CN105010145B - 一种金线莲种苗的扩繁方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种金线莲种苗的扩繁方法，其包括外植体的培养和接种、通过摇床进行高效率扩繁、固体培养基内生长培养、固体培养基内生根培养和炼苗及种植步骤。本发明采用MS大量元素和MS微量元素作用于培养物的矿物营养；糖作为植物细胞的碳源，提供建成纤维素的来源，同时对培养基形成一定的渗透压，以便培养物启动生长；6‑BA作为细胞分裂素，促进植株分裂出新的芽；NAA作为诱导素与6‑BA搭配使用；KT作为激动素，防止植株玻璃化。本发明的扩繁方法步骤简单，生产周期与传统工艺相比大幅减短，成本也降低，对环境友好，无污染，适合工业化生产，既能大幅度提高金线莲的种苗培育效率，又可提高整个市场金线莲产品的质量。
Description
技术领域
本发明涉及一种金线莲种苗的扩繁方法，属于金线莲种苗高效扩繁育苗技术领域。
背景技术
金线莲(Anoecthilus roxburghii)为兰科开唇兰属多年生草本植物，别名为金线兰、金丝草、树草莲、金线虎头蕉等。通常生长在荫蔽阔叶林下的肥沃腐叶土中，是我国传统的珍贵药材，有清凉解毒、滋阴降火、消炎止痛的功效，且无毒副作用，在民间素有“药王”的美誉。金线莲株高8～20cm，株型小巧，叶型优美，叶脉金黄色、呈网状排列，又是观赏价值极高的室内观叶珍品。随着信息社会的日益发达，金线莲的功效被越来越多的医学家们的认可和推崇。但是金线莲种子微小，胚发育不完全，在自然条件下极难出芽，对生长环境的要求极为苛刻，生长缓慢，天然产量极低。若以分根或扦插繁殖，则耗时长且繁殖系数低，而且金线莲赖以生存的自然环境发生变化，野生资源锐减，加之长期采挖，种质资源稀缺，已濒临灭绝，已不能满足临床需求。目前福建台湾等地虽有一批专业种植户涌现，但是其栽培种植工艺保守，导致金线莲培育效率低下，产量无法满足国内需求。目前在江浙地带，金线莲的需求量日益增长，巨大的市场需求无法得到满足，在利益驱动下，产生了一些非正常的金线莲育苗手段，导致金线莲产品更加良莠不齐。
应用植物组培快繁方法在一定程度上解决了金线莲种苗短缺的现象，有关金线莲的快速繁殖技术国内多有报道。但是现有的应用植物组培的方法生产金线莲种苗，消耗大量的人力、物力，生产成本居高不下，且培养周期长，种苗质量不高，仍不能满足药农的需求。另外在中国专利文献CN101213942A中披露了一种药用金线莲组织培养一步成苗快速繁殖方法，但是培养时间过长，效率低下。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的不足，提供一种金线莲种苗的扩繁方法，该扩繁方法步骤简单，生产周期与传统工艺相比大幅减短，成本也降低，对环境友好，适合工业化生产，既能够大幅度提高金线莲的种苗培育效率，又可以提高整个市场金线莲产品的质量。
按照本发明提供的技术方案：一种金线莲种苗的扩繁方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)外植体的培养和接种：挑选高度为7～10cm、带有4～6片叶、具有3～4节间的成年金线莲原种植株，在至少连续三个太阳照射之后的晴天，采集整株植株作为外植体，先用碱性清洁剂清洗，再用清水反复冲洗至无泡沫为止；然后将外植体灭菌，灭菌后无菌切去叶片、顶芽和根须，切1～2节间为一段，接种到J1固体培养基中，进行诱导休眠芽生长，诱导培养条件为：光照强度3000～5000Lx，光照时间16～18小时/天，温度22～28℃，培养时间35～45天；休眠芽诱导成功后，挑选强壮的植株作为扩繁种苗；
(2)通过摇床进行高效率扩繁：将扩繁种苗移入到J2液体培养基中，放置于摇床上进行第一次继代培养，第一次继代培养条件为：摇床光照强度3000～5000Lx，温度22～28℃，摇动频率95次/分钟，培养时间20天；第一次继代培养获得扩繁比率为1：(20～30)的胚芽体，然后将胚芽体切分为2～3个主苗，发芽较多的主苗留在摇床上用新的J2液体培养基继续培育新芽，进行第二次的继代培养，其余主苗移入J1固体培养基作种植前期培养；
(3)固体培养基内生长培养：移入J1固体培养基中的主苗作种植前期培养，培养条件为：光照强度3000～5000Lx，光照时间16～18小时/天，温度22～28℃；每35天继代培养1次，每次继代培养时都有一部分主苗长成3～5cm高的成熟种苗，成熟种苗移入J3固体培养基作生根培养；其余主苗继续在J1固体培养基中进行生长培养；
(4)固体培养基内生根培养：移入J3固体培养基中的成熟种苗作生根培养，培养条件与步骤3中生长培养条件相同或直接连瓶移入种植大棚苗床上培养，培养35～45天即可见生出大量根须，此时便可开始炼苗；
(5)炼苗及种植：将生出大量根须的成熟种苗放置于种植大棚苗床上，每天打开瓶盖1～2次，过10～15天后取出，将培养基洗净，即可进行种植。
作为本发明的进一步改进，所述步骤(1)中外植体灭菌的方法为：在超净工作台范围内，先将冲洗干净的外植体泡在50％(w/v)乙醇溶液中浸润5秒，然后迅速捞出，放在0.1％(w/v)升汞溶液中浸泡12分钟，最后用无菌水冲洗至少3遍后，控干水分。
作为本发明的进一步改进，所述步骤(1)和(3)中J1固体培养基的组成及含量为：1/2MS大量元素，全量MS铁盐，全量MS微量元素，全量MS有机类常规，6-苄氨基嘌呤4mg/L，6-糠氨基嘌呤0.2mg/L，蔗糖25g/L，麦芽糖5g/L，琼脂粉3g/L，PH值5.8，常规灭菌。
作为本发明的进一步改进，所述步骤(2)中J2液体培养基的组成及含量为：1/2MS大量元素，全量MS铁盐，全量MS微量元素，全量MS有机类常规，6-苄氨基嘌呤4mg/L，6-糠氨基嘌呤0.2mg/L，蔗糖25g/L，麦芽糖5g/L，PH值5.8，常规灭菌。
作为本发明的进一步改进，所述步骤(4)中J3固体培养基的组成及含量为：1/2MS大量元素，全量MS铁盐，全量MS微量元素，全量MS有机类常规，萘乙酸5mg/L，6-苄氨基嘌呤2.5mg/L，6-糠氨基嘌呤0.2mg/L，蔗糖25g/L，麦芽糖5g/L，琼脂4g/L，PH值5.8，常规灭菌。
作为本发明的进一步改进，所述步骤(1)中的碱性清洁剂包括洗衣粉。
本发明中，所述的1/2MS大量元素是指该培养基中的MS大量元素用量是全量MS大量元素的1/2量，全量MS大量元素的成分见表1。
表1：全量MS大量元素组成及含量
| 中文名称 | 化学式 | 用量 |
| 硫酸镁 | MgSO4·7H2O | 370mg/L |
| 硝酸钾 | KNO3 | 1900mg/L |
| 硝酸铵 | NH4NO3 | 16～1850mg/L |
| 磷酸二氢钾 | KH2PO4 | 170mg/L |
| 氯化钙 | CaCL2·2H2O | 440mg/L |
本发明中，所述的全量MS铁盐的成分见表2。
表2：全量MS铁盐组成及含量
| 中文名称 | 化学式 | 用量 |
| 硫酸亚铁 | FeSO4·7H2O | 27.8mg/L |
| 乙二胺四乙酸二钠盐 | Na2-EDTA | 37.3mg/L |
本发明中，所述的全量MS微量元素的成分见表3。
表3：全量MS微量元素组成及含量
| 中文名称 | 化学式 | 用量 |
| 碘化钾 | KI | 0.83mg/L |
| 硼酸 | H3BO3 | 6.2mg/L |
| 硫酸锌 | ZnSO4·7H2O | 8.6mg/L |
| 硫酸锰 | MnSO4·H2O | 22.3mg/L |
| 钼酸钠 | Na2MoO4·2H2O | 0.25mg/L |
| 硫酸铜 | CuSO4·5H2O | 0.025mg/L |
| 氯化钴 | C0Cl2·6H2O | 0.025mg/L |
本发明中，所述的全量MS有机类常规的成分见表4。
表4：全量MS有机类常规组成及含量
| 名称 | 用量 |
| VB1 | 0.5mg/L |
| VB6 | 0.5mg/L |
| 烟酸 | 0.5mg/L |
| 甘氨酸 | 2mg/L |
| 肌醇 | 100mg/L |
本发明与现有技术相比，具有如下优点：
(1)本发明采用MS大量元素和MS微量元素作用于培养物的矿物营养；糖作为植物细胞的碳源，提供建成纤维素的来源，同时对培养基形成一定的渗透压，以便培养物启动生长；6-苄氨基嘌呤(6-BA)作为细胞分裂素，促进植株分裂出新的芽；萘乙酸(NAA)作为诱导素与6-苄氨基嘌呤搭配使用；6-糠氨基嘌呤(KT)作为激动素，防止植株玻璃化。
(2)本发明的扩繁方法步骤简单，生产周期与传统工艺相比大幅减短，成本也降低，对环境友好，无污染，适合工业化生产，既能够大幅度提高金线莲的种苗培育效率(扩繁效率可以达到传统方法的3～5倍以上)，在一定程度上解决了金线莲种苗资源短缺的问题，又可以提高整个市场金线莲产品的质量。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐明本发明的实施过程。
实施例1
金线莲种苗的扩繁方法，按以下步骤进行：
(1)外植体的培养和接种：
(1.1)外植体采集及清洗：挑选高度为7～10cm、带有4～6片叶、具有3～4节间的成年金线莲原种植株，在连续三个太阳照射之后的晴天，采集整株植株作为外植体，先将外植体放在1000ml的烧杯里，放入少量洗衣粉进行清洗，然后再用清水反复冲洗至无泡沫为止；
(1.2)外植体灭菌：准备50％(w/v)乙醇溶液，0.1％(w/v)升汞溶液和无菌水，在超净工作台范围内，先将冲洗干净的外植体泡在50％(w/v)乙醇溶液中浸润5秒，然后迅速捞出，放在0.1％(w/v)升汞溶液中浸泡12分钟，最后在无菌的容器中用无菌水反复冲洗3遍后，控干水分，灭菌完成；
(1.3)配制J1液体培养基：取1/2MS大量元素，全量MS铁盐，全量MS微量元素，全量MS有机类常规，6-苄氨基嘌呤4mg/L，6-糠氨基嘌呤0.2mg/L，蔗糖25g/L，麦芽糖5g/L，琼脂粉3g/L，配比后放入搪瓷锅加热，不断搅拌至糖和淀粉完全溶解，再继续沸腾5分钟后，调PH值5.8；然后将J1液体培养基分装到事先灭菌好的240ml玻璃组培瓶中，每瓶约50ml左右，进行常规的高温高压灭菌；
(1.4)外植体接种：将灭菌好的外植体置于接种盘中，无菌切去叶片、顶芽和根须，切1～2节间为一段，按每瓶1～2段接种到J1固体培养基中，进行诱导休眠芽生长，诱导培养条件为：光照强度3000Lx，光照时间18小时/天，温度28℃，培养时间35天；休眠芽诱导成功后，挑选强壮的植株作为扩繁种苗；
(2)通过摇床进行高效率扩繁：
(2.1)配制J2液体培养基：取1/2MS大量元素，全量MS铁盐，全量MS微量元素，全量MS有机类常规，6-苄氨基嘌呤4mg/L，6-糠氨基嘌呤0.2mg/L，蔗糖25g/L，麦芽糖5g/L，配比后放入搪瓷锅加热，不断搅拌至糖和淀粉完全溶解，再继续沸腾5分钟后，调PH值5.8；然后将J2液体培养基分装到事先灭菌好的150ml三角瓶中，每瓶75ml，进行常规的高温高压灭菌；
(2.2)第一次继代培养：将扩繁种苗移入到J2液体培养基中，每瓶3～4个点，放置于摇床上进行第一次继代培养，第一次继代培养条件为：摇床光照强度3000Lx，温度28℃，摇动频率95次/分钟，培养时间20天；可见原金线莲扩繁种苗多处冒芽，第一次继代培养获得扩繁比率为1：20的胚芽体；
(2.3)第二次继代培养：将胚芽体切分为2～3个主苗，发芽较多的主苗留在摇床上用新的J2液体培养基继续培育新芽，进行第二次的继代培养，第二次继代培养时，原胚芽体切分后，依旧按照每瓶3～4个点接种，一般是按照1：3的速率扩大群体；其余主苗移入J1固体培养基作种植前期培养；
(3)固体培养基内生长培养：
采用步骤(1.3)配制的J1固体培养基，步骤(2.3)切分出的主苗按每瓶接种3～5个点移入J1固体培养基中，作种植前期培养，培养条件为：光照强度3000Lx，光照时间18小时/天，温度28℃；每35天继代培养1次，每次继代培养时都有一部分主苗长成3～5cm高的成熟种苗，成熟种苗移入J3固体培养基作生根培养；其余主苗继续在J1固体培养基中进行生长培养；
(4)固体培养基内生根培养：
(4.1)取1/2MS大量元素，全量MS铁盐，全量MS微量元素，全量MS有机类常规，萘乙酸5mg/L，6-苄氨基嘌呤2.5mg/L，6-糠氨基嘌呤0.2mg/L，蔗糖25g/L，麦芽糖5g/L，琼脂4g/L，配比后放入搪瓷锅加热，不断搅拌至糖和淀粉完全溶解，再继续沸腾5分钟后，调PH值5.8；然后将J3固体培养基分装到事先灭菌好的240ml玻璃组培瓶中，每瓶50ml，进行常规的高温高压灭菌；
(4.2)种苗的生根培养：将步骤(3)分离出的成熟种苗按照每瓶3～5个点移入到J3固体培养基中，作生根培养，培养条件为：光照强度3000Lx，光照时间18小时/天，温度28℃；与步骤3中生长培养条件相同或直接连瓶移入种植大棚苗床上培养，培养35天即见生出大量根须，此时便可开始炼苗；
(5)炼苗及种植：
(5.1)炼苗：将步骤(4.2)中生出大量根须的成熟种苗连瓶放置于种植大棚中，每天打开瓶盖1～2次，15天后取出，将培养基洗净，即可进行种植；在炼苗过程中，瓶中会逐步产生霉菌，但只要不影响植株健康，就没有关系；
(5.2)种植：将已炼过的种苗移植入苗床，移植时注意保护根须，浅栽轻压，最后浇定植水。
经实际测算，最终成活率达到了98％。
实施例2
金线莲种苗的扩繁方法，按以下步骤进行：
(1)外植体的培养和接种：
(1.1)外植体采集及清洗：挑选高度为7～10cm、带有4～6片叶、具有3～4节间的成年金线莲原种植株，在连续三个太阳照射之后的晴天，采集整株植株作为外植体，先将外植体放在1000ml的烧杯里，放入少量洗衣粉进行清洗，然后再用清水反复冲洗至无泡沫为止；
(1.2)外植体灭菌：准备50％(w/v)乙醇溶液，0.1％(w/v)升汞溶液和无菌水，在超净工作台范围内，先将冲洗干净的外植体泡在50％(w/v)乙醇溶液中浸润5秒，然后迅速捞出，放在0.1％(w/v)升汞溶液中浸泡12分钟，最后在无菌的容器中用无菌水反复冲洗3遍后，控干水分，灭菌完成；
(1.3)配制J1液体培养基：取1/2MS大量元素，全量MS铁盐，全量MS微量元素，全量MS有机类常规，6-苄氨基嘌呤4mg/L，6-糠氨基嘌呤0.2mg/L，蔗糖25g/L，麦芽糖5g/L，琼脂粉3g/L，配比后放入搪瓷锅加热，不断搅拌至糖和淀粉完全溶解，再继续沸腾5分钟后，调PH值5.8；然后将J1液体培养基分装到事先灭菌好的240ml玻璃组培瓶中，每瓶约50ml左右，进行常规的高温高压灭菌；
(1.4)外植体接种：将灭菌好的外植体置于接种盘中，无菌切去叶片、顶芽和根须，切1～2节间为一段，按每瓶1～2段接种到J1固体培养基中，进行诱导休眠芽生长，诱导培养条件为：光照强度4000Lx，光照时间17小时/天，温度25℃，培养时间40天；休眠芽诱导成功后，挑选强壮的植株作为扩繁种苗；
(2)通过摇床进行高效率扩繁：
(2.1)配制J2液体培养基：取1/2MS大量元素，全量MS铁盐，全量MS微量元素，全量MS有机类常规，6-苄氨基嘌呤4mg/L，6-糠氨基嘌呤0.2mg/L，蔗糖25g/L，麦芽糖5g/L，配比后放入搪瓷锅加热，不断搅拌至糖和淀粉完全溶解，再继续沸腾5分钟后，调PH值5.8；然后将J2液体培养基分装到事先灭菌好的150ml三角瓶中，每瓶75ml，进行常规的高温高压灭菌；
(2.2)第一次继代培养：将扩繁种苗移入到J2液体培养基中，每瓶3～4个点，放置于摇床上进行第一次继代培养，第一次继代培养条件为：摇床光照强度4000Lx，温度25℃，摇动频率95次/分钟，培养时间20天；可见原金线莲扩繁种苗多处冒芽，第一次继代培养获得扩繁比率为1：20的胚芽体；
(2.3)第二次继代培养：将胚芽体切分为2～3个主苗，发芽较多的主苗留在摇床上用新的J2液体培养基继续培育新芽，进行第二次的继代培养，第二次继代培养时，原胚芽体切分后，依旧按照每瓶3～4个点接种，一般是按照1：3的速率扩大群体；其余主苗移入J1固体培养基作种植前期培养；
(3)固体培养基内生长培养：
采用步骤(1.3)配制的J1固体培养基，步骤(2.3)切分出的主苗按每瓶接种3～5个点移入J1固体培养基中，作种植前期培养，培养条件为：光照强度4000Lx，光照时间17小时/天，温度25℃；每35天继代培养1次，每次继代培养时都有一部分主苗长成3～5cm高的成熟种苗，成熟种苗移入J3固体培养基作生根培养；其余主苗继续在J1固体培养基中进行生长培养；
(4)固体培养基内生根培养：
(4.1)取1/2MS大量元素，全量MS铁盐，全量MS微量元素，全量MS有机类常规，萘乙酸5mg/L，6-苄氨基嘌呤2.5mg/L，6-糠氨基嘌呤0.2mg/L，蔗糖25g/L，麦芽糖5g/L，琼脂4g/L，配比后放入搪瓷锅加热，不断搅拌至糖和淀粉完全溶解，再继续沸腾5分钟后，调PH值5.8；然后将J3固体培养基分装到事先灭菌好的240ml玻璃组培瓶中，每瓶50ml，进行常规的高温高压灭菌；
(4.2)种苗的生根培养：将步骤(3)分离出的成熟种苗按照每瓶3～5个点移入到J3固体培养基中，作生根培养，培养条件为：光照强度4000Lx，光照时间17小时/天，温度25℃；与步骤3中生长培养条件相同或直接连瓶移入种植大棚苗床上培养，培养35天即见生出大量根须，此时便可开始炼苗；
(5)炼苗及种植：
(5.1)炼苗：将步骤(4.2)中生出大量根须的成熟种苗连瓶放置于种植大棚中，每天打开瓶盖1～2次，15天后取出，将培养基洗净，即可进行种植；在炼苗过程中，瓶中会逐步产生霉菌，但只要不影响植株健康，就没有关系；
(5.2)种植：将已炼过的种苗移植入苗床，移植时注意保护根须，浅栽轻压，最后浇定植水。
经实际测算，最终成活率达到了99％。
实施例2
金线莲种苗的扩繁方法，按以下步骤进行：
(1)外植体的培养和接种：
(1.1)外植体采集及清洗：挑选高度为7～10cm、带有4～6片叶、具有3～4节间的成年金线莲原种植株，在连续三个太阳照射之后的晴天，采集整株植株作为外植体，先将外植体放在1000ml的烧杯里，放入少量洗衣粉进行清洗，然后再用清水反复冲洗至无泡沫为止；
(1.2)外植体灭菌：准备50％(w/v)乙醇溶液，0.1％(w/v)升汞溶液和无菌水，在超净工作台范围内，先将冲洗干净的外植体泡在50％(w/v)乙醇溶液中浸润5秒，然后迅速捞出，放在0.1％(w/v)升汞溶液中浸泡12分钟，最后在无菌的容器中用无菌水反复冲洗3遍后，控干水分，灭菌完成；
(1.3)配制J1液体培养基：取1/2MS大量元素，全量MS铁盐，全量MS微量元素，全量MS有机类常规，6-苄氨基嘌呤4mg/L，6-糠氨基嘌呤0.2mg/L，蔗糖25g/L，麦芽糖5g/L，琼脂粉3g/L，配比后放入搪瓷锅加热，不断搅拌至糖和淀粉完全溶解，再继续沸腾5分钟后，调PH值5.8；然后将J1液体培养基分装到事先灭菌好的240ml玻璃组培瓶中，每瓶约50ml左右，进行常规的高温高压灭菌；
(1.4)外植体接种：将灭菌好的外植体置于接种盘中，无菌切去叶片、顶芽和根须，切1～2节间为一段，按每瓶1～2段接种到J1固体培养基中，进行诱导休眠芽生长，诱导培养条件为：光照强度5000Lx，光照时间16小时/天，温度22℃，培养时间45天；休眠芽诱导成功后，挑选强壮的植株作为扩繁种苗；
(2)通过摇床进行高效率扩繁：
(2.1)配制J2液体培养基：取1/2MS大量元素，全量MS铁盐，全量MS微量元素，全量MS有机类常规，6-苄氨基嘌呤4mg/L，6-糠氨基嘌呤0.2mg/L，蔗糖25g/L，麦芽糖5g/L，配比后放入搪瓷锅加热，不断搅拌至糖和淀粉完全溶解，再继续沸腾5分钟后，调PH值5.8；然后将J2液体培养基分装到事先灭菌好的150ml三角瓶中，每瓶75ml，进行常规的高温高压灭菌；
(2.2)第一次继代培养：将扩繁种苗移入到J2液体培养基中，每瓶3～4个点，放置于摇床上进行第一次继代培养，第一次继代培养条件为：摇床光照强度5000Lx，温度22℃，摇动频率95次/分钟，培养时间20天；可见原金线莲扩繁种苗多处冒芽，第一次继代培养获得扩繁比率为1：20的胚芽体；
(2.3)第二次继代培养：将胚芽体切分为2～3个主苗，发芽较多的主苗留在摇床上用新的J2液体培养基继续培育新芽，进行第二次的继代培养，第二次继代培养时，原胚芽体切分后，依旧按照每瓶3～4个点接种，一般是按照1：3的速率扩大群体；其余主苗移入J1固体培养基作种植前期培养；
(3)固体培养基内生长培养：
采用步骤(1.3)配制的J1固体培养基，步骤(2.3)切分出的主苗按每瓶接种3～5个点移入J1固体培养基中，作种植前期培养，培养条件为：光照强度5000Lx，光照时间16小时/天，温度22℃；每35天继代培养1次，每次继代培养时都有一部分主苗长成3～5cm高的成熟种苗，成熟种苗移入J3固体培养基作生根培养；其余主苗继续在J1固体培养基中进行生长培养；
(4)固体培养基内生根培养：
(4.1)取1/2MS大量元素，全量MS铁盐，全量MS微量元素，全量MS有机类常规，萘乙酸5mg/L，6-苄氨基嘌呤2.5mg/L，6-糠氨基嘌呤0.2mg/L，蔗糖25g/L，麦芽糖5g/L，琼脂4g/L，配比后放入搪瓷锅加热，不断搅拌至糖和淀粉完全溶解，再继续沸腾5分钟后，调PH值5.8；然后将J3固体培养基分装到事先灭菌好的240ml玻璃组培瓶中，每瓶50ml，进行常规的高温高压灭菌；
(4.2)种苗的生根培养：将步骤(3)分离出的成熟种苗按照每瓶3～5个点移入到J3固体培养基中，作生根培养，培养条件为：光照强度5000Lx，光照时间16小时/天，温度22℃；与步骤3中生长培养条件相同或直接连瓶移入种植大棚苗床上培养，培养35天即见生出大量根须，此时便可开始炼苗；
(5)炼苗及种植：
(5.1)炼苗：将步骤(4.2)中生出大量根须的成熟种苗连瓶放置于种植大棚中，每天打开瓶盖1～2次，15天后取出，将培养基洗净，即可进行种植；在炼苗过程中，瓶中会逐步产生霉菌，但只要不影响植株健康，就没有关系；
(5.2)种植：将已炼过的种苗移植入苗床，移植时注意保护根须，浅栽轻压，最后浇定植水。
经实际测算，最终成活率达到了97％。
需要说明的是，上述实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明公开的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (2)
1.一种金线莲种苗的扩繁方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）外植体的培养和接种：挑选高度为7~10cm、带有4~6片叶、具有3~4节间的成年金线莲原种植株，在至少连续三个太阳照射之后的晴天，采集整株植株作为外植体，先用碱性清洁剂清洗，再用清水反复冲洗至无泡沫为止；然后将外植体灭菌，灭菌后无菌切去叶片、顶芽和根须，切1~2节间为一段，接种到J1固体培养基中，进行诱导休眠芽生长，诱导培养条件为：光照强度3000~5000Lx，光照时间16~18小时/天，温度22~28℃，培养时间35~45天；休眠芽诱导成功后，挑选强壮的植株作为扩繁种苗；
（2）通过摇床进行高效率扩繁：将扩繁种苗移入到J2液体培养基中，放置于摇床上进行第一次继代培养，第一次继代培养条件为：摇床光照强度3000~5000Lx，温度22~28℃，摇动频率95次/分钟，培养时间20天；第一次继代培养获得扩繁比率为1：（20~30）的胚芽体，然后将胚芽体切分为2~3个主苗，发芽较多的主苗留在摇床上用新的J2液体培养基继续培育新芽，进行第二次的继代培养，其余主苗移入J1固体培养基作种植前期培养；
（3）固体培养基内生长培养：移入J1固体培养基中的主苗作种植前期培养，培养条件为：光照强度3000~5000Lx，光照时间16~18小时/天，温度22~28℃；每35天继代培养1次，每次继代培养时都有一部分主苗长成3~5cm高的成熟种苗，成熟种苗移入J3固体培养基作生根培养；其余主苗继续在J1固体培养基中进行生长培养；
（4）固体培养基内生根培养：移入J3固体培养基中的成熟种苗作生根培养，培养条件与步骤3中生长培养条件相同或直接连瓶移入种植大棚苗床上培养，培养35~45天即可见生出大量根须，此时便可开始炼苗；
（5）炼苗及种植：将生出大量根须的成熟种苗放置于种植大棚苗床上，每天打开瓶盖1~2次，过10~15天后取出，将培养基洗净，即可进行种植；
所述步骤（1）和（3）中J1固体培养基的组成及含量为：1/2MS大量元素，全量MS铁盐，全量MS微量元素，全量MS有机类常规，6-苄氨基嘌呤4mg/L，6-糠氨基嘌呤0.2mg/L，蔗糖25g/L，麦芽糖5g/L，琼脂粉3g/L，PH值5.8，常规灭菌；
所述步骤（2）中J2液体培养基的组成及含量为：1/2MS大量元素，全量MS铁盐，全量MS微量元素，全量MS有机类常规，6-苄氨基嘌呤4mg/L，6-糠氨基嘌呤0.2mg/L，蔗糖25g/L，麦芽糖5g/L，PH值5.8，常规灭菌；
所述步骤（4）中J3固体培养基的组成及含量为：1/2MS大量元素，全量MS铁盐，全量MS微量元素，全量MS有机类常规，萘乙酸5mg/L，6-苄氨基嘌呤2.5mg/L，6-糠氨基嘌呤0.2mg/L，蔗糖25g/L，麦芽糖5g/L，琼脂4g/L，PH值5.8，常规灭菌。
2.如权利要求1所述的金线莲种苗的扩繁方法，其特征在于：所述步骤（1）中外植体灭菌的方法为：在超净工作台范围内，先将冲洗干净的外植体泡在50%（w/v）乙醇溶液中浸润5秒，然后迅速捞出，放在0.1%（w/v）升汞溶液中浸泡12分钟，最后用无菌水冲洗至少3遍后，控干水分。
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