CN105039352B

CN105039352B - 棉花GbGUT1基因及其编码蛋白和应用

Info

Publication number: CN105039352B
Application number: CN201510426813.1A
Authority: CN
Inventors: 马峙英; 王省芬; 张艳; 卢川; 王敬敬
Original assignee: Heibei Agricultural University
Current assignee: Heibei Agricultural University
Priority date: 2015-07-20
Filing date: 2015-07-20
Publication date: 2018-08-14
Anticipated expiration: 2035-07-20
Also published as: CN105039352A

Abstract

本发明提供了一种棉花GbGUT1基因及其编码蛋白和应用，所述基因的开放阅读框序列为1239bp，如SEQ ID NO.1所示；棉花GbGUT1基因的表达载体含有上述基因；所述表达载体在作物品种改良中的应用以及在提高棉纤维品质中的应用。本发明提供的葡糖醛酸转移酶基因是果胶代谢途径中的重要酶，与棉纤维发育有重要关系，因此本发明为棉纤维品质改良基因工程提供了新的候选基因，为进一步转化棉花从而提高棉纤维品质奠定基础，具有较大的应用价值。

Description

棉花GbGUT1基因及其编码蛋白和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体的，涉及一种棉花GbGUT1基因及其编码蛋白和应用。

背景技术

棉纤维品质主要由棉纤维的发育情况所决定。棉纤维实质上是种皮毛，是由位于子房内的胚珠外被上的表皮细胞发育分化而成的一种单细胞结构。从形态上讲，棉纤维细胞的发育过程是细胞超常伸长和细胞壁超常加厚的过程。纤维发育过程主要经历纤维原始细胞分化突起、纤维细胞伸长(初生壁形成期)、次生壁合成和增厚以及脱水成熟4个阶段，是多种基因共同控制表达的复杂过程。伸长期和次生壁加厚期是棉纤维品质形成的关键时期。初生细胞壁的合成是细胞伸长期的重要活动之一，与纤维长度直接相关。伸长阶段还伴随着次生壁纤维素沉积的加速。在伸长期结束之前，纤维细胞开始次生细胞壁的合成，主要是纤维素的淀积，纤维细胞次生壁的加厚决定纤维强力。

棉纤维细胞壁主要包括纤维素和木葡聚糖、木聚糖、果胶多糖等非纤维素成分。在棉纤维的次生壁中，除了含有纤维素外，还含非纤维素、蛋白和芳香烃等物质，这就预示着非纤维素在次生壁形成中也具有重要作用。双子叶植物中的木聚糖主要为葡糖醛酸木聚糖。木聚糖与次生壁形成有密切关系，甚至木聚糖合成酶的活性变化可以作为次生壁形成的标志之一。有研究表明葡糖醛酸在棉纤维从初生壁到次生壁转换过程中，含量逐渐升高，在次生壁开始加厚时，含量最高，随后开始下降，这就表明葡糖醛酸转移酶在次生壁加厚期具有重要作用。因此需要对棉花葡糖醛酸转移酶进行深入的研究，寻找棉花葡糖醛酸转移酶基因，从而为促进棉纤维品质提供新的研究方向和途径。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种棉花葡糖醛酸转移酶基因及其编码蛋白和应用，为棉纤维品质改良基因工程提供新的候选基因和手段。

为实现上述目的，本发明提供了一种棉花GbGUT1基因，所述基因的开放阅读框(ORF)序列长度为1239bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明所提供的棉花GbGUT1基因在纤维强力不同的棉种中表达量不同，GbGUT1在棉纤维发育次生壁加厚期上调表达，在陆地棉中棉所8号中的表达高峰在开花后30天(30DPA,days post-anthesis)，在海岛棉Pima90-53中的表达高峰在25DPA，说明此基因与纤维强力有关，在非纤维素多糖合成中发挥重要作用。

本发明还提供了所述的棉花GbGUT1基因所编码的蛋白，所述基因的开放阅读框序列编码412个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了一种含有棉花GbGUT1基因的表达载体。

可选的，所述表达载体为反义表达载体。

可选的，所述表达载体为真核表达载体。

例如，所述原核表达载体可以为将GbGUT1基因的核苷酸序列克隆进pET-41a(+)载体获得的。

本发明还提供了含有所述表达载体的宿主。

可选的，所述宿主可以为大肠杆菌、模式生物(如拟南芥)、棉花等。

例如，所述棉花可以为海岛棉Pima90-53或中棉所8号。

本发明还提供了所述棉花GbGUT1基因或所述表达载体在提高棉纤维品质中的应用。

本发明还提供了用于扩增所述棉花GbGUT1基因的特异性引物对：

上游引物：5’-CCATCCTTCTTCCGAGTGCTTCAG-3’；

下游引物：5’-GGAGGCCTGGTGAGGCAGTGAAT-3’。

本发明所提供的棉花GbGUT1与棉纤维发育有重要关系，可以利用基因工程手段进一步转化棉花，从而提高棉纤维品质。转反义GbGUT1的拟南芥的果胶含量、醛酸糖含量和纤维素含量相比于野生型均显著升高，而UGD酶活下降。表型也发生一系列变化，茎长变短，茎粗变细，茎杆强度变弱。

附图说明

图1为本发明棉花GbGUT1的ORF RT-PCR扩增结果，其中，M为DL 2000Marker，H为空白对照，GUT为GbGUT1的ORF扩增产物；

图2为本发明棉花GbGUT1在陆地棉中棉所8号(CRI)和海岛棉Pima90-53中纤维发育不同时期的表达结果；

图3为转GbGUT1的E.coli BL21(DE3)诱导前和诱导后目的融合蛋白表达的SDS-PAGE检测结果，箭头所示为目的融合蛋白，其中，M：蛋白标准分子量，1：BL21(DE3)plys空菌株未经IPTG诱导的总蛋白，2：pET-41a(+)空载体未经IPTG诱导的总蛋白；3：GbGUT1-pET-41a(+)未经IPTG诱导的总蛋白；4：BL21(DE3)plys空菌株经IPTG诱导3h后的总蛋白；5：pET-41a(+)空载体经IPTG诱导3h后的总蛋白；6：GbGUT1-pET-41a(+)经IPTG诱导3h后的总蛋白；7：BL21(DE3)plys空菌株经IPTG诱导6h后的总蛋白；8：pET-41a(+)空载体经IPTG诱导6h后的总蛋白；9：GbGUT1-pET-41a(+)经IPTG诱导6h后的总蛋白；10：BL21(DE3)plys空菌株经IPTG诱导9h后的总蛋白；11：pET-41a(+)空载体经IPTG诱导9h后的总蛋白；12：GbGUT1-pET-41a(+)经IPTG诱导9h后的总蛋白；

图4为转A-GUT(反义GbGUT1)拟南芥的后代筛选；其中，左图为全局图，右图为局部放大图。

图5为转A-GUT(反义GbGUT1)拟南芥株系与野生型纤维素含量的比较图，其中，col：野生型拟南芥对照，A-2、A-5和A-9：转A-GUT拟南芥T3代不同株系；

图6为转A-GUT(反义GbGUT1)拟南芥株系与野生型醛酸糖含量的比较图，其中，col：野生型拟南芥对照，A-2、A-5和A-9：转A-GUT拟南芥T3代不同株系；

图7为转A-GUT(反义GbGUT1)拟南芥株系与野生型果胶含量的比较图，其中，col：野生型拟南芥对照，A-2、A-5和A-9：转A-GUT拟南芥T3代不同株系；

图8为转A-GUT(反义GbGUT1)拟南芥株系与野生型UGD酶活的比较图，其中，col：野生型拟南芥对照，A-2、A-5和A-9：转A-GUT拟南芥T3代不同株系。

具体实施方式

下面将通过具体实施方式对本发明进行详细说明。

实施例1棉花GbGUT1的克隆

(1)GbGUT1ORF的获得

以cDNA-AFLP获得的差异表达片段(TDF)为基础进行电子拼接，获得一个1535bp的cDNA序列，其中包括长度为1239bp的ORF。

(2)设计GbGUT1的引物

依据拼接序列设计特异性引物，GbGUT1的上、下游引物分别为：

上游引物：5’-CCATCCTTCTTCCGAGTGCTTCAG-3’；

下游引物：5’-GGAGGCCTGGTGAGGCAGTGAAT-3’。

(3)目的基因的扩增

利用设计的特异性引物以海岛棉Pima90-53开花后15天的棉纤维cDNA为模板进行PCR扩增，获得GbGUT1目的条带(图1)。

(4)阳性克隆的获得及基因序列分析

将回收得到的GbGUT1的PCR产物与pGM-T连接，采用天根生化科技(北京)有限公司的pGM-T克隆试剂盒克隆目的片段，连接产物采用热激转化法转入大肠杆菌TOP10感受态细胞(购自天根生化科技有限公司)，并筛选阳性克隆，经上海生工生物工程有限公司测序，所测序列与预期结果一致，对测序结果进行BlastX，结果显示GbGUT1含有GUT基因家族的extosin保守结构域GbGUT1ORF序列如SEQ ID NO.1所示，长1239bp，编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

实施例2棉花GbGUT1编码蛋白的相似性分析和保守结构域分析

经保守结构域分析，GbGUT1编码glucuronyltransferase，含有extosin保守结构域，属于GT family 47家族蛋白。通过多重序列序列比对和同源进化树分析表明，GbGUT1含有GT signature及保守氨基酸序列[FCLQPx(16)GCIPV]，和拟南芥At1g27440(AtGUT1)，NpGUT1同源性最高，和AtFra8(At2g28110)同源性较高。但是，和棉花上已经发表的相关基因GhGlcAT1及GhUGT1，GhUGT2同源性较低，聚类到不同的分支上，并且后三者不含有上述的motif。

实施例3棉花GbGUT1的时空表达模式分析

使用天根生化科技(北京)有限公司的RNAplant提取试剂盒提取陆地棉中棉所8号和海岛棉Pima90-53开花当天胚珠以及5、10、15、20、25、30、35、40DPA的纤维RNA。

采用大连宝生物公司的RT reagent Kit With gDNA Eraser(Perfect Real Time)试剂盒合成以上9个时期的单链cDNA，浓度用Beckman DU800分光光度计测定。对棉花GbGUT1在棉纤维发育不同时期的表达进行Real-time PCR分析。内参选用EF1α，其引物序列如下：

EF1αF：5′-GCTGAGATGAACAAGAGGTCATTC-3′；

EF1αR：5′-GGAATCAATAATCAAAACAGCACAG-3′。

参见图2，棉花GbGUT1在陆地棉中棉所8号和海岛棉Pima90-53中纤维发育不同时期的Real-time PCR结果显示，GbGUT1均在纤维发育的次生壁加厚期表达。在中棉所8号中GbGUT1的表达量高于Pima90-53。但是在Pima中GbGUT1在25DPA出现表达高峰，而在中棉所8号中，GbGUT1在30DPA出现表达高峰，稍晚于Pima90-53。该基因在不同棉花品种中呈现出不同的表达模式，说明此基因在两个棉花品种中的作用可能有差异。

实施例4GbGUT1原核表达载体的构建及诱导表达

(1)原核表达载体的构建和转化子的获得

利用EcoRI和HindⅢ分别对实施例1中克隆得到的GbGUT1的ORF和原核表达载体pET-41a(+)质粒(本实验室保存)进行双酶切并回收目的片段。

将表达载体与目的基因片段进行连接，转化大肠杆菌DH5α，经过PCR和酶切检测，筛选含重组质粒的阳性克隆，利用热激法将含有阳性克隆的质粒转入BL21(DE3)菌株(购自天根生化科技有限公司)中，并进一步挑取阳性克隆，经质粒提取、酶切检测获得含有重组质粒pET-41a(+)-GUT1的大肠杆菌工程菌株。

(2)重组蛋白的诱导表达与鉴定

将含有以上各类型的重组质粒和含有空质粒(对照)的BL21(DE3)菌株在28℃，IPTG终浓度为0.8mmol/L的条件下诱导9h后，进行SDS-PAGE垂直式凝胶电泳，其中分离胶为12％，浓缩胶为5％。

参见图3，经IPTG诱导的含有去掉跨膜区重组质粒pET-41a(+)-GUT的大肠杆菌BL21(DE3)与含空质粒对照相比，在71kDa出现一条表达量明显增强的差异带。生物信息学预测可表达的GbGUT1目的融合蛋白包括GUT1蛋白(约47kDa)和pET-41a标签蛋白(约24kDa)，分子量大约为71kDa。因此，该差异带是pET-41a(+)-GUT1基因在大肠杆菌BL21(DE3)中表达的目的融合蛋白。

实施例5棉花GbGUT1反义cDNA转化拟南芥

(1)反义表达载体的构建

设计用于构建植物表达载体的引物，在GbGUT1基因的ORF两端添加酶切位点SacⅠ和XbaⅠ(下划线部分)，序列如下：

A-GUT1F：5’-GCGAGCTCAGAATGAGGAAATG-3’；

A-GUT1R：5’-TGTCTAGAGCATCACCACGGTTT-3’。

以该引物进行PCR反应，回收目的片段，并与pGM-T载体连接，热击法转化大肠杆菌感受态细胞DH5α(天根生化科技有限公司产品)。挑取阳性克隆提取质粒，经酶切检测并测序，得到中间载体pGM-AGbGUT1。

将中间载体和真核表达载体pBI121(本实验室保存)分别用SacⅠ和XbaⅠ双酶切，电泳酶切产物，回收目的片段，然后进行连接。热击法转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，挑取阳性克隆，进行质粒提取，经酶切检测和测序，获得真核表达载体pBI121::AGbGUT1。

(2)拟南芥遗传转化及GbGUT1的功能分析

①拟南芥遗传转化：将质粒pBI121::AGUT1转化农杆菌菌株GV3101感受态细胞(本实验室制备保存)，采用农杆菌浸花法将A-GbGUT1载体转化Columbia型拟南芥。将转化拟南芥植株花序浸泡于含有目的基因的转化介质，几分钟后取出，保湿暗培养24h后浇足营养液，恢复正常光照培养。待拟南芥种子成熟，收取种子进行干燥并春化后，种植于MS筛选培养基上(卡那霉素浓度为100mg/L)，筛选得到转基因阳性苗(图4)，移栽于蛭石中培养，并进行PCR检测进一步确定转基因阳性植株。之后，再经2轮的种植、筛选直至获得T₃代阳性拟南芥转基因株系，进行表型和细胞壁成分分析。

②表型分析：转基因拟南芥与野生型拟南芥相比，表型发生显著变化，参见表1，转A-GbGUT1拟南芥株系与野生型表型指标的比较(其中，WT为野生型拟南芥对照，AGUT为转A-GbGUT1拟南芥T3代不同株系)，转A-GbGUT1拟南芥株系茎长度短于野生型，茎粗明显变细，茎秆强度亦显著变小。

表1野生型和T3代转反义GbGUT拟南芥表型性状的比较

株系	WT	AGUT-2	AGUT-5	AGUT-9
					茎长/cm	29.82±0.68	27.67±0.69*	27.83±0.51*	27.57±0.58*
茎粗/mm	1.077±0.02	0.99±0.02**	0.99±0.02**	0.98±0.02**
					茎秆强度/N	13.09±0.71	10.82±0.74*	9.56±0.53**	9.21±0.44**

注：*表示0.05水平的显著性,**表示0.01水平的显著性。

③细胞壁成分分析：为进一步确定GbGUT1在细胞壁多糖转化中的功能，提取转基因和野生型拟南芥的细胞壁，采用蒽酮比色法以及间羟基联苯法测定拟南芥细胞壁中纤维素的含量和半乳糖醛酸的含量。

测定纤维素含量的具体步骤为：采用乙酸、硝酸和水(8：1：2)的混合溶液沸水浴提取细胞壁中纤维素；ddH₂O和丙酮洗涤后真空抽干；用72％的硫酸重新溶解纤维素；加入蒽酮试剂并充分反应后测定A₆₂₀，对比标准曲线既得细胞壁纤维素含量。

结果显示转反义GbGUT1拟南芥株系(A-GbGUT1)纤维素含量与野生型相比显著升高(图5)。

测定糖醛酸含量的具体步骤为：准确称取细胞壁材料1mg至具塞试管中，加入0.5mL超纯水，空白对照只加0.5mL超纯水；加入A液(浓硫酸配制0.5％(W/V)Na₂B₄O₇溶液)4.5mL，继续冷却，充分振荡混匀；然后浸于沸水浴中10min后取出，立即置于冰水浴冷却室温；加入B液(超纯水配制含0.15％间羟基联苯的5％NaOH溶液)0.05mL，充分振荡显色，超声波取出气泡，静置20min；测定A₅₂₅，计算拟南芥细胞壁中醛酸糖含量。

结果显示转反义GbGUT1拟南芥株系(A-GbGUT1)醛酸糖含量与野生型相比显著升高(图6)。

测定果胶含量的具体步骤为：

准确称取生长五周左右转反义GbGUT1拟南芥叶片1-2克，装入研钵中并加入含2％Na₂CO₃和0.16％NaOH的溶液5毫升，仔细的进行研磨。悬浮液转移到50毫升离心管中，而将残留物用10毫升碱性苏打液冲洗。将离心管浸入开水中，在不时搅拌的情况下加热20分钟。然后离心，将溶液倒入小烧杯中，而沉淀每次用10毫升热水冲洗，共冲洗两次，仔细混匀后离心。冲洗后的水与第一部分离心液合并在一起。将结合在离心物中的果胶酸沉淀出来。为此用1毫升冰醋酸酸化溶液，仔细混匀，加2毫升25％氯化钙溶液，再混匀，置电炉上，在搅拌的情况下加热至沸。然后从电炉上取下烧杯，在搅拌的情况下停置约10分钟，以使二氧化碳排出，然后离心。将溶液倒掉，如果全部溶液没有一次装完，应将溶液继续倒入离心管，继续离心，将溶液倒出抛掉，而将沉淀用0.1％的醋酸冲洗4次，每次用10毫升醋酸冲洗离心管中的沉淀残渣，并且每次冲洗时要用玻璃棒充分搅拌。

向冲洗过的沉淀中加入10毫升1％的碳酸钠溶液，混匀，将试管浸入沸水中5分钟，并不时用玻璃棒搅拌。然后进行离心，将溶液倒出抛掉，而将沉淀用5毫升蒸馏水冲洗一次。向沉淀中加入10毫升1％的醋酸溶液，搅匀，置沸水上5分钟，并不时用玻璃棒搅拌。其后离心，将溶液倒入烧杯做滴定用。将沉淀再用10毫升蒸馏水冲洗，并离心，冲洗过的水并入烧杯的溶液中。得到的溶液用络合法测定钙：向溶液中加入5毫升0.1N特里龙B试剂，5毫升铵缓冲液，50毫克铬黑T，用0.02N的硫酸镁滴定至指示剂颜色转为酒红色。在同样条件下用硫酸镁滴定5毫升0.1N的特里龙B溶液。

计算公式

K＝0.1*5/a

K:硫酸镁溶液的滴定度

a:滴定5毫升0.1N特里龙B溶液所消耗的硫酸镁的量(毫升)

X＝22.1*K(a-b)/n

X:分析材料中果胶酸含量(％)

K:硫酸镁溶液的滴定度

a：滴定5毫升0.1N特里龙B所用去的0.02N硫酸镁体积(毫升)

b：滴定钙时所用去的0.02N硫酸镁体积(毫升)

结果显示转反义GbGUT拟南芥株系(A-GbGUT1)果胶含量与野生型相比显著升高(图7)。

④UGD酶活性分析：提取转基因及野生型拟南芥的UGD酶，按株系取生长六周的拟南芥，提取蛋白酶；材料称重，加入两倍体积的蛋白提取液(50mM Tris-HCl(pH＝7.5)；2mMEDTA，用前加5mM DTT)，充分研磨；4℃，11200g离心2min，弃掉细胞壁碎片，上清再次离心2min，即为粗酶液。UGD酶的纯化使用上海生物工程有限公司的重力型Sephadex脱盐柱(BSP090)进行蛋白的脱盐纯化。

纯化步骤:

a.移去重力Sephadex脱盐柱的上盖，倾倒出含有保护剂的储存液。

b.移去重力Sephadex脱盐柱的下盖，将重力型直立固定在铁架上，将重力型Sephadex脱盐柱的流出口伸入到合适的容器中，先用6-7ml的双蒸水或所要替换成的缓冲液将重力型Sephadex脱盐柱平衡三次，待柱中的双蒸水或缓冲液基本流干。

c.将脱盐柱的流出口伸入到1.5ml离心管中或2ml收集管中，将0.2-0.3ml所要的脱盐的或所要替换的蛋白质样品溶液加入到凝胶上方的聚丙烯滤膜片的中央。

d.让蛋白质样品溶液进入到胶体中，当蛋白质样品溶液完全进入胶体中时，脱盐柱中液体将停止流出，而这时可以收集到与所加样品溶液同样体积的平衡液。

e.将脱盐柱的流出口伸入到另一个1.5ml离心管中或2ml收集管中，加入0.5-1ml双蒸水或所要替换成的缓冲液。

f.让双蒸水或所要替换成的缓冲液进入到胶体中，收集从流出口流出的溶液。

g.重复步骤5-6数次，直到所收集的流出液中含有所需要的蛋白质。

结果显示转反义GbGUT1拟南芥株系UGD酶活性与野生型相比显著降低(图8)。

综上所述，转反义GbGUT1拟南芥的果胶含量、醛酸糖含量和纤维素含量相比于野生型均显著升高，而UGD酶活下降。这说明反义GUT1降低了葡糖醛酸转移酶的表达，使底物UDP-葡萄糖醛酸含量上升，而UDP-葡萄糖醛酸的上升又反馈抑制了UDP-葡萄糖脱氢酶使之下降。UDP-葡萄糖脱氢酶催化UDP-葡萄糖生成UDP-葡萄糖醛酸，因此UDP-葡萄糖脱氢酶的降低导致了UDP-葡萄糖含量升高，从而引起纤维素含量的升高。糖醛酸含量上升直接导致果胶含量的上升，这必然打破了植物中原来纤维素多糖和非纤维素多糖的平衡。使其表型发生一系列变化，茎长变短，茎粗变细，茎杆强度变弱。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种棉花GbGUT1基因，其特征在于，所述基因的开放阅读框序列为1239 bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述的棉花GbGUT1基因所编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.含有权利要求1所述基因的表达载体。

4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为反义表达载体。

5.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为真核表达载体。

6.权利要求1所述的基因或权利要求3-5中任意一项所述的表达载体在提高棉纤维品质中的应用。

7.一种特异性引物在扩增权利要求1所述的棉花GbGUT1基因中的应用，所述特异性引物为：

上游引物：5’- CCATCCTTCTTCCGAGTGCTTCAG -3’；

下游引物：5’- GGAGGCCTGGTGAGGCAGTGAAT -3’。