvgccslrvehinlhpeldgqeyvvefdflgkdsiryynkvpvekrvfknfeksmmnlqtkidakkeqladarrdlksakadakvmkdaktkkvveskkkavqrleeqlmklevqatdreenkqialgtsklnyldpritvawckkwgvpiekiynktqrekfawaidmadedyef（SEQIDNO：3）。
一种核酸序列，该核酸序列编码上述的重组人自身抗原。
为提高表达效率，核酸序列为进行了偏嗜性改造的核酸序列，进行了偏嗜性改造的核酸序列为：ggatcctgtgactttacccaaatgtcgcaatacttcaaagcgcaaaccgaagcccgcaaacagatgagcaaagaagaaaaactgaaaatcaaagaagaaaacgaaaaactgctgaaagaatacggcttttgcatcatggataaccataaagaacgtatcgccaacttcaaaatcgaaccgccgggtctgttccgtggtcgtggtaatcacccgaaaatgggtatgctgaaacgtcgcattatgccggaagatatcatcatcaactgtagtaaagatgcaaaagtcccgagcccgccgccgggtcataaatggaaagaagtgcgtcacgataacaaagtgacctggctggtttcatggacggaaaatatccagggctcgatcaaatacattatgctgaacccgagctctcgcattaaaggtgaaaaagactggcagaaatatgaaaccgctcgtcgcctgaaaaaatgcgtggataaaatccgtaatcagtaccgcgaagactggaaaagcaaagaaatgaaagtccgtcaacgcgcggtggccctgtatttcattgataaactggctctgcgtgcgggcaatgaaaaagaagaaggtgaaaccgccgacacggttggctgctgttctctgcgcgtcgaacatatcaacctgcacccggaactggatggccaggaatacgtggttgaatttgatttcctgggtaaagacagtatccgttactacaacaaagttccggtcgaaaaacgcgtgttcaaaaacttcgaaaaatccatgatgaatctgcagaccaaaattgatgcgaaaaaagaacaactggcagatgctcgtcgcgacctgaaaagcgcgaaagccgatgcaaaagttatgaaagacgctaaaaccaaaaaagtcgtggaaagcaagaaaaaagccgttcagcgtctggaagaacaactgatgaaactggaagtccaggccacggatcgcgaagaaaataaacaaatcgcactgggcaccagcaaactgaactatctggacccgcgcattacggtggcgtggtgtaaaaaatggggtgttccgatcgaaaaaatttacaacaaaacgcagcgtgaaaaatttgcctgggctattgatatggcggatgaagattacgaattctaactcgag（SEQIDNO：4）（黑色加粗部分为引入的酶切位点）。
本发明的有益效果是：
本发明的重组人自身抗原，肽链长度短，易于表达和纯化。
本发明的重组人自身抗原，制备方法简单，能够一次性获得较大量且纯度较高的抗原，使用成本低，经济效益好。
本发明的重组人自身抗原，反应活性很强，有助于ANA检测试剂的开发。
附图说明
图1是重组人自身抗原不同IPTG浓度诱导表达结果；
图2是重组人自身抗原不同诱导时机表达结果；
图3是重组人自身抗原纯化产物电泳结果；
图4是重组人自身抗原荧光免疫检测结果。
具体实施方式
保护肽的作用在于保护所需要的抗原肽不被酶解，便于后续的分离纯化等操作，保护肽的长度一般为4～20个氨基酸，优选为4～15个氨基酸。
下面结合实验，进一步说明本发明的技术方案。
抗原表位的选择：
发明人根据现有公开的序列Scl-70（DNAtopoisomerase1[Homosapiens]NCBIReferenceSequence:NP_003277.1），通过自有方法筛选得到抗原表位，并将表位肽集中区域的氨基酸序列截取出来拼接在一起，得到的核心序列为：KAQTEARKQMSKEEKLKIKEENEKLLKEYGFCIMDNHKERIANFKIEPPGLFRGRGNHPKMGMLKRRIMPEDIIINCSKDAKVPSPPPGHKWKEVRHDNKVTWLVSWTENIQGSIKYIMLNPSSRIKGEKDWQKYETARRLKKCVDKIRNQYREDWKSKEMKVRQRAVALYFIDKLALRAGNEKEEGETADTVGCCSLRVEHINLHPELDGQEYVVEFDFLGKDSIRYYNKVPVEKRVFKNFEKSMMNLQTKIDAKKEQLADARRDLKSAKADAKVMKDAKTKKVVESKKKAVQRLEEQLMKLEVQATDREENKQIALGTSKLNYLDPRITVAWCKKWGVPIEKIYNKTQREKFAWAIDMADEDYEF（SEQIDNO：1），核心氨基酸序列的至少一端连接有保护肽。为了更好地表达核心氨基酸序列，在其两端连接辅助序列，最终用于表达的序列为：cdftqmsqyfkaqtearkqmskeeklkikeenekllkeygfcimdnhkerianfkieppglfrgrgnhpkmgmlkrrimpediiincskdakvpspppghkwkevrhdnkvtwlvswteniqgsikyimlnpssrikgekdwqkyetarrlkkcvdkirnqyredwkskemkvrqravalyfidklalragnekeegetadtvgccslrvehinlhpeldgqeyvvefdflgkdsiryynkvpvekrvfknfeksmmnlqtkidakkeqladarrdlksakadakvmkdaktkkvveskkkavqrleeqlmklevqatdreenkqialgtsklnyldpritvawckkwgvpiekiynktqrekfawaidmadedyef（SEQIDNO：3）。
重组表达质粒的构建：
从人自身抗原的碱基序列中找出上述多肽链对应的编码序列，对密码子进行偏嗜性改造（SEQIDNO：4），用人工合成方法合成基因片段，之后连入pET30a载体，构建重组表达质粒：pET30a-Scl-70。
重组人自身抗原的诱导表达：
1）不同IPTG浓度的诱导表达
实施例1：IPTG浓度为0.2mM
将重组表达质粒导入大肠杆菌BL21感受态细胞，挑选阳性转化子接种于含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃摇床培养过夜。次日按1:100接种于300ml新鲜的同种培养基中，37℃摇床培养至A600为0.4-0.6时，将菌液冰浴30min，然后加入IPTG至终浓度为0.2mM，20℃过夜诱导表达。
实施例2：IPTG浓度为0.6mM
将重组表达质粒导入大肠杆菌BL21感受态细胞，挑选阳性转化子接种于含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃摇床培养过夜。次日按1:100接种于300ml新鲜的同种培养基中，37℃摇床培养至A600为0.4-0.6时，将菌液冰浴30min，然后加入IPTG至终浓度为0.6mM，20℃过夜诱导表达。
实施例3：IPTG浓度为1.0mM
将重组表达质粒导入大肠杆菌BL21感受态细胞，挑选阳性转化子接种于含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃摇床培养过夜。次日按1:100接种于300ml新鲜的同种培养基中，37℃摇床培养至A600为0.4-0.6时，将菌液冰浴30min，然后加入IPTG至终浓度为1.0mM，20℃过夜诱导表达。
不同IPTG浓度诱导表达结果如图1所示。图1中，M：蛋白Marker，从上到下大小依次为130KD，95KD，72KD，55KD，43KD，34KD，26KD，17KD，10KD，1：空白对照即不加IPTG，2：加0.2mMIPTG，3：加0.6mMIPTG，4：加1.0mMIPTG
从图1可以看出，加入IPTG后，表达出来了重组人自身抗原Scl-70，且当IPTG浓度为1.0mM时，目的蛋白条带最大，确定最佳的IPTG诱导浓度为1.0mM。
2）不同诱导时机的表达
实施例4：诱导时机为菌液A600约为0.4
将重组表达质粒导入大肠杆菌BL21感受态细胞，挑选阳性转化子接种于含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃摇床培养过夜。次日按1:100接种于300ml新鲜的同种培养基中，37℃摇床培养至菌液A600约为0.4时，将菌液冰浴30min，然后加入IPTG至终浓度为1.0mM，20℃过夜诱导表达。
实施例5：诱导时机为菌液A600约为0.6
将重组表达质粒导入大肠杆菌BL21感受态细胞，挑选阳性转化子接种于含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃摇床培养过夜。次日按1:100接种于300ml新鲜的同种培养基中，37℃摇床培养至菌液A600约为0.6时，将菌液冰浴30min，然后加入IPTG至终浓度为1.0mM，20℃过夜诱导表达。
实施例6：诱导时机为菌液A600约为0.8
将重组表达质粒导入大肠杆菌BL21感受态细胞，挑选阳性转化子接种于含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃摇床培养过夜。次日按1:100接种于300ml新鲜的同种培养基中，37℃摇床培养至菌液A600约为0.8时，将菌液冰浴30min，然后加入IPTG至终浓度为1.0mM，20℃过夜诱导表达。
不同诱导时机表达结果如图2所示。图2中，M：蛋白Marker，从上到下大小依次为130KD，95KD，72KD，55KD，43KD，34KD，26KD，17KD，10KD，1：空白对照即不加IPTG，2：菌液A600约为0.4，3：菌液A600约为0.6，4：菌液A600约为0.8。
从图2可以看出，随着菌液浓度的增加，表达出来的目的蛋白条带大小逐渐减小，表明菌液A600约为0.4时，蛋白表达效果最佳。
结合图1和图2的鉴定结果，我们可以得知，当IPTG浓度为1.0mM，且诱导时的菌液A600约为0.4时，蛋白表达效果最佳，所以统一采用此条件来表达重组人自身抗原Scl-70。
重组人自身抗原的纯化：
将诱导表达后的菌体细胞用适量缓冲液重悬，细胞置于冰浴中超声破碎，破碎完全后，4℃，12000g离心收集上清，将上清通过镍离子亲和层析柱提纯，步骤具体如下：
1)向层析柱中加入3倍柱体积的0.1mol/LNiCl2溶液，滴净后加入5倍柱体积双蒸水冲洗，再加入5倍柱体积缓冲液平衡镍离子亲和层析柱的；
2)将收集的上清加入到亲和层析柱中，待上清滴净后再加入5倍柱体积的缓冲液，然后加入含50mM咪唑的缓冲液洗脱未结合的杂蛋白至洗脱干净，再用含500mM咪唑的缓冲液洗脱收集得到纯化后的目的蛋白；
3)将纯化得到的目的蛋白溶液装入透析袋中，用夹子夹紧透析袋两端后放入透析液中，4℃透析8-10h，中间更换新鲜透析液3-4次。透析完毕后，4℃，12000g离心30min，获得透析后的蛋白溶液，备用。
重组人自身抗原纯化产物电泳结果如图3所示。图3中，1：上清液，2：用缓冲液洗脱一倍柱体积后的收集液，3：用50mM咪唑洗脱一倍柱体积后的收集液，4：用500mM咪唑洗脱，收集的第2mL洗脱液，5：用500mM咪唑洗脱，收集的纯化样品（第3-第7ml洗脱液），6：用500mM咪唑洗脱，收集的第8ml洗脱液，M：蛋白Marker，从上到下大小依次为130KD，95KD，72KD，55KD，43KD，34KD，26KD，17KD，10KD。
从图3可知，采用镍离子亲和层析方法提纯到了重组人自身抗原Scl-70，且抗原纯度较高。
重组人自身抗原的活性检测：
获得提纯后的重组人自身抗原后，用荧光免疫技术检测抗原活性，步骤具体如下：
1)用荧光微孔板包被抗原：每孔加入100μL抗原溶液，并设置空白对照（包被PBS缓冲液）和阳性对照（包被质控抗体），在4℃条件下过夜吸附；吸附结束后倒去孔内液体并甩干，然后用PBST缓冲液清洗4次；
2)封闭：每孔加入200ul封闭液，在37℃条件下孵育2h，倒去孔内液体并甩干，然后用PBST缓冲液清洗4次；
3)孵一抗：每孔加入100μL质控抗体，在37℃条件下孵育1.5h，倒去孔内液体并甩干，用PBST缓冲液清洗4次；
4)加二抗：每孔加入100μL生物素标记的鼠抗人IgG，在37℃条件下孵育1.5h，倒去孔内液体并甩干，用PBST缓冲液清洗4次；
5)加荧光蛋白：每孔加入100μLCSAPEB（一种用链霉亲和素标记的荧光蛋白）溶液，在37℃条件下孵育1.5h，倒去孔内液体并甩干，用PBST缓冲液清洗4次；
6)测定结果：每孔加入100μLPBS缓冲液，将荧光微孔板置于多功能微孔板荧光检测仪内，以540nm波长光源激发，在590nm滤镜下检测荧光，同时测量荧光微孔板的背景值。
重组人自身抗原荧光免疫检测结果如图4所示。从图4可以看出，能够从重组人自身抗原Scl-70中检测到Scl-70的活性，且抗原活性很强，表明重组人自身抗原Scl-70制备成功，具备用于ANA检测的潜力。
<110>广州天宝颂原生物科技开发有限公司
南方医科大学南方医院
<120>一种重组人自身抗原Scl-70
<130>
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ctgcagaccaaaattgatgcgaaaaaagaacaactggcagatgctcgtcgcgacctgaaa840
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Claims (8)

1.一种重组人自身抗原，其核心氨基酸序列为SEQIDNO：1所示的肽，核心氨基酸序列的至少一端连接有保护肽。
2.根据权利要求1所述的重组人自身抗原，其特征在于：保护肽的长度为4～20个氨基酸。
3.根据权利要求1所述的重组人自身抗原，其特征在于：保护肽的长度为4～15个氨基酸。
4.根据权利要求1所述的重组人自身抗原，其特征在于：N端保护肽的序列为：CDFTQMSQYF（SEQIDNO：2）。
5.一种核酸序列，其特征在于：所述核酸序列编码权利要求1～4任意一项所述的重组人自身抗原。
6.根据权利要求5所述的核酸序列，其特征在于：核酸序列为进行了偏嗜性改造的核酸序列。
7.根据权利要求6所述的核酸序列，其特征在于：核酸序列如SEQIDNO：4所示。
8.一种重组人自身抗原的制备方法，包括将其编码序列导入微生物进行表达，之后纯化得到。
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Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
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