CN105055458B

CN105055458B - 防治骨质疏松的益生菌制剂及其制备方法

Info

Publication number: CN105055458B
Application number: CN201510330452.0A
Authority: CN
Inventors: 单宝龙; 约克·杰克毕; 王静; 任宝涛; 张颜廷; 刘虹; 张化朋; 王丽春; 张云静
Original assignee: Shandong Phoenix Bio Tech Co ltd
Current assignee: Shandong Fenghuang Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2015-06-15
Filing date: 2015-06-15
Publication date: 2018-10-23
Anticipated expiration: 2035-06-15
Also published as: CN105055458A

Abstract

本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及防治骨质疏松的益生菌制剂由纳豆芽孢杆菌发酵培养后得到纳豆芽孢杆菌菌粉，酿酒酵母养基、紫外照射得到酿酒酵母菌菌粉；纳豆芽孢杆菌菌粉、酿酒酵母菌菌粉以及碳酸钙配成。本发明提供的防治骨质疏松的益生菌制剂，以含天然维生素K2(MK‑7)的有益菌为原料、同时含有维生素D和钙的安全绿色的防治骨质疏松的产品，能有效提高钙质的吸收，可以防治骨质疏松。

Description

防治骨质疏松的益生菌制剂及其制备方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及防治骨质疏松的益生菌制剂及其制备方法。

背景技术

骨质疏松(osteoporosis，OP)是以骨量减少和骨组织微结构退化(松质骨骨小梁变细、断裂数量减少，皮质骨多孔、变薄)为特征的，以致骨的脆性增高以及骨折危险增加的一种全身骨骼疾病。发病原因一般认为与钙及维生素缺乏、内分泌失调、营养失调以及运动和光照不足有关。该病女性多于男性，常见于绝经后妇女和老年人。随着我国老年人口的增加，骨质疏松症发病率处于上升趋势，在我国乃至全球都是一个值得关注的健康问题。

维生素D是激素前体，对维持血液中的正常的钙离子浓度和磷酸化水平至关重要。当人类的皮肤被阳光中的紫外线照射后，会产生足够多的维生素D。由于人生活方式的改变，很多成年人因为不能照射到足够的阳光，而无法产生出足够的VD。因此通过日常饮食来补充维生素D变得越来越重要了。

近年研究发现，防治骨质疏松不仅需要钙、维生素D，而且还需要维生素K，尤其是VK2。研究确认，维生素K2可作用于成骨细胞，促进骨，组织钙化，同时还能抑制破骨细胞，引起骨吸收，从而增加骨密度，不仅可防还可治骨质疏松。骨钙素是由成骨细胞、成牙本质细胞和肥大的软骨细胞合成并分泌的蛋白质，它主要存在于这三种细胞外的骨基质中，小部分被释放进入血液循环，所以血清骨钙素为骨形成的重要指标。依赖于维生素K的骨组织羧化系统使骨钙素羧化变成具有生物学活性的羧化骨钙素，与钙结合，由无规则线团变成螺旋结构，羟基磷灰石结合，从而促进骨形成。研究表明，维生素K1、K2、K3中，K1有促进钙化作用，K2作用更强，而K3则没有这一作用。

目前市场上预防骨质疏松应用较为广泛的保健品是以碳酸钙为主的超微化处理的含有钙和维生素D的第3代复合制剂，如液体钙+D3软胶囊(液体钙+维生素D)；另外还有一些钙与中药复配的保健品如苗岭牌骨立胶囊、灵芝乳酸钙片等。这些产品都以钙为主要成分，希望通过补钙达到防治骨质疏松的结果。但是，摄入的钙并不能保证被有效的吸收，即便有的产品加入维生素D，在机体缺少维生素K2的情况下，也不能保证吸收的钙能被有效的利用。

发明内容

本发明的目的是开发一款以含天然维生素K2(MK-7)的有益菌为原料、同时含有维生素D和钙的安全绿色的防治骨质疏松的产品。

具体技术方案为：

防治骨质疏松的益生菌制剂，由以下方法制备所得：

(1)纳豆芽孢杆菌(Bacillusnatto)BLCC1-0053菌粉的制备：冻存的纳豆芽孢杆菌BLCC1-0053种经活化后转接到种子液体培养基中，在35～45℃条件下，静置培养12～24h，制得种子液；以1～5％的接种量，将种子液接于液体发酵培养基中，35～45℃，100～180rpm培养12～24h，然后转至40～50℃条件下，静置培养5～7d；发酵结束后，立即将发酵液离心并用清水清洗，离心条件为5000～10000rpm，5～15min，清洗2～3遍后冷冻干燥，粉碎，即为纳豆芽孢杆菌菌粉。

纳豆芽孢杆菌(Bacillusnatto)BLCC1-0053，已于2014年1月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCCM2014028；保藏地址为中国武汉的武汉大学，邮编为430072；所述的纳豆芽孢杆菌BLCC1-0053产维生素K2，经高效液相色谱(HPLC)检测，MK-7的含量不低于3.68733mg/g。

其中，种子液体培养基各成分质量含量为：葡萄糖0.2％，蛋白胨1.0％，氯化钠0.5％，酵母膏0.5％，其余为蒸馏水，pH值7.0。

液体发酵培养基各成分质量含量为：蛋白胨10％，丙三醇3％、NaCl0.5％，K₂HPO₄0.02％，其余为蒸馏水，pH7.0-7.2。

(2)酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)BLCC4-0032已于2015年3月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M2015123，保藏地址为中国武汉的武汉大学，邮编为430072；酿酒酵母的发酵生产：酿酒酵母在斜面培养基中经斜面活化后转接到种子液体培养基中，25～35℃条件下，120～200rpm振荡培养18～30h，制得种子液；以1～5％的接种量，将种子液接于液体发酵培养基中，25～35℃，120～200rpm振荡培养18～30h。

其中，斜面培养基配各成分质量含量为：葡萄糖2％，酵母膏0.5％，蛋白胨1％，磷酸二氢钾0.2％，琼脂粉1.5～2.0％，其余为蒸馏水。

种子液体培养基及液体发酵培养基为不含琼脂的固体培养基，即葡萄糖2％，酵母膏0.5％，蛋白胨1％，磷酸二氢钾0.2％，其余为蒸馏水。

(3)酿酒酵母紫外照射：离心收集菌体，用发酵液体积30％去离子水重悬菌体，紫外照射2～4h；

紫外照射的波长为254～365nm。紫外照射后的酵母菌粉中维生素D(VD)的含量不低于732.97ug/g，即2931880IU/100g。

(4)离心收集菌体，离心条件为5000～10000rpm，5～15min，冷冻干燥后粉碎，即为酿酒酵母菌菌粉；酿酒酵母菌菌粉中维生素D的含量不低于732.97ug/g；

(5)产品复配：将纳豆芽孢杆菌菌粉、酿酒酵母菌菌粉以及碳酸钙配成益生菌制剂产品，纳豆芽孢杆菌菌粉、酿酒酵母菌菌粉以及碳酸钙混合的比例按照有效成分质量比例配制，MK-7∶VD∶Ca²⁺＝30～300∶1～10∶160。

本发明提供的防治骨质疏松的益生菌制剂，以含天然维生素K2(MK-7)的有益菌为原料、同时含有维生素D和钙的安全绿色的防治骨质疏松的产品，能有效提高钙质的吸收，可以防治骨质疏松。

附图说明

图1是本发明实施例试验过程中大鼠体重变化；

图2是本发明实施例饲喂产品后各组大鼠骨矿含量；

图3是本发明实施例饲喂产品前后骨矿含量增长情况；

图4是本发明实施例饲喂产品后各组大鼠骨密度；

图5是本发明实施例饲喂产品后各组大鼠骨密度增长情况；

图6是本发明实施例中各组大鼠血清中P的含量；

图7是本发明实施例中各组大鼠血清中Ca的含量。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

(1)纳豆芽孢杆菌BLCC1-0053菌粉的制备

培养基配方：

种子液体培养基各成分质量含量为：葡萄糖0.2％，蛋白胨1.0％，氯化钠0.5％，酵母膏0.5％，其余为蒸馏水，pH值7.0。

冻存的纳豆芽孢杆菌BLCC1-0053种经活化后转接到种子液体培养基中，在37℃条件下，静置培养16h，制得种子液；以5％的接种量，将种子液接于液体发酵培养基中，37℃，120rpm培养24h，然后转至42℃条件下，静置培养5～7d；发酵结束后，立即将发酵液离心并用清水清洗，离心条件为5000～10000rpm，5～15min，清洗2～3遍后冷冻干燥，粉碎，即为纳豆芽孢杆菌菌粉。

菌粉样品经过处理后，高效液相色谱(HPLC)结果显示MK-7产量高达3.68733mg/g。

(2)酿酒酵母BLCC4-0032菌粉的制备

斜面培养基配各成分质量含量为：葡萄糖2％，酵母膏0.5％，蛋白胨1％，磷酸二氢钾0.2％，琼脂粉2.0％，其余为蒸馏水。

种子液体培养基及液体发酵培养基为不含琼脂的固体培养基，葡萄糖2％，酵母膏0.5％，蛋白胨1％，磷酸二氢钾0.2％，其余为蒸馏水。

酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)BLCC4-0032在斜面培养基中经斜面活化后转接到种子液体培养基中，30℃条件下，180rpm振荡培养24h，制得种子液；以3％的接种量，将种子液接于液体发酵培养基中，30℃，180rpm振荡培养24h，离心收集菌体；

用发酵液体积30％去离子水重悬菌体，312nm紫外照射4h；

离心收集菌体，冷冻干燥后粉碎，即为菌粉成品。

样品处理后，经HPLC检测，样品中VD含量高达732.97ug/g，即2931880IU/100g。

(3)产品复配：将纳豆芽孢杆菌菌粉、酿酒酵母菌菌粉以及碳酸钙配成益生菌制剂产品，纳豆芽孢杆菌菌粉、酿酒酵母菌菌粉以及碳酸钙混合的比例按照有效成分质量比例配制，MK-7∶VD∶Ca²⁺＝100∶5∶160。

实施例2

产品复配步骤中，纳豆芽孢杆菌菌粉、酿酒酵母菌菌粉以及碳酸钙混合的比例按照有效成分质量比例配制，MK-7∶VD∶Ca²⁺＝30∶1∶160。

其他步骤与实施例1相同。

实施例3

产品复配步骤中，纳豆芽孢杆菌菌粉、酿酒酵母菌菌粉以及碳酸钙混合的比例按照有效成分质量比例配制，MK-7∶VD∶Ca²⁺＝300∶10∶160。

其他步骤与实施例1相同。

产品功效验证

试验动物：Wistar大鼠，鼠龄6-8周，雌鼠

试验分组：将购买的大鼠分为7组，第1组，饲喂正常饲料，不做任何处理；第2组，维甲酸70mg/kg+生理盐水，灌胃；第3组，维甲酸+低剂量产品，灌胃；第4组，维甲酸+高剂量产品，灌胃；第5组，生理盐水，灌胃；第6组，生理盐水+低剂量产品，灌胃；第7组，生理盐水+高剂量产品，灌胃。

试验设计：根据VK2的人体每日摄入推荐量(RDA)，选择实施例1的产品，50ug/kg/d、500ug/kg/d两个用药剂量，分别为低低剂量、高剂量。大鼠购买进实验室首先适应饲喂1周，之后饲喂低钙饲料3周后，DEXA(双能X-线吸收仪)测量骨密度及骨矿物质含量。注射激素造模，同时灌胃产品3周，DEXA测量骨密度及骨矿物质含量，麻醉(戊巴比妥钠)，开膛心脏取血或者腹主动脉取血进行相关血液指标测定。

实验结果

(1)大鼠体重变化

因维甲酸副作用导致大鼠死亡，因此2、3、4组灌胃维甲酸一周后停止维甲酸造模，只进行低钙饲喂造模。每天灌胃前称量大鼠体重，一周为一个单位，计算大鼠平均体重，研究6周内大鼠体重变化，结果如图1所示。

由图可以看出，前3周各组的大鼠体重保持增长，第4周开始，维甲酸造模组体重下降，在停止使用维甲酸后饲喂产品组体重开始增加，而且增长速度要比未饲喂产品组快。而其他低钙饲喂组大鼠的体重与空白对照组一样保持持续增长，说明灌胃产品不会对大鼠的正常生长产生影响。

(2)骨矿含量(BMC)变化

饲喂产品前后分别使用DEXA(双能X-线吸收仪)测量各组大鼠骨矿物质含量。试验结束后各组大鼠骨矿含量如图2所示；饲喂产品前后大鼠骨矿含量增长情况如图3所示。

由图可以看出，低钙饲喂组的BMC显著低于空白对照组，说明低钙饲导致大鼠骨质疏松，而产品灌胃组第6组大鼠骨矿含量与空白组无差异，保持正常水平。在对6组、7组大鼠进行产品灌胃后，其BMC的增长量要显著高于未灌胃产品组即第5组，说明灌胃产品能显著增加大鼠的骨矿含量。

骨密度(BMD)变化

饲喂产品前后分别使用DEXA(双能X-线吸收仪)测量各组大鼠骨密度。试验结束后各组大鼠密度如图4所示；饲喂产品前后大鼠骨密度增长情况如图5所示。

由图可以看出，低钙饲喂导致大鼠的BMD显著降低，而在对6、7组大鼠进行K2产品灌胃后，相对于骨密度持续降低的第5组，6组、7组的骨密度显著增加。

(3)血清中磷(P)和钙(Ca)的含量

试验结束后，用戊巴比妥钠麻醉各组存活大鼠，开膛心脏取血或者腹主动脉取血进行相关血液指标测定。血清中P和Ca含量分别如图6、图7所示。

由图可以看出，各实验组大鼠血清P含量差异不显著，而钙的的水平有差异，第4组和7组的大鼠的血清钙水平与正常组无差异，而显著高于低钙饲喂且无灌胃产品的对照组，说明产品能够促进机体对钙的吸收，补充机体钙的缺乏症状。

实验结论

通过骨质疏松的关键指标：骨矿含量(BMC)、骨密度(BMD)可以看出通过向大鼠灌胃含VK2菌粉和VD等成分的复合产品，可以显著提高其骨矿含量(BMC)、骨密度(BMD)，改善大鼠的骨质疏松状况，对于促进钙吸收以及骨骼的正常代谢具有一定的作用。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.防治骨质疏松的益生菌制剂，其特征在于：由以下方法制备所得：

(1)纳豆芽孢杆菌菌粉的制备：冻存的纳豆芽孢杆菌种经活化后转接到种子液体培养基中，在35～45℃条件下，静置培养12～24h，制得种子液；以1～5％的接种量，将种子液接于液体发酵培养基中，35～45℃，100～180rpm培养12～24h，然后转至40～50℃条件下，静置培养5～7d；发酵结束后，立即将发酵液离心并用清水清洗，离心条件为5000～10000rpm，5～15min，清洗2～3遍后冷冻干燥，粉碎，即为纳豆芽孢杆菌菌粉；

(2)酿酒酵母的发酵生产：酿酒酵母在斜面培养基中经斜面活化后转接到种子液体培养基中，25～35℃条件下，120～200rpm振荡培养18～30h，制得种子液；以1～5％的接种量，将种子液接于液体发酵培养基中，25～35℃，120～200rpm振荡培养18～30h；

(3)酿酒酵母紫外照射：离心收集菌体，用发酵液体积30％去离子水重悬菌体，紫外照射2～4h；紫外照射的波长为254～365nm；

(5)产品复配：将纳豆芽孢杆菌菌粉、酿酒酵母菌菌粉以及碳酸钙配成益生菌制剂产品，纳豆芽孢杆菌菌粉、酿酒酵母菌菌粉以及碳酸钙混合的比例按照有效成分质量比例配制，MK-7：VD：Ca²⁺＝30～300：1～10：160。

2.根据权利要求1所述的防治骨质疏松的益生菌制剂，其特征在于：步骤(1)所述的种子液体培养基各成分质量含量为：葡萄糖0.2％，蛋白胨1.0％，氯化钠0.5％，酵母膏0.5％，其余为蒸馏水，pH值7.0；

步骤(1)所述的液体发酵培养基各成分质量含量为：蛋白胨10％，丙三醇3％、NaCl0.5％，K₂HPO₄0.02％，其余为蒸馏水，pH7.0-7.2。

3.根据权利要求1所述的防治骨质疏松的益生菌制剂，其特征在于：步骤(2)所述的斜面培养基配各成分质量含量为：葡萄糖2％，酵母膏0.5％，蛋白胨1％，磷酸二氢钾0.2％，琼脂粉1.5～2.0％，其余为蒸馏水；

步骤(2)所述的种子液体培养基及液体发酵培养基各成分质量含量为：葡萄糖2％，酵母膏0.5％，蛋白胨1％，磷酸二氢钾0.2％，其余为蒸馏水。