CN105039246A - 一种促进小鼠皮肤干细胞分化的原始生殖细胞增殖的方法 - Google Patents

Abstract

本发明是一种促进小鼠皮肤来源干细胞分化的原始生殖细胞增殖的方法，包括以下操作步骤：第一步，小鼠皮肤干细胞的分离培养；第二步，小鼠皮肤干细胞体外形成拟胚体结构；第三步，小鼠胚胎成纤维细胞的培养及饲养层细胞的制备；第四步，拟胚体细胞与饲养层细胞共培养向原始生殖细胞分化；其中，在第四步中加入视黄酸来促进原始生殖细胞的增殖。视黄酸能够促进皮肤干细胞来源的原始生殖细胞以及体内来源的原始生殖细胞的体外增殖，达到了从有限的材料来源获得大量的原始细胞样细胞的目的，操作简便，可重复性好。

Description

一种促进小鼠皮肤干细胞分化的原始生殖细胞增殖的方法

技术领域

本发明是一种促进小鼠皮肤干细胞分化的原始生殖细胞增殖的技术方法，属于生物医学的干细胞与组织工程学技术领域。

背景技术

干细胞体外分化为生殖细胞为治疗不孕不育带来了新的希望。胚胎干细胞向配子分化的研究已经有较多报道，但是它存在着道德伦理的争议。而患者皮肤干细胞向配子分化具有取材方便、来源丰富和避免移植的免疫反应等优点，成为干细胞向配子分化研究的一个新的开拓方向。将干细胞分化成配子的研究和应用需要大量的早期生殖细胞，在体外如何高效的获得数量更多的原始生殖细胞是我们目前亟待解决的问题之一。

皮肤是人体中最大的器官，在机体中具有较强的再生能力。皮肤干细胞赋予了皮肤极强的修复和再生能力，它在胚胎发育阶段由外胚层分化而来，直至成年一直具有增殖分化的潜能。皮肤干细胞具有三个显著的特征：首先，它具有慢周期性，其增殖周期为短暂增殖细胞的两倍，由于其分裂缓慢，在细胞分裂活跃时加入氚标的胸苷可长期检测到其放射活性；其次，它在体外培养过程中能够无限增殖，在机体中有能够自我更新，保证了损伤的正常修复，正常成人的皮肤每2秒钟就会产生100万个新生细胞，大约每28天更新一次。皮肤干细胞的另一个特点是具有黏附性，主要通过表达整合素蛋白实现对基底膜的黏附，这一特性是诱导干细胞脱离干细胞群落进入分化的重要过程。皮肤干细胞的这些特性是研究成体干细胞向生殖细胞分化过程的基础，有科学家分离了猪的皮肤来源干细胞并且证明了其具有多向分化的潜能，随后，他们证明猪来源皮肤干细胞在猪卵泡液的诱导下具有体外分化成卵母细胞的能力，并且这些卵母细胞样细胞能够发育成孤雌胚胎样结构。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术缺点，提供一种促进新生小鼠皮肤干细胞分化的原始生殖细胞增殖的方法。本发明方法分离新生鼠皮肤，体外培养皮肤干细胞，利用视黄酸诱导成功获得大量状态良好的原始生殖细胞。

具体操作如下：

第一步：小鼠皮肤干细胞的分离培养

收集出生当天小鼠，用剪刀和镊子将小鼠背部皮肤整块撕下来，将皮肤组织剪成1-2mm²左右的碎片，消化后弃掉消化液，使用40μm细胞滤器过滤细胞，收集单细胞。加皮肤干细胞培养液重悬细胞，将细胞过150目细胞筛。

第二步：小鼠皮肤干细胞体外形成拟胚体结构

当细胞培养到第二代又3-4天时，将细胞收集到离心管中，离心，弃上清液，加入拟胚体分化培养液，吹打成单细胞，细胞计数，分散到24孔板中培养，每两天换半液，用枪将其吹散，继续悬浮培养，1天后悬浮细胞会聚集形成拟胚体结构，4天时拟胚体结构变得致密，并且体积增大。

第三步：小鼠胚胎成纤维细胞的培养及饲养层细胞的制备

取出子宫中的胎鼠，只保留躯干部分，用0.25%胰蛋白酶+0.04%EDTA消化。消化后用移液枪吹打，离心，加培养液重悬细胞，400目细胞筛过滤，把细胞接种到成纤维细胞培养液中培养，贴壁培养，作P0代。传代时收集细胞悬液，离心，接入成纤维细胞培养液中培养。选P2-P4代生长在对数期的胚胎成纤维细胞，加入含有丝裂霉素C的成纤维细胞培养液，培养箱中孵育。孵育完后用PBS洗5遍，用0.25%胰蛋白酶将贴壁的成纤维细胞消化下来，收集细胞。重悬细胞后，转入24孔贴壁培养板，每孔接种6-8×10⁴个成纤维细胞，几乎全部细胞贴壁后可用来做饲养层细胞。

第四步：拟胚体细胞与饲养层细胞共培养向原始生殖细胞分化

将培养的拟胚体消化成单细胞，加入少量原始生殖细胞培养液悬浮细胞，将细胞稀释为10⁵个cells/ml，然后接种到饲养层细胞所在的24孔板中，用原始生殖细胞培养液培养。两天后，待到几乎全部的细胞贴壁生长，在不破坏培养皿底部细胞的基础上，用移液枪吸走全部培养液，加入500μl新的含有不同浓度的视黄酸（0μmol/L~10μmol/L）的原始生殖细胞培养液，继续培养，此后每两天换半液，即吸出200μl培养液，加入250μl预暖的新鲜原始生殖细胞培养液。培养至第4天之后，原始生殖细胞开始大量出现。

通过以下步骤来检测和验证视黄酸对原始生殖细胞增殖的促进作用：

1、溴脱氧核苷尿嘧啶（BrdU）染色

小鼠原始生殖细胞与饲养层细胞共同用0.25%胰蛋白酶+0.04%EDTA消化液消化下来并消化成单细胞固定、染色、一抗二抗孵育，封片，镜检

2、细胞免疫荧光

小鼠原始生殖细胞与饲养层细胞共同用0.25%胰蛋白酶+0.04%EDTA消化液消化下来并消化成单细胞，PBS清洗，固定，山羊血清封闭，一抗、二抗孵育，封片，镜检

3、流式细胞仪分析细胞周期

收集细胞，消化成单细胞，清洗，乙醇固定，加50μlPI稀释液孵育，加入1mlPBS混匀，过300目细胞筛，将细胞转移到流式管中上机。

4、流式统计小鼠原始生殖细胞SSEA-1的阳性细胞

收集细胞，消化成单细胞，清洗，多聚甲醛固定，清洗，加入PBST（含0.05%TritonX-100的PBS）透化，加入含山羊血清或马血清的PBST，室温封闭一小时，加入二抗（FITC标记的山羊抗小鼠），37℃避光放置1小时，PBS清洗，加入4%多聚甲醛，300目细胞筛过滤，上机。

本说明书中出现的中英文技术术语对照：胚胎干细胞－ESCs；皮肤干细胞－SDSCs；原始生殖细胞－PGCs；拟胚体－EBs；胚胎成纤维细胞－MEF；磷酸盐缓冲液－PBS

本发明方法建立了视黄酸促进小鼠皮肤干细胞分化的原始生殖细胞增殖的方法，从有限的材料来源获得大量的原始细胞样细胞，操作简便，可重复性好。为小鼠皮肤干细胞体外培养及研究应用提供了技术基础。

附图说明

附图是小鼠原始生殖细胞的分化以及视黄酸对增殖的影响

其中，A-D分别是培养4天时添加0μM、2μM、5μM和10μM视黄酸的原始生殖细胞形态；E-H分别是培养6天时添加0μM、2μM、5μM和10μM视黄酸的原始生殖细胞形态；I-L分别是培养8天时添加0μM、2μM、5μM和10μM视黄酸的原始生殖细胞形态。

具体实施方式

实施例一：

第一步：小鼠皮肤干细胞的分离培养

收集出生当天小鼠，用剪刀和镊子将小鼠背部皮肤整块撕下来，去掉脂肪和血液，将干净的皮肤组织用PBS洗三遍，剪成1-2mm²左右的碎片，剪碎的组织加入10mlPBS1500rpm离心5min，弃上清，加加1ml0.25%Trypsin+0.04%EDTA消化液后，用枪头搅拌混匀，置于37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱中消化20-30min，消化后弃掉消化液，使用40μm细胞滤器过滤细胞，收集单细胞。加1ml皮肤干细胞培养液重悬细胞，将细胞再次过150目细胞筛。将细胞接种到100mm悬浮培养版上，在5%二氧化碳培养箱中培养。

小鼠皮肤干细胞培养液：DMEM/F12+2%B-27+20ng/mlEGF+40ng/mlbFGF+1%青链霉素。

第二步：小鼠皮肤干细胞体外形成拟胚体

当细胞培养到第二代又3-4天时，将细胞收集到15ml离心管中，离心，弃上清液，加入EB分化培养液，吹打成单细胞，细胞计数，分散到24孔板中培养，每两天换半液，用枪将其吹散。

拟胚体培养液：Medium199+3mg/mlBSA+1mg/mlFetuin+5μl/mlITS+0.23mM丙酮酸钠+1ng/mlFGF。

第三步：小鼠成纤维细胞的培养与饲养层细胞的制备

取出子宫中的胎鼠，只保留躯干部分，用0.25%胰蛋白酶+0.04%EDTA消化5min。消化后用移液枪吹打，离心，加培养液重悬细胞，过400目细胞筛，把细胞接种到成纤维细胞培养液中培养，贴壁培养，作P0代。传代时收集细胞悬液，离心，接入成纤维细胞培养液中培养。

成纤维细胞培养液：DMEM高糖+10%FBS+1%丙酮酸钠+1%非必需氨基酸+1%青链霉素。

选P2-P4代生长在对数期的小鼠成纤维细胞，加入含有丝裂霉素C的成纤维细胞培养液，培养箱中孵育。孵育完后用PBS洗5遍，用0.25%胰蛋白酶将贴壁的成纤维细胞消化下来，收集细胞。重悬细胞后，转入24孔贴壁培养板，每孔接种6-8×10⁴个成纤维细胞，几乎全部细胞贴壁后可用来做饲养层细胞。

第四步：拟胚体细胞与小鼠成纤维细胞共培养向原始生殖细胞分化

培养的拟胚体，用0.25%胰蛋白酶+0.04%EDTA消化成单细胞，加入少量原始生殖细胞培养液悬浮细胞，将细胞稀释为10⁵个cells/ml原始生殖细胞。弃去铺好小鼠胚胎成纤维细胞培养皿中的培养液，用原始生殖细胞培养液培养重悬的细胞培养，每个孔500μl培养液，37℃、饱和湿度、5%CO2条件下培养。两天以后，待到几乎全部的细胞贴壁生长，在不弄坏培养皿底部饲养层细胞的基础上，用移液枪吸走全部的培养液，加入500μl新的含有2μM的视黄酸的原始生殖细胞培养液，继续培养，此后每两天换半液，即吸出200μl培养液，加入250μl预暖的新鲜原始生殖细胞培养液，培养至第4天之后，原始生殖细胞开始大量出现。。

原始生殖细胞培养液：DMEM高糖+10%FBS+0.23mM丙酮酸钠+0.1mM非必需氨基酸+2mML-谷氨酰胺+0.1mMβ-巯基乙醇+20ng/mlEGF+40ng/mlbFGF+40ng/mlSCF+1%青链霉素。

实施例二：

第一步：小鼠皮肤干细胞的分离培养

收集出生当天小鼠,用剪刀和镊子将小鼠背部皮肤整块撕下来，去掉脂肪和血液，将干净的皮肤组织用PBS洗三遍，剪成1-2mm²左右的碎片，剪碎的组织加入10mlPBS1500rpm离心5min，弃上清，加加1ml0.25%Trypsin+0.04%EDTA消化液后，用枪头搅拌混匀，置于37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱中消化20-30min，消化后弃掉消化液，使用40μm细胞滤器过滤细胞，收集单细胞。加1ml皮肤干细胞培养液重悬细胞，将细胞再次过150目细胞筛。将细胞接种到100mm悬浮培养版上，在5%二氧化碳培养箱中培养。

小鼠皮肤干细胞培养液：DMEM/F12+2%B-27+20ng/mlEGF+40ng/mlbFGF+1%青链霉素。

第二步：小鼠皮肤干细胞体外形成拟胚体

当细胞培养到第二代又3-4天时，将细胞收集到15ml离心管中，离心，弃上清液，加入EB分化培养液，吹打成单细胞，细胞计数，分散到24孔板中培养，每两天换半液，用枪将其吹散。

拟胚体培养液：Medium199+3mg/mlBSA+1mg/mlFetuin+5μl/mlITS+0.23mM丙酮酸钠+1ng/mlbFGF。

第三步：小鼠成纤维细胞的培养与饲养层细胞的制备

取出子宫中的胎鼠，只保留躯干部分，用0.25%胰蛋白酶+0.04%EDTA消化5min。消化后用移液枪吹打，离心，加培养液重悬细胞，过400目细胞筛，把细胞接种到成纤维细胞培养液中培养，贴壁培养，作P0代。传代时收集细胞悬液，离心，接入成纤维细胞培养液中培养。

成纤维细胞培养液：DMEM高糖+10%FBS+1%丙酮酸钠+1%非必需氨基酸+1%青链霉素。

选P2-P4代生长在对数期的小鼠成纤维细胞，加入含有丝裂霉素C的成纤维细胞培养液，培养箱中孵育。孵育完后用PBS洗5遍，用0.25%胰蛋白酶将贴壁的成纤维细胞消化下来，收集细胞。重悬细胞后，转入24孔贴壁培养板，每孔接种6-8×10⁴个成纤维细胞，几乎全部细胞贴壁后可用来做饲养层细胞。

第四步：拟胚体细胞与小鼠成纤维细胞共培养向原始生殖细胞分化

培养的拟胚体，用0.25%胰蛋白酶+0.04%EDTA消化成单细胞，加入少量原始生殖细胞培养液悬浮细胞，将细胞稀释为10⁵个cells/ml原始生殖细胞。弃去铺好小鼠胚胎成纤维细胞培养皿中的培养液，用原始生殖细胞培养液培养重悬的细胞培养，每个孔500μl培养液，37℃、饱和湿度、5%CO2条件下培养。两天以后，待到几乎全部的细胞贴壁生长，在不弄坏培养皿底部饲养层细胞的基础上，用移液枪吸走全部的培养液，加入500μl新的含有5μM的视黄酸的原始生殖细胞培养液，继续培养，此后每两天换半液，即吸出200μl培养液，加入250μl预暖的新鲜原始生殖细胞培养液，培养至第4天之后，原始生殖细胞开始大量出现。。

原始生殖细胞培养液：DMEM高糖+10%FBS+0.23mM丙酮酸钠+0.1mM非必需氨基酸+2mML-谷氨酰胺+0.1mMβ-巯基乙醇+20ng/mlEGF+40ng/mlbFGF+40ng/mlSCF+1%青链霉素。

实施例三：

第一步：小鼠皮肤干细胞的分离培养

收集出生当天小鼠,用剪刀和镊子将小鼠背部皮肤整块撕下来，去掉脂肪和血液，将干净的皮肤组织用PBS洗三遍，剪成1-2mm²左右的碎片，剪碎的组织加入10mlPBS1500rpm离心5min，弃上清，加加1ml0.25%Trypsin+0.04%EDTA消化液后，用枪头搅拌混匀，置于37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱中消化20-30min，消化后弃掉消化液，使用40μm细胞滤器过滤细胞，收集单细胞。加1ml皮肤干细胞培养液重悬细胞，将细胞再次过150目细胞筛。将细胞接种到100mm悬浮培养版上，在5%二氧化碳培养箱中培养。

小鼠皮肤干细胞培养液：DMEM/F12+2%B-27+20ng/mlEGF+40ng/mlbFGF+1%青链霉素。

第二步：小鼠皮肤干细胞体外形成拟胚体

当细胞培养到第二代又3-4天时，将细胞收集到15ml离心管中，离心，弃上清液，加入EB分化培养液，吹打成单细胞，细胞计数，分散到24孔板中培养，每两天换半液，用枪将其吹散。

拟胚体培养液：Medium199+3mg/mlBSA+1mg/mlFetuin+5μl/mlITS+0.23mM丙酮酸钠+1ng/mlbFGF。

第三步：小鼠成纤维细胞的培养与饲养层细胞的制备

取出子宫中的胎鼠，只保留躯干部分，用0.25%胰蛋白酶+0.04%EDTA消化5min。消化后用移液枪吹打，离心，加培养液重悬细胞，过400目细胞筛，把细胞接种到成纤维细胞培养液中培养，贴壁培养，作P0代。传代时收集细胞悬液，离心，接入成纤维细胞培养液中培养。

成纤维细胞培养液：DMEM高糖+10%FBS+1%丙酮酸钠+1%非必需氨基酸+1%青链霉素。

选P2-P4代生长在对数期的小鼠成纤维细胞，加入含有丝裂霉素C的成纤维细胞培养液，培养箱中孵育。孵育完后用PBS洗5遍，用0.25%胰蛋白酶将贴壁的成纤维细胞消化下来，收集细胞。重悬细胞后，转入24孔贴壁培养板，每孔接种6-8×10⁴个成纤维细胞，几乎全部细胞贴壁后可用来做饲养层细胞。

第四步：拟胚体细胞与小鼠成纤维细胞共培养向原始生殖细胞分化

培养的拟胚体，用0.25%胰蛋白酶+0.04%EDTA消化成单细胞，加入少量原始生殖细胞培养液悬浮细胞，将细胞稀释为10⁵个cells/ml原始生殖细胞。弃去铺好小鼠胚胎成纤维细胞培养皿中的培养液，用原始生殖细胞培养液培养重悬的细胞培养，每个孔500μl培养液，37℃、饱和湿度、5%CO2条件下培养。两天以后，待到几乎全部的细胞贴壁生长，在不弄坏培养皿底部饲养层细胞的基础上，用移液枪吸走全部的培养液，加入500μl新的含有10μM的视黄酸的原始生殖细胞培养液，继续培养，此后每两天换半液，即吸出200μl培养液，加入250μl预暖的新鲜原始生殖细胞培养液，培养至第4天之后，原始生殖细胞开始大量出现。。

原始生殖细胞培养液：DMEM高糖+10%FBS+0.23mM丙酮酸钠+0.1mM非必需氨基酸+2mML-谷氨酰胺+0.1mMβ-巯基乙醇+20ng/mlEGF+40ng/mlbFGF+40ng/mlSCF+1%青链霉素。

其中，实施例1-3采用以下步骤检测和验证视黄酸对原始生殖细胞增殖的促进作用。

1、BrdU（溴脱氧核苷尿嘧啶）染色

小鼠原始生殖细胞与饲养层细胞共同用0.25%胰蛋白酶+0.04%EDTA消化成单细胞，用10%FBS终止消化；离心，弃上清，用4%多聚甲醛室温固定细胞15min；载玻片事先用APES处理，处理方法如下：APES用丙酮1：50稀释，清洗好的载玻片泡在无水乙醇中，处理之前用干净的纱布擦干净，载玻片依次放入APES、丙酮I和丙酮II的染缸中，三个步骤都是45秒钟，拿出片子自然晾干后即可使用；固定后的细胞滴到处理好的载玻片上，热台38℃烘干；片子放入PSB中洗3遍；将片子放入PBST（含有0.5%TritonX-100的PBS）中透化10min；透化完成后，将片子放入2NHCl中处理20min，PBS洗一遍；吸干片子表面的液体，在载玻片正面滴加50μl含10％山羊血清的PBST，样品区盖加封口膜，放在湿盒中，室温封闭45min；用吸水纸吸去片子上多余的封闭液，用封闭液稀释一抗（BrdU，鼠抗，1：200稀释），每张片子加20μl一抗稀释液于细胞的位置，用封口膜盖住样品区域；片子放到湿盒中密封后放在4℃孵育过夜；一抗孵育结束后，用镊子轻轻揭掉封口膜，放在含有1%BSA的PBS中洗三遍；在暗室中将片子上的PBS吸干净，用含有1%BSA的PBS稀释二抗（Cy3标记的山羊抗小鼠），每张片子滴加20μl二抗稀释液，在细胞区域盖加封口膜；在湿盒中用封口袋封住，37℃孵育1小时；揭掉封口膜，放到PBS中洗3遍；吸干PBS，每张片子加20μlHoechst33342，盖上封口膜室温孵育10min；揭掉封口膜，把片子放在PBS中涮3遍，每遍大约1秒钟。吸干载玻片表面的液体，滴加半滴Vectashield，滴在组织切片边上，盖玻片盖住片子；做好的切片置于干盒中，套上封口袋，4℃保存；用激光共聚焦显微镜观察并采集图像。

2、细胞免疫荧光

小鼠原始生殖细胞与饲养层细胞共同用0.25%胰蛋白酶+0.04%EDTA消化成单细胞离心，弃上清，多聚甲醛室温固定细胞；细胞滴到处理好的载玻片上，热台38℃烘干；用PSB洗3遍，PBST（含有0.5%TritonX-100的PBS）透化10min；PBS洗一遍；加50μl含10％山羊血清的PBST，在样品区盖加封口膜，室温封闭45min；弃去多余的封闭液，用封闭液稀释一抗（SSEA-1，鼠抗，1：80稀释），每张片子加20μl一抗稀释液并盖上封口膜；片子放到湿盒中用封口袋密封后放在4℃孵育过夜；一抗孵育结束后，用含1%BSA的PBS洗三遍；在暗室中每张片子滴加20μl二抗稀释液（cy3标记的山羊抗小鼠），37℃孵育1小时；PBS中洗3遍；每张片子加20μlHoechst33342，盖上封口膜室温孵育10min；揭掉封口膜，PBS洗3遍，每遍大约1秒钟；滴加半滴Vectashield在片子，盖玻片盖住片子，4℃保存在干盒中待观察。

3、流式细胞仪分析细胞周期

小鼠原始生殖细胞与饲养层细胞共同用0.25%胰蛋白酶+0.04%EDTA消化成单细胞离心，弃上清，加入1ml预冷的PBS洗一遍，离心，弃上清，用预冷的70%乙醇4℃固定细胞一小时。离心弃掉固定液，加1mlPBS清洗，离心，弃上清，每个样加50μlPI稀释液(PBS：PI：RNaseA=100：5：1)，避光，37℃孵育30min。孵育完成后，加入1mlPBS混匀，300目细胞筛过滤，转移到流式管中上机。

4、流式统计小鼠原始生殖细胞SSEA-1的阳性细胞

小鼠原始生殖细胞与饲养层细胞共同用0.25%胰蛋白酶+0.04%EDTA消化成单细胞离心，弃上清，PBS清洗，离心，多聚甲醛室温固定30min；离心，弃上清，加入1mlPBS清洗，离心；加入1mlPBST（含0.05%TritonX-100的PBS）透化5min，离心，弃上清后加1mlPBS洗一遍，离心，弃上清，加入含10％山羊血清或马血清的PBST，室温封闭一小时；离心，弃封闭液，加入30μlSSEA-1一抗（1：80稀释），4℃孵育过夜；用含有1％BSA的PBS洗1遍，离心；在暗室中弃上清后加入二抗（FITC标记的山羊抗小鼠，1：50稀释），37℃避光放置1小时；用PBS洗一遍后加入4%多聚甲醛，300目细胞筛过滤，上机。

Claims (6)

1.一种促进小鼠皮肤干细胞分化的原始生殖细胞增殖的方法，包括以下操作步骤：第一步，小鼠皮肤干细胞的分离培养；第二步，小鼠皮肤干细胞体外形成拟胚体结构；第三步，小鼠胚胎成纤维细胞的培养及饲养层细胞的制备；第四步，拟胚体细胞与饲养层细胞共培养向原始生殖细胞分化；其特征在于，在第四步中还加入视黄酸来促进原始生殖细胞的增殖。

2.根据权利要求1所述的一种促进小鼠皮肤干细胞分化的原始生殖细胞增殖的方法，其特征在于，加入的视黄酸的浓度为2μmol/L~10μmol/L。

3.根据权利要求2所述的一种促进小鼠皮肤干细胞分化的原始生殖细胞增殖的方法，其特征在于，所述的小鼠皮肤干细胞的分离培养包含以下步骤：通过收集出生当天小鼠，取背部皮肤，将皮肤组织剪成1-2mm²的碎片，消化后弃掉消化液，使用40μm细胞滤器过滤细胞，收集单细胞，加皮肤干细胞培养液重悬细胞，将细胞过150目细胞筛。

4.根据权利要求2所述的一种促进小鼠皮肤干细胞分化的原始生殖细胞增殖的方法，其特征在于，所述的小鼠皮肤干细胞体外形成拟胚体结构包含以下步骤：将第一步所得的小鼠皮肤干细胞培养到第二代又3-4天时，将细胞收集到离心管中，离心，弃上清液，加入拟胚体分化培养液，吹打成单细胞，分散到24孔板中培养，每两天换半液，用枪将其吹散，继续悬浮培养，1天后悬浮细胞会聚集形成拟胚体结构，4天时拟胚体结构变得致密，并且体积增大。

5.根据权利要求2所述的一种促进小鼠皮肤干细胞分化的原始生殖细胞增殖的方法，其特征在于，所述的小鼠胚胎成纤维细胞的培养及饲养层细胞的制备包含以下步骤：取出子宫中的胎鼠，只保留躯干部分，用0.25%胰蛋白酶+0.04%EDTA消化，消化后用移液枪吹打，离心，加培养液重悬细胞，400目细胞筛过滤，把细胞接种到成纤维细胞培养液中培养，贴壁培养，作P0代，传代时收集细胞悬液，离心，接入成纤维细胞培养液中培养，选P2-P4代生长在对数期的胚胎成纤维细胞，加入含有丝裂霉素C的成纤维细胞培养液，培养箱中孵育，孵育完后用磷酸缓冲液洗5遍，用0.25%胰蛋白酶将贴壁的成纤维细胞消化下来，收集细胞，重悬细胞后，转入24孔贴壁培养板，每孔接种6-8×10⁴个成纤维细胞，几乎全部细胞贴壁后可用来做饲养层细胞。

6.根据权利要求2所述的一种促进小鼠皮肤干细胞分化的原始生殖细胞增殖的方法，其特征在于，所述的拟胚体细胞与饲养层细胞共培养向原始生殖细胞分化过程包含以下步骤：将第二步培养的拟胚体消化成单细胞，加入少量原始生殖细胞培养液悬浮细胞，将细胞稀释为10⁵个cells/ml，然后接种到饲养层细胞所在的24孔板中，用原始生殖细胞培养液培养，两天后，待到几乎全部的细胞贴壁生长，在不破坏培养皿底部细胞的基础上，用移液枪吸走全部培养液，加入500μl新的视黄酸的原始生殖细胞培养液，继续培养，此后每两天换半液，即吸出200μl培养液，加入250μl预暖的新鲜原始生殖细胞培养液，培养至第4天之后，原始生殖细胞开始大量出现。