CN105021734A - 一种基于尿中本胆烷醇酮检测新型睾酮兴奋剂的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于尿中本胆烷醇酮检测新型睾酮兴奋剂的方法，包括：取尿样，在恒温水浴中酶解，本胆烷醇酮葡萄糖醛酸甙经酶解后生成本胆烷醇酮，提取本胆烷醇酮，测定其碳元素同位素比，得δ1值，将提取到的本胆烷醇酮经化学方法处理后，得到A-nor-5β-androstane-2,17-dione，测定A-nor-5β-androstane-2,17-dione的碳元素同位素比，得δ2值，考察两个化合物的碳元素同位素比值，如果δ1-δ2的差值大于2.8‰，则表明尿样来源于服用新型睾酮兴奋剂的尿样。本方法用于体育领域新型睾酮兴奋剂的检测，检测灵敏，准确性高。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于尿中本胆烷醇酮检测新型睾酮兴奋剂的方法，属于医学检测领域。
背景技术
反兴奋剂技术的进步保障了竞技体育的健康持续发展，兴奋剂检测的实施必须严格遵循世界反兴奋剂机构(World Anti-Doping Agency,WADA)公布的禁用物质检测规则。
睾酮是经常被使用的一种内源性类固醇兴奋剂。人体自身所分泌的睾酮与药用睾酮化学结构相同，但研究表明，药用睾酮与人体分泌的睾酮的碳元素同位素比(13C/12C，单位为‰)不同。药用睾酮的13C/12C值低于-27‰，而人体自身分泌的睾酮,13C/12C值范围为-16.7‰至-25.8‰，当人体服用药用睾酮后，13C/12C值会降低。因此，WADA规定使用同位素比质谱(Isotope ratiomass spectrometry,IRMS)测定碳元素同位素比值(13C/12C，单位为‰)，以区分人体分泌的睾酮与体外摄入的药用睾酮，气相色谱/燃烧炉/同位素比质谱(gas-chromatography/combustion/isotope ratio mass spectrometry，GC/C/IRMS)可测定同位素比，以δ值(‰)表示。
现有研究表明，在碳3位上13C标记的睾酮有商品出售，它与药用睾酮混合后可以组成一种新型睾酮兴奋剂，当使用此种新型睾酮兴奋剂后，13C/12C值(δ值)落入人体分泌的睾酮的13C/12C值(δ值)范围内。因此，已有的检测方法无法检测这种新型睾酮兴奋剂了。
目前，有基于雄酮的方法用于此种新型睾酮兴奋剂的检测。但是当人体摄入多种药物，会导致尿样成分的多样性及复杂性。此时检测尿样中雄酮时，因干扰因素的存在，会影响检测结果。因此，对此种新型睾酮兴奋剂应该开发新的检测方法，以适应不同的检测情况。
本胆烷醇酮(Etiocholanolone)，别名：还原尿睾酮，5β-androstan-3α-ol-17-one，分子式：C19H30O2，为睾酮在人体内的代谢产物，在尿液中与葡萄糖醛酸结合，生成本胆烷醇酮葡萄糖醛酸甙，被排出体外，本胆烷醇酮的结构如下：
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种基于尿中本胆烷醇酮检测新型睾酮兴奋剂的方法，用于新型睾酮兴奋剂的检测，本方法检测灵敏，准确性高。
本申请发明人经过研究发现，尿样中本胆烷醇酮葡萄糖醛酸甙浓度较大，灵敏度较高，与其它代谢物相比具有较便捷的操作性，并且它是睾酮在人尿中的代谢产物，可以用于新型睾酮兴奋剂的检测，检测的关键在于将尿样中高灵敏度的本胆烷醇酮提取出来，并将其分子中C-3位标记的13C消除，生成新化合物A-失碳-5β-雄甾烷-2，17-二酮(A-nor-5β-androstane-2,17-dione)。本申请发明人经研究证实，消除3位碳前后的两个化合物的13C/12C值(δ值)产生较大差异，利用此特性可以检测新型睾酮兴奋剂。
本申请发明人经研究发现，将尿样中本胆烷醇酮反应生成A-nor-5β-androstane-2,17-dione的方法中，操作条件十分重要，为了得到高产率的新化合物A-nor-5β-androstane-2,17-dione，需严格遵守所用化学试剂、化学试剂用量和操作步骤。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种基于尿中本胆烷醇酮检测新型睾酮兴奋剂的方法，包括：
取尿样6mL，加入1mL pH＝7.0的磷酸盐缓冲液和50μLβ-葡萄糖醛酸甙酶溶液，混匀，在55℃恒温水浴中酶解3小时，取出，加入8mL叔丁基甲醚振荡萃取，离心，吸取上层有机溶液，在65℃加热的情况下用氮气吹干，再用50μL 100％乙腈溶剂溶解，转入样品瓶中，封盖，以HPLC纯化，收集24-25分钟含有本胆烷醇酮的流出液1mL，取50μL的流出液，在60℃加热的情况下用氮气吹干，采用同位素比质谱仪分析其碳元素同位素比(13C/12C)，得本胆烷醇酮的δ1值，余下的流出液在60℃加热的情况下用氮气吹干，得本胆烷醇酮；
取上述制备的本胆烷醇酮，加入4μL冰醋酸及16μL氧化剂，在68℃保持1小时，再升温至90℃保持1小时，得反应液，反应液用50μL CH2Cl2提取两次,合并提取液,提取液用氮气吹干后，加入20mg无水碳酸钠及10μL醋酐，在120℃保持2.5小时后，用氮气吹干，再加入超纯水分散残渣，用50μL CH2Cl2提取，有机层在60℃加热的情况下用氮气吹干，得到A-nor-5β-androstane-2,17-dione，采用同位素比质谱仪分析其碳元素同位素比(13C/12C)，得A-nor-5β-androstane-2,17-dione的δ2值；
考察本胆烷醇酮的δ1值与A-nor-5β-androstane-2,17-dione的δ2值，如δ1-δ2的差值大于2.8‰，则表明尿样为使用新型睾酮兴奋剂的尿样。
将差值界限设为2.8‰，依据WADA技术文件(WADA Technical Document,Availablefrom:https://www.wada-ama.org/en/resources/science-medicine/td2014-irms)，检测误差为±2.8‰，取其绝对值为2.8‰。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，所述HPLC纯化的步骤为：进样量为45μL，色谱柱为ZORBAXSB-C18，规格为4.6mm×250mm×5μm，流动相为乙腈-水系统，洗脱起始流动相体积比为：30％乙腈-70％水，等梯度洗脱，于40分钟内完成至流动相为100％乙腈，流速为1mL/min。
进一步，所述氧化剂由13.5g的铬酐、500mL的H2O和40mL质量浓度70％的H2SO4组成。
本发明的有益效果是：
本发明提供一种基于尿中本胆烷醇酮检测新型睾酮兴奋剂的方法，适用于掺有13C标记的新型睾酮兴奋剂，主要是基于尿样中本胆烷醇酮进行检测，本方法检测灵敏，准确性高。
附图说明
图1为实施例1中A-nor-5β-androstane-2,17-dione对照品的GC总离子流图；
图2为实施例1中A-nor-5β-androstane-2,17-dione对照品的MS质谱图谱；
图3为实施例1中由尿样中本胆烷醇酮制备的A-nor-5β-androstane-2,17-dione的GC总离子流图。
图4为实施例1中由尿样中本胆烷醇酮制备的A-nor-5β-androstane-2,17-dione的MS质谱图谱。
具体实施方式
以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
下面实施例所用A-nor-5β-androstane-2,17-dione对照品由复旦大学赠送。
实施例1
一、仪器设备
十万分之一电子天平：Satorious公司，瑞士；
离心机：LD5-2A，北京医用离心机厂；
吹氮头：北京市朝阳区洼里医疗器械厂；
快速漩涡混匀器：深圳国华公司；
超纯水制备仪：Milli-Q，MILLIPORE公司；
气相色谱/质谱联用仪(GC/MS)：HP6890/5973，Agilent Technologies；
高效液相色谱仪(HPLC)：Waters 2796；自动收集器：Waters FractionCollector III,Waters公司；
气相色谱/燃烧炉/同位素比质谱仪(GC/C/IRMS)：DELTA V，ThermoScientific。
二、试剂
磷酸盐缓冲液：在0.2mol/l磷酸二氢钾水溶液中，逐渐加入0.2mol/l磷酸氢二钾水溶液，用pH计检测pH值，直至pH＝7.0。
β-葡萄糖醛酸甙酶(购自Sigma-Aldrich公司)溶液：取β-葡萄糖醛酸甙酶β-Glucuronidase from E.coli IX-A型(Sigma)适量，溶解于磷酸盐缓冲液中，配制成50,000unit/mL的溶液，置-4℃冰箱保存，备用。
三、仪器操作条件
GC/MS仪器操作条件
色谱柱及升温程序：HP-5毛细管色谱柱，30m×0.2mm i.d.×0.33μm，起始温度为160℃，保持1分钟，以每分钟6.5℃的速率升温至260℃，再以每分钟3℃的速率升温至285℃，保持3分钟；
接口温度：300℃；
采用恒流模式，柱流速：1mL/min；
不分流；
进样1μL；
质谱离子源为EI源，70eV；
采集模式：SCAN方式，采集质量范围：5-500amu。
GC/C/IRMS仪器操作条件
色谱柱及升温程序：HP-5毛细管色谱柱，25m×0.2mm i.d.×0.33μm，升温程序为：起始温度为180℃，保持1分钟，以每分钟6℃的速率升温至255℃，再以每分钟3℃的速率升温至285℃，保持3分钟；
进样口温度：280℃；不分流；进样1μL；
采用恒流模式，柱流速：1mL/min(25℃)；
燃烧炉温度：1000℃。
四、方法
取尿样6mL，加入1mL pH＝7.0的磷酸盐缓冲液和50μLβ-葡萄糖醛酸甙酶溶液，混匀，在55℃恒温水浴中酶解3小时，取出，加入8mL叔丁基甲醚振荡萃取，离心，吸取上层有机溶液，在65℃加热的情况下用氮气吹干，再用50μL 100％乙腈溶剂溶解，转入样品瓶中，封盖，以HPLC纯化，进样量为45μL，色谱柱ZORBAX SB-C18(4.6mm×250mm×5μm)，流动相为乙腈-水系统，40分钟内完成此系统体积比例变化，由30％乙腈:70％水到100％乙腈，等梯度洗脱，流速为1.0mL/min。收集24-25分钟含有本胆烷醇酮的流出液1mL，取50μL的流出液，在60℃加热的情况下用氮气吹干，采用同位素比质谱仪分析其碳元素同位素比(13C/12C)，得到本胆烷醇酮的δ1值，余下的流出液在60℃加热的情况下用氮气吹干，得本胆烷醇酮；
取上述制备的本胆烷醇酮，加入4μL冰醋酸及16μL氧化剂(CrO3:H2O:质量分数70％的H2SO4＝13.5g:500mL:40mL)，在68℃保持1小时，再升温至90℃保持1小时，得反应液。反应液用50μL CH2Cl2提取两次,合并提取液,提取液用氮气吹干后，加入20mg无水碳酸钠及10μL醋酐，在120℃保持2.5小时后，用氮气吹干，再加入超纯水分散残渣，用50μL CH2Cl2提取，有机层在60℃加热的情况下用氮气吹干，得到A-nor-5β-androstane-2,17-dione，采用GC/MS检测生成物的质谱图，与对照品质谱图对比，确证该化合物为A-nor-5β-androstane-2,17-dione，如图1-4所示。采用同位素比质谱仪分析其碳元素同位素比(13C/12C)，得到A-nor-5β-androstane-2,17-dione的δ2值。
考察本胆烷醇酮的δ1值与A-nor-5β-androstane-2,17-dione的δ2值，如δ1-δ2的差值大于2.8‰，则表明样本为使用新型睾酮兴奋剂的尿样。
实施例2考察参数
对于本检测方法的研究表明，由提取自尿样的本胆烷醇酮制备A-nor-5β-androstane-2,17-dione的操作是检测的关键步骤。氧化剂的配比、试剂的性质及用量、温度等参数的细微变化对检测效果影响很大。在研究并确定上述操作条件时，选择如下参数进行了考察：
1、考察氧化剂的组成
仪器设备、试剂、仪器操作条件和方法与实施例1相同，区别在于加入15μL冰醋酸及50μL不同组成的氧化剂，在60℃保持2小时，氧化剂的具体组成见表1。
考察结果表明，氧化剂组成的变化对A-nor-5β-androstane-2,17-dione的产率影响很大，结果见表1。氧化剂配比最终确定为CrO3:H2O:质量分数70％的H2SO4＝13.5g:500mL:40mL。
表1不同组成的氧化剂对产率的影响
2、考察加入冰醋酸和氧化剂的体积
在确定氧化剂的配比为CrO3:H2O:质量分数70％的H2SO4＝13.5g:500mL:40mL后，进一步考察加入冰醋酸和氧化剂的体积对A-nor-5β-androstane-2,17-dione产率的影响。
仪器设备、试剂、仪器操作条件和方法与实施例1相同，区别在于加入不同体积的冰醋酸和氧化剂，在60℃保持2小时，加入冰醋酸及氧化剂的具体体积见表2。
考察结果表明，加入冰醋酸及氧化剂的体积对A-nor-5β-androstane-2,17-dione的产率有影响，确定的操作条件为：加入4μL冰醋酸及16μL氧化剂。
表2冰醋酸及氧化剂的体积对产率的影响
3、考察加热温度和时间
在确定氧化剂的配比为CrO3:H2O:质量分数70％的H2SO4＝13.5g:500mL:40mL，加入4μL冰醋酸及16μL氧化剂后，进一步考察加热温度和时间对A-nor-5β-androstane-2,17-dione产率的影响。
仪器设备、试剂、仪器操作条件和方法与实施例1相同，区别在于加入冰醋酸和氧化剂后的加热温度和时间不同，具体数值见表3。
考察结果表明，加热温度和时间对A-nor-5β-androstane-2,17-dione产率有影响，优选的条件为：68℃保持1小时，再升温至90℃保持1小时。
表3加热温度和时间对产率的影响
4、考察所用脱水剂
在确定氧化剂的配比为CrO3:H2O:质量分数70％的H2SO4＝13.5g:500mL:40mL，加入4μL冰醋酸及16μL氧化剂，68℃保持1小时，再升温至90℃保持1小时后，进一步考察脱水剂对A-nor-5β-androstane-2,17-dione产率的影响。
仪器设备、试剂、仪器操作条件和方法与实施例1相同，区别在于所用脱水剂不同，具体见表4。
考察结果表明，脱水剂的种类对A-nor-5β-androstane-2,17-dione的生成影响很大。确定的脱水剂为20mg无水碳酸钠。
表4脱水剂对产率的影响
| 脱水剂 | A-nor-5β-androstane-2,17-dione产率 |
| 40mg无水醋酸钠 | 0 |
| 40mg无水碳酸钠 | 84％ |
| 20mg无水碳酸钠 | 90％ |
使用同位素比质谱仪测定尿样中化合物碳元素同位素比(δ值)时，要求被检测物质的量足够大。因为尿样中雄性激素及代谢物的浓度较低，以ng/mL为单位，因此操作中A-nor-5β-androstane-2,17-dione的产率对检测影响很大。经以上1-4项参数的选择试验，最终确定的操作条件为前述本申请中描述的条件。
实施例3
制造本申请描述的13C标记的睾酮对照品的化合物为Testosterone-13C[(17β)-17-Hydroxyandrost-4-en-3-one-13C，T-3-13C]，购于Toronto Research Chemicals Inc。
掺有13C标记睾酮对照品的新型睾酮材料的制备：制备新型睾酮所用原料为药用睾酮和对照品T-3-13C。药用睾酮购自上海制药厂，在药用睾酮中逐渐加入对照品T-3-13C，混合后测定δ值，直至其δ值为-20.6‰，将新型睾酮材料填装入胶囊中，每粒胶囊中有80毫克。
本次实验的10名受试者为男性健康的志愿者。经测定，受试者体内激素代谢正常，类固醇激素含量正常。
将受试者随机分为两组：5名受试者为安慰剂组，口服空胶囊；另外5名受试者为服药组，口服含有新型睾酮成分的胶囊。在服药2小时后留取尿样。实验人员收集每名受试者的尿样各100mL。
本实验对安慰剂组和服药组的尿样分别进行处理，处理方法、所用仪器设备、试剂和仪器操作条件与实施例1相同，考察本胆烷醇酮的δ1值与A-nor-5β-androstane-2,17-dione的δ2值的差值(δ1-δ2)，以2.8‰为界限，确定检测结果。
安慰剂组5名受试者的检测结果为：5名受试者本胆烷醇酮的δ1值与A-nor-5β-androstane-2,17-dione的δ2值的差值(δ1-δ2)均小于2.8‰，平均值为0.4‰，标准偏差为±0.1‰，结果小于2.8‰，说明5名受试者没有服用新型睾酮兴奋剂。
服药组5名受试者的检测结果为：5名受试者本胆烷醇酮的δ1值与A-nor-5β-androstane-2,17-dione的δ2值的差值(δ1-δ2)均大于2.8‰，平均值为6.12‰，标准偏差为±0.99‰，结果大于2.8‰，说明5名受试者服用了新型睾酮兴奋剂。
本实验对检测方法进行了如下验证：
δ1-δ2差值的日内，日间精密度的测定方法是同一样品分别在1天内进样6次，和3天内进样6次。使用δ1-δ2差值的标准差来反映其精密度是否良好。日内精密度标准差为0.5‰(n＝6)，日间为0.7‰(n＝6)。
实验方法的重现性是通过检测取自同一份尿样的6份相同的样品。通过计算这6份样品的δ1-δ2差值的标准差来判断方法的重现性是否良好。δ1-δ2差值标准差为0.7‰。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种基于尿中本胆烷醇酮检测新型睾酮兴奋剂的方法，其特征在于，包括：
取尿样6mL，加入1mL pH=7.0的磷酸盐缓冲液和50μLβ-葡萄糖醛酸甙酶溶液，混匀，在55℃恒温水浴中酶解3小时，取出，加入8mL叔丁基甲醚振荡萃取，离心，吸取上层有机溶液，在65℃加热的情况下用氮气吹干，再用50μL 100%乙腈溶剂溶解，转入样品瓶中，封盖，以HPLC纯化，收集24-25分钟含有本胆烷醇酮的流出液1mL，取50μL的流出液，在60℃加热的情况下用氮气吹干，采用同位素比质谱仪分析其碳元素同位素比，得本胆烷醇酮的δ1值，余下的流出液在60℃加热的情况下用氮气吹干，得本胆烷醇酮；
取上述制备的本胆烷醇酮，加入4μL冰醋酸及16μL氧化剂，在68℃保持1小时，再升温至90℃保持1小时，得反应液，反应液用50μL CH2Cl2提取两次,合并提取液，提取液用氮气吹干后，加入20mg无水碳酸钠及10μL醋酐，在120℃保持2.5小时后，用氮气吹干，再加入超纯水分散残渣，用50μL CH2Cl2提取，有机层在60℃加热的情况下用氮气吹干，得到A-nor-5β-androstane-2,17-dione，采用同位素比质谱仪分析其碳元素同位素比，得A-nor-5β-androstane-2,17-dione的δ2值；
考察本胆烷醇酮的δ1值与A-nor-5β-androstane-2,17-dione的δ2值，如δ1-δ2的差值大于2.8‰，则表明尿样为使用新型睾酮兴奋剂的尿样。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述HPLC纯化的步骤为：进样量为45μL，色谱柱为ZORBAX SB-C18，规格为4.6mm×250mm×5μm，流动相为乙腈-水系统，洗脱起始流动相体积比为：30%乙腈-70%水，等梯度洗脱，于40分钟内完成至流动相为100%乙腈，流速为1mL/min。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述氧化剂由13.5g的铬酐、500mL的H2O和40mL质量浓度70%的H2SO4组成。
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