CN105012353A - 一种防治糖尿病的药物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种防治糖尿病的药物，其有效成分包括竹红菌甲素、竹红菌乙素、竹红菌丙素、hypomycin？A、麦角甾醇和麦角甾醇过氧化物中的一种或者几种，或者有效成分包括竹黄乙酸乙酯萃取物。本发明对竹黄提取物中多种化合物进行分离和活性研究发现，多种化合物，以及竹黄乙酸乙酯萃取物都具有优良的降糖活性，可用于制备临床糖尿病用药，尤其是治疗Ⅱ型糖尿病，效果最佳，为充分开发竹黄的药用功效，深入开发其药用价值并应用于临床提供有力理论依据。

Description

一种防治糖尿病的药物

技术领域

本发明涉及传统中药竹黄的新用途，具体为一种防治糖尿病的药物，该药物中包括从竹黄中提取的化合物或溶剂萃取物。

背景技术

竹黄，又称竹花、竹参、竹赤斑菌、竹三七、竹次团子等，是子囊军纲肉座菌科真菌竹黄(Shiraia bambusicola P.Henn)的子座，生长于竹竿上。竹黄产地主要分布在江苏、浙江、安徽、江西、湖北、四川等省。竹黄性味淡温，具有通经活络、活血化瘀、镇静、化痰止咳和补中益气的作用，我国民间用药常用于治疗风湿性关节炎、虚寒胃痛、坐骨神经痛、跌打损伤、气管炎、小儿惊风和急性肝炎等症。现代研究报道，竹黄具有镇痛、抗菌、抗病毒、抗肿瘤等作用。

现代药理学对竹黄也做了很多研究，例如殷志琦等利用各种现代色谱方法从药用真菌竹黄菌子座提取物的乙酸乙酯萃取物中分离纯化14个化合物，通过波谱技术和理化性质鉴定它们的结构为竹红菌甲素(1)，竹红菌乙素(2)，竹红菌丙素(3)，hypomycinA(4)，麦角甾醇(5)，麦角甾醇过氧化物(6)，(22E,24R)-5α,8α-过氧化麦角甾-6,9(11),22-三烯-3β-醇(7)，麦角甾-7,24(28)-二烯-3β-醇(8)，(22E,24R)-麦角甾-7,22-二烯-3β,5α,6β-三醇(9)，(22E,24R)-麦角甾-7,22-二烯-3β,5α,6β-三醇-3-O-棕榈酸酯(10)，(22E,24R)-麦角甾-7,22-二烯-3β,5α,6β-三醇-6-O-棕榈酸酯(11)，棕榈酸-α-单甘油酯(12)，棕榈酸-α,α'-甘油二酯(13)，甘露醇(14)。其中化合物(7)～(13)为首次从该属真菌中分离得到(殷志琦,陈占利,张健,叶文才,赵守训.药用真菌竹黄的化学成分研究.中国中药杂志,2013,07:1008-1013)。沈云修等对竹黄的化学成分进行研究，采用硅胶柱色谱进行分离纯化、理化性质和波谱数据鉴定结构，结果分离并鉴定了7个化合物：竹红菌甲素(Ⅰ)，竹红菌乙素(Ⅱ)，竹红菌丙素(Ⅲ)，hypomycinA(Ⅳ)，麦角甾醇(Ⅴ)，过氧化麦角甾醇(Ⅵ)和1,8二羟基蒽醌(Ⅶ)。化合物(Ⅳ)～(Ⅶ)为首次从竹黄中分得。上述7个化合物从竹黄丙酮提取物中分离得到(沈云修,荣先国,高宗华.竹黄的化学成分研究.中国中药杂志,2002,09:37-39)。

关于竹黄的提取工艺，苏宇杰对竹黄中竹红菌素的最佳提取工艺进行了研究，结果发现丙酮为最佳提取溶剂，竹红菌素在酸性条件下稳定性较好，适合在酸性条件下使用(苏宇杰,印小燕,蔡宇杰,等.竹黄中竹红菌素的提取及稳定性研究[J].食品添加剂,2009,30(2):261-264)。

彭京胜等将竹黄药材80℃烘干，用丙酮索氏提取至无色，浓缩成浸膏。浸膏除去水溶性杂质，溶于适量10％氢氧化钠溶液，氯仿萃取至氯仿层接近无色，然后在水溶液中加入适量10％盐酸，氯仿萃取至氯仿溶液接近无色，回收氯仿得到提取物，用石油醚洗涤多次，即为竹红菌素。本法与柱层析等传统方法相比，可有效缩短提取时间、降低成本、简化流程(彭京胜,李晓丽,孙振令,等.竹黄中竹红菌甲素的分离与纯化[J].山东理工大学学报,2004,18(2):91-94)。

寇娴等用制备型薄层层析的方法分离得到竹红菌甲素和乙素。提取溶剂为医用酒精和氯仿，提取物经10g/L的柠檬酸硅胶板进行制备型薄层层析，氯仿-乙醚混合溶剂展开(寇娴,张雁冰,赵清治,等.竹黄中红色素的提取与鉴定[J].河南医科大学学报,1999,34(2):80-81)。刘卫等用乙醇和丙酮对竹黄进行提取，然后分别浓缩提取液放置析晶，将沉淀用乙醇水溶液及乙醇洗涤。乙醇提取物中竹红菌素总量为30％，其中乙素为50％；丙酮提取物中竹红菌素总量为90％，其中甲素为70％，乙素为20％(刘卫.竹红菌素提取分离方法改进[J].蒙自师专学报,1996,13(2):17-20)。

另外还有对竹黄多糖的提取，提取溶剂主要是水和乙醇(魏兆源,蔡宇杰,廖祥儒,等.竹黄菌丝体水溶性多糖提取工艺[J].食品研究与开发,2009,30(11):106-109；陈佳佳,扶教龙.竹黄多糖的提取工艺及清除自由基活性研究[J].江苏农业科学,2008,2:196-1981)。

传统中医药是我国宝贵的文化遗产，为人类健康事业做出了巨大贡献。我国拥有丰富的中草药资源和几千年利用天然药物防病治病的临床经验，除了上述镇痛、抗菌、抗病毒、抗肿瘤等作用外，对于竹黄药用价值的研究仍然有发展空间。

发明内容

本发明的目的是对竹黄进行新的药用价值研究，提供从竹黄中提取的化合物的新用途。

本发明提供一种防治糖尿病的药物，其有效成分包括竹红菌甲素、竹红菌乙素、竹红菌丙素、hypomycinA、麦角甾醇和麦角甾醇过氧化物中的一种或者几种，或者有效成分包括竹黄乙酸乙酯萃取物。上述化合物的结构如下：

实验发现，上述单一化合物或者几种化合物的组合，以及竹黄乙酸乙酯萃取物，均具有治疗糖尿病的作用，可用于治疗或者辅助治疗糖尿病。

优选地，所述竹红菌甲素、竹红菌乙素和竹红菌丙素中的一种或几种，以及竹黄乙酸乙酯萃取物作为为葡萄糖摄取激动剂、葡萄糖转运因子4上膜激动剂和/或一磷酸腺苷激活蛋白激酶激动剂发挥作用。

优选地，竹黄乙酸乙酯萃取物的提取方法如下：

(a)用醇或醇水混合液浸渍或渗滤竹黄粉末，过滤后得到提取液；

(b)将提取液中的溶剂蒸发得到浆状物；

(c)将浆状物加水搅拌，得到混悬液；

(d)用乙酸乙酯对上述的混悬液进行液液萃取，萃取产物蒸发至干，得到竹黄乙酸乙酯萃取物。

优选地，步骤(a)中的醇为乙醇。

上述提取方法工艺简单，提取有效成分含量高，适合规模化生产。

优选地，以上任意一种所述的防治糖尿病的药物，所述糖尿病为Ⅱ型糖尿病。

本发明还提供以上任意一种防治糖尿病的药物在制备辅助治疗糖尿病保健食品中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

将传统中药竹黄进行醇或醇水提取，再一次由乙酸乙酯萃取得到竹黄的乙酸乙酯萃取物。对萃取物的化学成分进行分离纯化和活性研究发现，多种化合物都具有优良的降糖活性，可用于制备临床糖尿病用药，尤其是治疗Ⅱ型糖尿病，效果最佳。本发明为充分开发竹黄的药用功效，深入开发其药用价值并应用于临床提供有力理论依据。

附图说明

图1竹黄乙酸乙酯萃取物提取流程图；

图2竹黄乙酸乙酯萃取物的化合物分离工艺流程图；

图3竹黄乙酸乙酯萃取物对L6细胞葡萄糖摄取的影响；

图4竹黄乙酸乙酯萃取物和主要化合物对L6细胞葡萄糖摄取的影响；

图5竹黄乙酸乙酯萃取物和主要化合物对L6细胞GLUT4转运活性的影响；

图6加入Compound C前后竹黄乙酸乙酯萃取物及主要化合物对GLUT4转运活性影响；

图7竹红菌甲素(HA)、竹红菌乙素(HB)、竹红菌丙素(HC)对L6细胞AMPK活性的影响；

图8竹黄乙酸乙酯萃取物对糖尿病小鼠体重的影响；

图9竹黄乙酸乙酯萃取物对糖尿病小鼠空腹血糖的影响；

图10竹黄乙酸乙酯萃取物对糖尿病小鼠口服糖耐量的影响；

图11竹黄乙酸乙酯萃取物对糖尿病小鼠血清胰岛素的影响；

图12竹黄乙酸乙酯萃取物对糖尿病小鼠血清总胆固醇的影响；

图13竹黄乙酸乙酯萃取物对糖尿病小鼠血清甘油三酯的影响；

图14竹黄乙酸乙酯萃取物对小鼠肝脏中AMPK蛋白活性的影响；

图15竹黄乙酸乙酯萃取物对小鼠骨骼肌中AMPK蛋白活性的影响。

以上图中，normal control表示正常组，vehicle control表示模型组，Metformin表示盐酸二甲双胍阳性药物组，SB-EtOAc表示竹黄乙酸乙酯萃取物。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

一、竹黄提取物的制备

竹黄购于安徽省亳州药材市场，经中南民族大学药学院万定荣教授鉴定为药用真菌竹黄(Shiraia bambusicola P.Henn)。如图1所示，取竹黄干燥粉末2.0kg，按料液比1:8(1.0kg药材对应8.0L的溶剂)用体积浓度为80％的乙醇水溶液浸渍3天，过滤取滤液，滤渣换用同等体积的80％乙醇水溶液浸渍3天，过滤合并两次提取的滤液，减压浓缩得到棕红色浆状物320g；按体积比1:10加水溶解稀释，用三倍体积乙酸乙酯萃取样品，乙酸乙酯萃取液减压浓缩，回收溶剂蒸干，得到竹黄乙酸乙酯萃取物87g。

二、竹黄乙酸乙酯萃取物中化合物的分离

如图2所示，取竹黄乙酸乙酯萃取物80g，加入硅胶(300～400目)80g(竹黄乙酸乙酯萃取物与硅胶质量比1:1)拌匀，充分干燥后转至硅胶柱(300～400目)上，以二氯甲烷-甲醇(体积比100:0，100:0.5，100:1，100:1.25，100:2，100:3，100:5，100:7，100:10，0:100)梯度洗脱，TLC板检测收集合并得到16个部位F1～F16。

F1-F16编号说明：竹黄乙酸乙酯萃取物采用二氯甲烷洗脱，TLC板检测合并相同组分得F1-F3三个组分，从前至后依次标记为F1-F3。采用二氯甲烷与甲醇混合溶剂(体积比100:0.5)继续洗脱，TLC板检测合并相同组分得F4-F5三个组分，从前至后依次标记为F4和F5。采用二氯甲烷与甲醇混合溶剂(体积比100:1)继续洗脱，TLC板检测合并相同组分得F6和F7两个组分，从前至后依次标记为F6和F7。采用二氯甲烷与甲醇混合溶剂(体积比100:1.25)继续洗脱，TLC板检测合并相同组分得F8组分。采用二氯甲烷与甲醇混合溶剂(体积比100:2)继续洗脱，TLC板检测合并相同组分得F9和F10两个组分。采用二氯甲烷与甲醇混合溶剂(体积比100:3)继续洗脱，TLC板检测合并相同组分得组分F11。采用二氯甲烷与甲醇混合溶剂(体积比100:5)继续洗脱，TLC板检测合并相同组分得组分F12。采用二氯甲烷与甲醇混合溶剂(体积比100:7)继续洗脱，TLC板检测合并相同组分得组分F13和F14。采用二氯甲烷与甲醇混合溶剂(体积比100:10)继续洗脱，TLC板检测合并相同组分得组分F15。采用纯甲醇积比100:5)继续洗脱，TLC板检测合并相同组分得组分F16。

F2部位采用硅胶柱层析(薄层层析硅胶H，45～65μm)进行分离，以环己烷-乙酸乙酯(体积比4:1)等度洗脱，TLC板检测收集合并得到8个部位，从前至后依次标记为F2.1～F2.8，F2.2在丙酮中重结晶得化合物A：麦角甾醇(32mg)，F2.4在氯仿中重结晶得化合物B：麦角甾醇过氧化物(53mg)，F2.7在氯仿-甲醇(1:1)混合溶液中重结晶得到化合物C：(22E,24R)-麦角甾-7,22-二烯-3β,5α,6β-三醇(10mg)。

F4部位采用硅胶柱层析(柱层析硅胶H，300～400目)进行分离，以二氯甲烷-甲醇-甲酸(体积比150:1:0.5)等度洗脱，TLC板检测收集合并得到10个部位，从前至后依次标记为F4.1-F4.10；F4.3采用硅胶柱层析(薄层层析硅胶H，45～65μm)进行分离，以环己烷-丙酮-甲酸(体积比100:25:0.5)等度洗脱，TLC板检测收集合并得到6个部位，从前至后依次标记为F4.3.1-F4.3.6，F4.3.2在乙醚中重结晶得化合物D：竹红菌甲素(462mg)，F4.3.4在乙醚中重结晶得化合物E：HypomycinA(53mg)。

F6部位采用硅胶柱层析(柱层析硅胶H，300～400目)进行分离，以二氯甲烷-甲醇-甲酸(体积比100:1:0.5)等度洗脱，TLC板检测收集合并得到9个部位，从前至后依次标记为F6.1-F6.9；F6.3采用硅胶柱层析(薄层层析硅胶H，45～65μm)进行分离，以环己烷-丙酮-甲酸(体积比100:25:0.5)等度洗脱，TLC板检测收集合并得到5个部位，从前至后依次标记为F6.3.1-F6.3.5，F6.3.2在丙酮中重结晶得化合物F：竹红菌乙素(48mg)，F6.3.4在丙酮中重结晶得化合物G：竹红菌丙素(42mg)；F6.5在氯仿-甲醇(3:1)中重结晶得化合物H：(22E,24R)-麦角甾-7,22-二烯-3β,5α,6β-三醇(20mg)。

三、药效学实验

实验一、测试竹黄乙酸乙酯萃取物以及该部位主要各化合物对L6肌肉细胞葡萄糖摄取的影响

L6肌肉细胞完全分化为肌管后，换以含0.5％BSA的无血清DMEM培养16小时后，加入各测试物溶液(竹红菌甲素、竹红菌乙素、竹红菌丙素、HypomycinA、麦角甾醇和麦角甾醇过氧化物均为终浓度10μM；竹黄乙酸乙酯萃取物10μg/mL、30μg/mL和60μg/mL)处理1小时20分钟，空白对照组加入等体积的DMSO，然后用37℃预温的1×PBS清洗细胞两遍，加入不含或含胰岛素(终浓度为100nM)的0.5％BSA的Krebs缓冲液(NaCl 140mM，KCl 5mM，MgSO₄2.5mM，CaCl₂ 1mM，HEPES 20mM，pH7.4)，37℃阵育40分钟后，加入2-[1,2-3H(N)]-脱氧-D-葡萄糖溶液(终浓度为0.5μCi/ml)，37℃作用10分钟，用冰浴的1×PBS洗3遍终止反应，之后加入0.15mL 0.1％Triton裂解细胞，液闪计数，用蛋白量校正CPM值后计算L6细胞的葡萄糖摄取量。

结果见图3和图4，各测试物均能提高葡萄糖摄取水平，其中竹黄乙酸乙酯萃取物以10μg/mL、30μg/mL、60μg/mL，竹黄菌甲素、竹黄菌乙素、竹黄菌丙素以10μM剂量对L6细胞作用2小时后，其基础水平和胰岛素刺激下的葡萄糖摄取均增加明显。数据以平均值±标准误(X±SE)表示(n＝3)。*P＜0.05，**P＜0.01与相应条件下空白对照组比较。

实验二、竹黄乙酸乙酯萃取物以及该部位主要化合物对GLUT4上膜的影响

研究表明，IRAP(胰岛素调节的氨肽酶)和GLUT4(葡萄糖转运蛋白4)具有共存的关系，因此观察IRAP的转运能够直接反应GLUT4的运动。

将稳定表达IRAP的L6(L6 IRAP-mOrange)细胞接种于6cm的培养皿中，加入含10％胎牛血清的MEM-α培养基，37℃、5％CO₂细胞培养箱培养。

实验开始前，将L6 IRAP-mOrange接种于玻璃片上，待细胞密度达到100％时，弃培养基，加入无血清培养基饥饿2小时，PBS洗三次。加入各测试物溶液(竹红菌甲素、竹红菌乙素、竹红菌丙素以10μM给药，胰岛素作为阳性对照给药浓度为100nM，竹黄乙酸乙酯萃取物30μg/ml给药)，用激光扫描共聚焦显微镜来监测加入药物后IRAP-mOrange转运的动态变化，观察细胞内荧光强度变化，以此来反应GLUT4上膜情况。

结果见图5，各测试物均能有效提高细胞GLUT4上膜水平，竹黄乙酸乙酯萃取物以30μg/ml给药，竹红菌甲素、竹红菌乙素、竹红菌丙素以10μM给药。由图中可见，在20min时候，膜上荧光水平最高(图5中A)，以此反映GLUT4上膜此时达到最大值，对荧光水平进行统计处理，数据以平均值±标准误(X±SE)表示(n＝4)(图5中B)，竹黄乙酸乙酯萃取物，竹红菌甲素，竹红菌乙素，竹红菌丙素均能显著提高GLUT4上膜率，**P<0.01，***P<0.001与对照组比较。

实验三、SB-EtOAc、竹红菌甲素、竹红菌乙素、竹红菌丙素促进GLUT4转运上膜机制研究

胰岛素信号通路和AMPK(一磷酸腺苷激活蛋白激酶)信号通路是调节葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)转位和葡萄糖摄取的两条主要信号通路，Compound C是AMPK磷酸化抑制剂，按照实验二测试方法，选用L6IRAP-mOrange细胞，给药前加入Compound C孵育细胞30min后再加入各测试药物，观察膜上荧光变化，间接反映GLUT4上膜情况。

结果见图6，实验结果显示，在加入Compound C孵育30min，各测试药品给药之后，细胞膜上IRAP的荧光强度降低，也就反映GLUT4上膜率下降，而没有加Compound C的IRAP荧光水平显著上升。加入Compound C和不加Compound C荧光强度存在显著差异，**P<0.01，***<0.001。由此我们可以判断，测试化合物是通过AMPK信号通路促进GLUT4上膜，从而增加葡萄糖摄取。

实验四、化合物竹红菌甲素、竹红菌乙素、竹红菌丙素对一磷酸腺苷激活蛋白激酶(AMPK)活性的影响

L6大鼠骨骼肌完全分化为肌管后，竹红菌甲素、竹红菌乙素、竹红菌丙素以10μM给药，阴性对照组Compound C以10μM给药，2mM 5-氨基-4咪唑甲酰胺核苷酸(AIC)作为阳性对照，正常组加入DMSO作为对照。孵育60min，加入细胞裂解液提取细胞总蛋白，利用相应的抗体检测总蛋白中p-AMPK、AMPK的含量，β-Actin作为内参蛋白控制上样量。

结果见图7，实验结果显示，竹红菌甲素、竹红菌乙素、竹红菌丙素均能增加p-AMPK蛋白的表达。

实验五、测试竹黄乙酸乙酯萃取物对糖尿病小鼠的降糖作用。

1.材料与仪器

1.1实验动物

KK-Ay小鼠，SPF级，9～11周龄，雌雄各半；C57BL/6J小鼠，SPF级，9～11周龄，雌雄各半，均由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，许可证编号:SCXK(京)2009-0004。鼠料均经60℃灭菌，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，C57小鼠维持饲料，KK-Ay小鼠喂KK鼠料(高脂饲料)，许可证编号:SCXK(京)2009-0008。

本研究所选择的KK-Ay小鼠是一种多基因自发性遗传动物模型，是在KK小鼠的基础上转入突变毛色基因(Ay)而成，Ay基因不仅影响小鼠的毛色而且可引起代谢紊乱，出现高血糖、高胰岛素血症、胰岛素抵抗、肥胖、脂质代谢紊乱等病理特征，是理想的自发性胰岛素抵抗糖尿病动物模型和自发性遗传肥胖动物模型。C57BL/6J与KK-Ay小鼠具有基因同源性作为正常对照组。

1.2药品与试剂

竹黄乙酸乙酯萃取物(竹黄购于安徽省亳州药材市场，经中南民族大学药学院万定荣教授鉴定为药用真菌竹黄Shiraia bambusicola P.Henn)，胰岛素放射免疫试剂盒(天津九鼎医学生物工程有限公司)，葡萄糖(国药集团化学试剂有限公司，批号：20130328)，盐酸二甲双胍片(阳性药物，中美上海施贵宝制药有限公司；批号：1312107)

1.3实验仪器

血糖仪(三诺安稳血糖仪)、血糖试纸(三诺安稳血糖试纸)、分析天平CP214(奥豪斯仪器上海有限公司)、ALLEG RAX-22R高速冷冻离心机(美国贝克曼库尔特公司)、全自动生化分析仪(日立7180+ISE)。

2.实验方法

2.1待测样品的制备

参照一、竹黄乙酸乙酯萃取物制备方法获得待测样品，用于下述实验。

2.2实验模型的建立

10只C57BL/6J小鼠作为正常对照组。50只KK-Ay小鼠高脂饲料喂养一周，诱导小鼠产生高血糖，尾部取血测定小鼠的空腹血糖浓度，血糖浓度大于11mol/L为合格模型小鼠，可用于下一步实验。按空腹血糖值随机分为模型对照组、阳性对照组(盐酸二甲双胍片200mg/kg)和竹黄乙酸乙酯萃取物三个剂量组(30mg/kg、60mg/kg、120mg/kg)5组，每组10只。各组采用等体积不等浓度灌胃给药(正常对照组和模型对照组给予等体积生理盐水)，每日定时给药一次，灌胃体积均为0.2mL/10g，连续灌胃三周。

2.3实验数据采集

分别于给药前、给药后、给药第7d、15d和21d于尾静脉取血测定小鼠血糖值。小鼠体重分别于给药前、给药后、给药间隔每两天测定一次。末次给药后小鼠禁食12小时，测定小鼠血糖浓度作为0h的血糖值，以2.0g/kg灌胃葡萄糖，分别测定0.5h、1h、1.5h、2h的小鼠血糖含量，观察各组小鼠血糖值的变化，比较各组之间是否存在差异。

血糖指标测定结束后采用摘取眼球取血，以转速3000rpm离心15min分离血清。使用全自动生化分析仪分别测定小鼠血清中TG、TC的含量；用放射免疫法测定血清胰岛素含量。

给药结束后小鼠肝脏、肌肉组织相关蛋白的检测：RIPA裂解液提取总蛋白，AMPK、p-AMPK蛋白采用相应的抗体进行检测，以内参蛋白β-Actin控制上样量。

3.实验结果

数据以平均值±标准误(X±SE)表示，组间显著性差异检验用t检验及相关分析。

3.1对糖尿病小鼠体重的影响

诱导小鼠血糖升高后，模型组体重显著升高，与正常组相比较具有显著性差异(+P＜0.05)。给药一周后，各组小鼠体重均有所下降，模型组体重与正常组比较仍然具有显著性差异，差异程度有所下降，给药组和盐酸二甲双胍组与模型组体重差别并不明显。给药两周后，模型组体重相比正常组体重仍然偏高，且存在显著性差异，给药组和盐酸二甲双胍组体重无明显变化。给药三周后，模型组体重与正常组相比有显著性差异，给药组和盐酸二甲双胍组体重与模型组物明显差别。实验结果见图8。

3.2对糖尿病小鼠空腹血糖的影响

造模成功后，模型组与正常组相比血糖水平明显升高，具有显著性差异(P＜0.01)，给药组血糖比正常组高出很多，低剂量和高剂量组与模型组无显著差异，中剂量实验组血糖水平比模型组要高，且具有显著性差异。给药一周后，阳性组与给药组血糖水平均有所下降，相比模型组，给药组血糖水平具有显著性差异。给药二周后，给药组血糖水平持续下降。给药三周后，实验组与阳性药组小鼠空腹血糖水平差异明显，给药组与模型组相比血糖水平具有显著性差异(*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001)。由此可以看出，竹黄乙酸乙酯萃取物具有显著降低高血糖小鼠的血糖水平的功效。实验结果见图9。

3.3对糖尿病小鼠口服糖耐量的影响

正常组小鼠在口服葡萄糖后的30min血糖含量达到最大值，2h血糖已经基本恢复到给药前水平。模型组在口服葡萄糖30min后血糖值达到最大，此后虽然有所下降但一直保持在较高的水平。给药组和二甲双胍组在口服葡萄糖后30min血糖值达到最高水平，二甲双胍组相比模型组无显著性差异，2h后恢复口服葡萄糖前水平。各给药组血糖水平在30min后均有显著性的下降，2h后基本达到口服葡萄糖前水平，与模型组相比存在显著性的差异，小鼠的口服糖耐量得到显著改善。(*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001)。实验结果见图10。

3.4对糖尿病小鼠血清生化指标的影响

3.4.1对糖尿病小鼠血清胰岛素的影响

正常组小鼠胰岛素处于正常水平，模型组小鼠胰岛素水平比正常组明显高出很多，具有显著性差异(***P＜0.001)，说明模型组小鼠存在胰岛素抵抗(*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001)。阳性药二甲双胍组和给药组胰岛素水平明显比模型组要小的多，存在显著性差异。说明胰岛素抵抗小鼠通过给药后，胰岛素抵抗程度明显降低，胰岛素抵抗得到显著改善。实验结果见图11。

3.4.2对糖尿病小鼠血清总胆固醇(TC)的影响

与正常组比较，模型组小鼠TC水平显著性升高，且存在显著性差异(P＜0.05)，阳性药物盐酸二甲双胍与给药组较模型组TC水平均有一定程度的下降，但无显著性差异存在。说明药物与阳性药二甲双胍具有降低小鼠TC水平的作用。实验结果见图12。

3.4.3对糖尿病小鼠血清甘油三酯(TG)的影响

正常组小鼠血清TG水平处于正常水平，模型组与正常组相比TG水平明显升高，阳性药盐酸二甲双胍组比模型组甘油三酯水平略微降低，给药组的TG水平比模型组降低很多，但是不存在显著性的差异，说明给药后，糖尿病小鼠的血清TG水平能得到降低，该药具有改善糖尿病小鼠TG水平的功效。实验结果见图13。

3.5小鼠肝脏、肌肉相关蛋白检测

通过相应抗体检测小鼠肝脏、肌肉中AMPK、p-AMPK蛋白水平，由图14可以看出，在肌肉和肝脏中，随着给药剂量的不同，低剂量、中剂量、高剂量对p-AMPK蛋白表达的影响不一样，但与模型组比较，均能提高p-AMPK水平，这说明，SB-EtOAc通过AMPK信号通路，提高GLUT4上膜。从而促进小鼠对于葡萄糖的摄取，降低血糖，改善小鼠糖尿病症状。显著性水平，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,+P<0.01。实验结果见图13,14。

4.结论

本实验研究表明，以竹黄乙酸乙酯萃取物进行灌胃给药，对KK-Ay小鼠体重有一定的抑制作用，灌胃给药一周即可降低KK-Ay小鼠血糖水平，在给药期间血糖值持续降低，连续给药三周后，测定小鼠血糖值基本接近正常水平值。口服糖耐量实验中，可观察到在实验过程中，竹黄乙酸乙酯萃取物能够明显降低餐后血糖。胰岛素抵抗是Ⅱ型糖尿病的主要病理特征，它在糖尿病的发生发展过程中起着关键作用，研究表明，高血糖能够诱发胰岛素抵抗，促进糖尿病的发展。血清胰岛素的测定结果表明，给药组KK-Ay小鼠胰岛素水平明显低于模型组，具有显著性差异，表明竹黄乙酸乙酯萃取物可通过降低小鼠血糖水平，改善KK-Ay小鼠胰岛素抵抗的作用。

高血糖往往易引起高血脂症，这是由于糖代谢紊乱而导致酯代谢紊乱引起的，血液中一种或多种脂质成分含量异常升高，改善脂质代谢在一定程度上可以预防或缓解糖尿病的发生。本实验中，竹黄乙酸乙酯萃取物灌胃给药三周后，KK-Ay小鼠的TG、TC水平相比C57BL/6J小鼠均有所降低，说明竹黄乙酸乙酯萃取物在一定程度上可以改善糖尿病引起的脂质代谢紊乱，起到预防或缓解糖尿病的作用。

AMPK是调控细胞和全身能量代谢的重要蛋白。作为细胞能量的调控者，AMPK在糖脂代谢和调控代谢异常(如糖尿病，肥胖和癌症)中都起着重要的作用，因此AMPK是治疗代谢疾病的重要靶标。激活AMPK通路可以增加脂肪酸氧化，抑制脂质合成，也能提高胰岛素的能力。大量研究显示AMPK调控着大量不同的代谢通路，它是安全有效的治疗二型糖尿病和脂代谢异常的靶点。GLUT4是骨骼肌和脂肪组织吸收葡萄糖的限速步骤，而AMPK是GLUT4的主要调控蛋白。

在细胞实验中，我们通过加入Compound C检测了SB-EtOAc、竹红菌甲素、竹红菌乙素、竹红菌丙素的促GLUT4上膜活性，结果显示，当加入Compound C后，这四种测试药物的促GLUT4上膜活性得到抑制，这就提示，这四种药物是通过AMPK通路来促进GLUT4上膜，从而增加细胞对葡萄糖的摄取。

Western blot检测L6细胞，肝脏和骨骼肌相关蛋白也表明，竹黄乙酸乙酯萃取物，竹红菌甲素，竹红菌乙素，竹红菌丙素均能增加p-AMPK蛋白的表达，这就更加验证了上述药物是通过AMPK信号通道来达到增加细胞葡萄糖摄取和降低小鼠血糖水平的功效。

综合细胞实验和动物实验的结果，竹黄乙酸乙酯萃取物以及所含化合物竹红菌甲素、竹红菌乙素、竹红菌丙素具有显著地促进L6骨骼肌细胞葡萄糖摄取的作用，并能通过AMPK信号通路增加GLUT4的上膜率，这就提示竹黄乙酸乙酯萃取物、竹红菌甲素、竹红菌乙素、竹红菌丙素可作为AMPK激动剂和促GLUT4上膜的激动剂，对糖尿病小鼠的降糖活性有可能来自这几种化合物组合的共同作用，对竹黄乙酸乙酯萃取物对KK-Ay小鼠的降糖活性研究，为进一步开发为一种治疗糖尿病的新的药用资源提供了研究基础。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (6)

1.一种防治糖尿病的药物，其特征在于，有效成分包括竹红菌甲素、竹红菌乙素、竹红菌丙素、hypomycinA、麦角甾醇和麦角甾醇过氧化物中的一种或者几种，或者有效成分包括竹黄乙酸乙酯萃取物。

2.根据权利要求1所述的防治糖尿病的药物，其特征在于，竹红菌甲素、竹红菌乙素和竹红菌丙素中的一种或几种，以及竹黄乙酸乙酯萃取物作为葡萄糖摄取激动剂、葡萄糖转运因子4上膜激动剂和/或一磷酸腺苷激活蛋白激酶激动剂发挥作用。

3.根据权利要求1或2所述的防治糖尿病的药物，其特征在于，竹黄乙酸乙酯萃取物的提取方法如下：

（a）用醇或醇水混合液浸渍或渗滤竹黄粉末，过滤后得到提取液；

（b）将提取液中的溶剂蒸发得到浆状物；

（c）将浆状物加水搅拌，得到混悬液；

（d）用乙酸乙酯对上述的混悬液进行液液萃取，萃取产物蒸发至干，得到竹黄乙酸乙酯萃取物。

4.根据权利要求3所述的防治糖尿病的药物，其特征在于，步骤（a）中的醇为乙醇。

5.根据权利要求1～4任一所述的防治糖尿病的药物，其特征在于，所述糖尿病为Ⅱ型糖尿病。

6.权利要求1～5所述的防治糖尿病的药物在制备辅助治疗糖尿病保健食品中的应用。