CN105002141A - 细胞外酸性环境在延迟中性粒细胞凋亡中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及细胞外酸性环境在延迟中性粒细胞凋亡中的应用，细胞外酸性环境通过抑制细胞内活性氧的产生，降低了细胞内球状肌动蛋白的谷胱甘肽化水平和促进纤维状肌动蛋白的形成，进而激活Akt信号通路，引起细胞凋亡的延迟。本发明揭示了微环境酸碱度在免疫调节中的重要地位，所揭示的调控人中性粒细胞生物学特性的新路径和新靶点将为今后临床上设计新的输血医学储存和中性粒细胞的输注方案、炎性相关疾病和肿瘤的治疗方案提供新的思路和策略。

Description

细胞外酸性环境在延迟中性粒细胞凋亡中的应用

技术领域：

本发明属于药物靶点技术领域，主要涉及调控人中性粒细胞生物学特性的新路径和新靶点在临床上的应用。

背景技术

中性粒细胞来源于骨髓造血干细胞，是构成机体抵御外源病原体入侵的最前沿，在机体天然免疫中扮演着重要的角色。中性粒细胞是血液循环中含量最丰富的一类白细胞，与淋巴细胞等其它白细胞不同，中性粒细胞具有很多独特的特性。首先，中性粒细胞寿命短。在血液循环中的中性粒细胞的半衰期只有8-20小时，衰老的中性粒细胞能够组成型的自发凋亡，这种凋亡受到细胞内外各种因素的调控，具有可塑性。其次，中性粒细胞具有趋化性，能沿着趋化剂的浓度梯度由低向高迁移。再者，中性粒细胞具有强大的杀菌功能，并且，中性粒细胞输注在30年前就已存在，并且被证明对感染的患者有效，但这是一把双刃剑，即中性粒细胞在杀菌过程中也会因旁观者效应导致局部组织损伤和一些炎症迁延不愈。因此，基于中性粒细胞上述特性，寻找和建立一种方法可靠、操作方便的技术路径来调控中性粒细胞的一些特性，趋利避害，是当前天然免疫学的一个重要课题。

谷胱甘肽化修饰与磷酸化，甲酰化，泛素化修饰相似，是一种蛋白翻译后修饰方式。在肌动蛋白中主要发生在球型肌动蛋白374位的半胱氨酸残基上。肌动蛋白的谷胱甘肽化对调节球型肌动蛋白聚合成纤维状肌动蛋白有重要意义。发生谷胱甘肽化修饰的球型肌动蛋白将不能正常聚合为纤维状肌动蛋白。而肌动蛋白的聚合程度又进一步影响着细胞的功能。因此肌动蛋白的谷胱甘肽化对细胞的功能的调节具有重要意义。

发明内容

本发明的第一个目的是在于公开了细胞外酸性环境对中性粒细胞肌动蛋白的谷胱甘肽化水平的影响。

本发明的另一个目的在于公开了细胞外酸性环境对中性粒细胞自发凋亡及各项功能的影响，为炎性疾病的治疗提供了新的思路和策略。

本发明采用的技术方案为：

本发明提供了细胞外酸性环境在降低中性粒细胞内肌动蛋白的谷胱甘肽化水平中的应用。

具体地，该应用中，细胞外酸性环境通过抑制细胞内活性氧的产生，进而降低了细胞内肌动蛋白的谷胱甘肽化水平。

优选地，所述的细胞外酸性环境是指：控制细胞外环境的pH值为：6.0≤pH值<7.0。更优选地，pH值为6.0-6.5。

具体地，本发明还提供了一种降低中性粒细胞肌动蛋白的谷胱甘肽化水平的方法，该方法包括如下步骤：

选用RPMI 1640培养基加10％(体积)胎牛血清，调节pH值为：6.0≤pH值<7.0(用盐酸或碳酸或乳酸进行调节)，0.22μm滤器滤菌，用该培养基对中性粒细胞进行体外培养4小时。

更优选地，所述pH值为6.0-6.5。

所述的中性粒细胞指的是：人外周血来源的中性粒细胞或小鼠骨髓来源的中性粒细胞。

本发明还提供了细胞外酸性环境在延迟中性粒细胞凋亡中的应用。

具体地，该应用中，细胞外酸性环境通过抑制细胞内活性氧的产生，降低了细胞内球状肌动蛋白的谷胱甘肽化水平和促进纤维状肌动蛋白的形成，进而激活Akt信号通路，引起细胞凋亡的延迟。

优选地，所述的细胞外酸性环境是指：控制细胞外环境的pH值为：6.0≤pH值<7.0。更优选地，pH值为6.0-6.5。

具体地，本发明还提供了一种中性粒细胞体外保存方法，该方法包括如下步骤：选用RPMI 1640培养基加10％(体积)胎牛血清，调节pH值为：6.0≤pH值<7.0(盐酸或碳酸或乳酸进行调节)，0.22μm滤器滤菌，用该培养基对中性粒细胞进行体外培养。

更优选地，所述pH值为6.0-6.5。

所述的中性粒细胞指的是：人外周血来源的中性粒细胞或小鼠骨髓来源的中性粒细胞。

本发明所具有的有益效果：

本发明系统检测了细胞外酸性环境对中性粒细胞自发凋亡及各项功能的影响，探究了酸性环境影响中性粒细胞凋亡和功能的分子机制，初步阐明了细胞外酸性环境通过抑制细胞内活性氧的产生，降低了细胞内肌动蛋白的谷胱甘肽化水平，进而激活Akt信号通路，引起细胞凋亡的延迟和功能的改变。本发明揭示了微环境酸碱度在免疫调节中的重要地位，所揭示的调控人中性粒细胞生物学特性的新路径和新靶点将为今后临床上设计新的输血医学储存和中性粒细胞的输注方案、炎性相关疾病和肿瘤的治疗方案提供新的思路和策略。

附图说明

图1中

a图为细胞外酸性环境对人外周血中性粒细胞凋亡情况的测定结果图；

b图为细胞外酸性环境对小鼠骨髓中性粒细胞凋亡情况的测定结果图。

图2中：

a图为荧光探针法检测不同培养条件下中性粒细胞活性氧的产生情况；

b图为不同培养条件下(pH6.0或pH 7.4，添加激动剂或不添加)中性粒细胞活性氧的产生情况。

图3中：

a图：不同浓度fMLP刺激下中性粒细胞的形态变化。

b图：中性粒细胞对fMLP刺激的敏感性。

图4中性粒细胞迁移实验结果图。

图5不同培养条件下中性粒细胞多伪足出现情况。

图6为验证中性粒细胞的吞噬作用时上清液涂板结果。

图7不同培养条件下细胞内纤维状肌动蛋白荧光强度。

图8.不同培养条件下中性粒细胞谷胱甘肽化修饰情况。

图9中：

a图：中性粒细胞自发凋亡过程中Akt磷酸化水平的变化趋势。

b图：不同pH细胞外培养基对中性粒细胞Akt磷酸化水平的影响。

图10.拉库春林对中性粒细胞的影响。

图11为酸性环境调节中性粒细胞凋亡的信号通路模型图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但不限定本发明的保护范围。

本发明提供了一种降低中性粒细胞肌动蛋白的谷胱甘肽化水平的方法，该方法包括如下步骤：选用RPMI 1640培养基加10％(体积)胎牛血清，再用盐酸或碳酸或乳酸调节pH值为：6.0≤pH值<7.0(如pH6.0，pH6.5)，0.22μm滤器滤菌，用该培养基对中性粒细胞进行体外培养4小时。

本发明还提供了一种中性粒细胞体外保存方法，该方法包括如下步骤：选用RPMI 1640培养基加10％(体积)胎牛血清，再用盐酸或碳酸或乳酸调节pH值为：6.0≤pH值<7.0(如pH6.0，pH6.5)，0.22μm滤器滤菌，用该培养基对中性粒细胞进行体外培养。

为了验证细胞外酸性环境在降低中性粒细胞内肌动蛋白的谷胱甘肽化水平中的应用及细胞外酸性环境在延迟中性粒细胞凋亡中的应用。本发明开展了细胞外酸性环境调控人中性粒细胞生物学特性的研究。

本发明采用的研究方法如下：用泛影葡胺(ficoll hypaque)密度梯度离心的方法分离纯化人的外周血中性粒细胞，小鼠骨髓来源的中性粒细胞采用percoll不连续密度梯度离心(76％-62％-52％)结合Histopaque 1119细胞分离液去除红细胞的方法获得。细胞培养基选择RPMI 1640完全培养基加10％胎牛血清，用盐酸或碳酸或乳酸调整pH值为7.4，7.0，6.5，6.0四个梯度。将细胞用不同pH值的培养基培养不同时间点后，用流式细胞术检测细胞凋亡情况。中性粒细胞功能检测包括活性氧的产生，细胞极化，迁移趋化以及细胞吞噬功能。活性氧的产生采用DCFH-DA荧光探针标记法以及鲁米诺化学发光检测。细胞的极化现象是将细胞用不同浓度的甲酰三肽刺激，通过活细胞工作站连续摄像获得完整的细胞变形过程的完整影像，计数在不同时间点发生极化的细胞的比例，比较在不同条件下细胞对甲酰三肽的敏感度。中性粒细胞迁移趋化功能检测采用的是transwell以及TAXIScan-FL技术。细胞吞噬功能采用细胞与细菌或生物颗粒共孵育的方法来检测。通过细菌CFUs数量和统计细胞对生物颗粒的结合指数，吞噬指数等数据衡量细胞在不同条件下的吞噬能力。

研究结果显示：通过流式检测发现中性粒细胞在酸性环境下的凋亡明显延迟，在实验设计的pH梯度内，人外周血来源的中性粒细胞在pH6.0时凋亡速度最慢，而小鼠骨髓来源的中性粒细胞则在pH6.5时凋亡最慢。对于中性粒细胞功能的检测发现，酸性环境能够抑制中性粒细胞NADPH氧化酶的活性，无论用甲酰三肽(fMLP)，佛波酯(PMA)，还是甲酰六肽(fNLPNTL)刺激，酸性环境中中性粒细胞产生活性氧的水平均明显下降。活细胞工作站观察发现，酸性环境中中性粒细胞对于甲酰三肽的刺激更加敏感，细胞能够对更低浓度的刺激剂发生变形反应。比较相同浓度的刺激下不同pH环境中的细胞发现，酸性环境中的细胞发生形变的细胞更多，且变化速度更快。而transwell和TAXIScan实验表明酸性环境中中性粒细胞的迁移趋化速度更快，但是对于中性粒细胞趋化的方向性分析发现酸性环境中，细胞朝向趋化剂运动的方向性较正常水平较差。将中性粒细胞与大肠杆菌共孵育的各种成分涂布后CFUs的数量分析来看，酸性环境中中性粒细胞的吞噬功能增强，结合细胞与荧光标记的生物颗粒共孵育的荧光照片分析发现，其吞噬指数与结合指数均比正常pH环境中的水平高。然而，虽然酸性环境下细胞吞噬的细菌数量较多，但胞内对细菌的消化能力却没有相应增强。对酸性环境影响中性粒细胞功能的机制研究发现，细胞外的酸性环境使细胞内环境pH值也相应降低。酸性环境降低了细胞内PI3K/Akt信号通路，活化的caspase 3的水平也降低。同时酸性环境降低了细胞内肌动蛋白的谷胱甘肽化水平，提高了肌动蛋白的聚合程度。

下文中，没有特别指出的，所指的中性粒细胞均指的是人外周血来源的中性粒细胞。

1.流式细胞术检测酸性环境中性粒细胞凋亡情况

1.1人外周血中性粒细胞的分离纯化

预先血浆瓶中加入50ml羟乙基淀粉，再将白膜血倒入瓶中，摇晃混匀后置于室温沉降30分钟。取上清至3个50ml离心管中，1500转每分离心10分钟。弃上清，管中留约5ml液体，将沉淀重悬。将三管细胞悬液合并为一管，再加入15ml生理盐水稀释一倍。再取两个50ml离心管，每管中加入15ml室温混匀的淋巴细胞分离液，再将细胞悬液缓慢加入分离液上方。2000转每分离心20分钟，升降加速度分别设为3。离心后液体分三层，细胞分两层，弃掉所有上清，只留下最下方的红细胞层，加入生理盐水将细胞重悬至5ml,按1:9的比例加入红细胞裂解液，即加入45ml，充分混匀后置于冰上裂解10分钟。1000转每分离心10分钟，用生理盐水洗三次，计数，按3x10⁶/ml的密度种于细胞培养皿中，37℃培养备用。瑞士染色观察细胞形态是否正常，结合流式标记CD66b检测中性粒细胞纯度。

1.2小鼠骨髓中性粒细胞的分离纯化

①颈椎脱臼法处死小鼠，取小鼠双后肢(带髂骨)，去除皮毛，分别剥离出胫骨，股骨，髂骨，浸在PBS溶液中备用。

②15ml离心管里加入5ml HBSS-EDTA-BSA溶液，用1ml注射器从骨头的一端插入骨髓腔，在溶液中不断抽吸，使骨髓中的细胞充分冲洗出来。

③得到的细胞悬液用200目滤膜过滤。400g离心10分钟，1ml HBSS-EDTA-BSA溶液重悬。

④配制percoll密度梯度溶液。

a)2ml 10xHBSS加18ml percoll原液制成100％percoll溶液。

b)按下表分别配制76％，62％，52％percoll溶液

	100％percoll(ml)	HBSS-EDTA-BSA(ml)
			76％	7.6	2.4
62％	6.2	3.8
			52％	5.2	4.8

c)将各组溶液分别颠倒混匀，按照从下到上76％-62％-52％的顺序依次缓缓加到另一离心管中，每种溶液3ml。

⑤将细胞悬液缓慢加入配好的密度梯度溶液上方，1100g离心30分钟，加速度为3升3降。

⑥离心后的细胞分为四层。小心吸弃上面两层细胞及液体，吸取第三层细胞(即76％-62％之间的一层细胞)，即中性粒细胞加入另一离心管。

⑦向得到的细胞中加入等体积HBSS-EDTA-BSA溶液，充分混匀，600g离心10分钟。

⑧细胞沉淀用2ml HBSS-EDTA-BSA溶液重悬，取另一新的离心管加入2ml淋巴细胞分离液histopaque-1119，再将细胞悬液缓慢加入分离液上方。1600g离心30分钟，加速度3升3降。

⑨吸取中间层细胞于另一离心管中，加入HBSS-EDTA-BSA溶液洗一遍，600g离心10分钟。

⑩得到的细胞涂片瑞士染色，观察细胞形态，结合流式标记CD11b/Gr-1检测中性粒细胞纯度。

细胞用培养基或相应buffer重悬，计数，备用。

1.3 1640培养基的酸化

将配好的含有10％胎牛血清的RPMI 1640培养基分成四份，逐滴加入70％的盐酸溶液，摇匀并随时监测溶液pH值，直至达到pH7.4,7.0,6.5,6.0。之后将该溶液用0.2μm的滤器过滤，4℃保存备用。

分离纯化的中性粒细胞在体外培养一定时间后，用FITC-Annexin V和PI标记，流式细胞术分析细胞凋亡情况。结果表明，酸性环境能够明显延迟中性粒细胞的自发凋亡。如图1中a图所示，人的中性粒细胞在酸性环境中包括pH 6.0，6.5，7.0，凋亡都明显延迟，其中在pH 6.0时凋亡速率最慢，8h和24h最为明显，凋亡速率下降约20％左右。如图1中b图所示，小鼠骨髓来源的中性粒细胞在酸性环境中包括pH 6.0，6.5，7.0，凋亡都明显延迟，其中在pH 6.5时凋亡速率最慢。

2.荧光探针法检测中性粒细胞活性氧的产生

活性氧的产生是中性粒细胞的一项重要的功能，活性氧不仅直接参与中性粒细胞的杀菌作用，同时还与细胞凋亡相关，参与通过改变细胞内各种信号通路参与极化，趋化，吞噬等其他功能的调节。图2-a是荧光探针标记的中性粒细胞在不同pH值的培养基中培养2小时之后的荧光照片，可以看出酸性环境下，活性氧的产生明显下降，并且在pH6.0-7.0区间里培养基越酸，抑制越明显。酶标仪用488nm激发光检测荧光强度，如图2-b，没有任何激动剂刺激的情况下，酸性环境(pH＝6.0)下活性氧的产生比中性条件(pH＝7.4)下相比荧光强度有所降低，当用1μM fMLP刺激细胞后，中性培养基(pH＝7.4)中的细胞产生大量活性氧，而酸性条件下活性氧只有略微的上升，二者具有极显著差异(***，p<0.001)。

3.酸性环境增加中性粒细胞对激动剂的敏感性

中性粒细胞在fMLP等激动剂的作用下发生极化现象，表现为细胞膜向外突出伸出伪足。中性粒细胞对激动剂的刺激具有浓度的依赖性。为了研究环境酸碱性对中性粒细胞极化的影响，我们用不同浓度的fMLP刺激中性粒细胞，观察在不同pH环境中的细胞对fMLP的反应情况。从图3-a中可以看到，没有受到任何刺激的中性粒细胞呈圆形，一旦加入fMLP，细胞便开始发生形变。比较在不同pH培养基中的细胞发现，细胞发生变形的速度并不相同。通过统计第3分钟和第5分钟时发生极化的细胞的比例，如图3-b，我们发现酸性环境中的细胞对fMLP的刺激更加敏感。当fMLP浓度为0.1nM时，酸性环境和中性环境中的细胞变化基本相同，几乎没有细胞发生变形。当fMLP浓度为1nM时，pH7.4培养基中的细胞到第5分钟也只有约15％的细胞发生极化，而在pH6.0培养基中的细胞，第3分钟便有30％的细胞发生极化，到第5分钟，这个比例已经达到80％。fMLP浓度为10nM时也观察到同样明显的差异(***,p<0.001)。这些数据表明酸性环境增强了中性粒细胞对fMLP刺激的敏感性。

4.酸性环境影响中性粒细胞的迁移趋化运动

首先采用传统的transwell实验初步检测酸性环境对中性粒细胞趋化的影响。将中性粒细胞置于不同pH值的培养基中，下方加入1μM的fMLP，一定时间后分别计数迁移到下层的细胞数目。结果如图4显示，在相同的时间内，酸性培养基中有更多的细胞发生了趋向fMLP的穿膜运动，说明酸性环境增强了中性粒细胞的趋化运动。

5.酸性环境中中性粒细胞出现多伪足

具体到每一个细胞的变形运动的状态，我们发现(图5)，酸性环境中的很多细胞出现多伪足的现象。中性粒细胞的趋化运动过程可以细化为识别浓度梯度，极化，头部伸出伪足，附着，尾部收缩的过程。通常情况下，细胞处在一个稳定的浓度梯度中，会向高浓度方向伸出一个伪足，完成趋化。多伪足的形成导致了酸性环境中细胞运动的相对随机性。

6.酸性环境影响中性粒细胞的吞噬作用

当机体发生病原菌感染时，中性粒细胞能迅速迁移至感染部位，吞噬病原菌。因此吞噬能力是衡量中性粒细胞功能的一项重要指标。我们在体外将中性粒细胞与经过血清调理作用的细菌共孵育，通过低速离心将未被吞噬的细菌与细胞分离，将上清与细胞裂解物同时涂板。上清中的CFUs代表的是未被吞噬的细菌数目，而细胞裂解物中的CFUs代表的是吞入细胞内而未被细胞消化的细菌。Input代表的只有细菌在培养基中孵育相同时间的对照，相当于投入细菌的总量。图6是上清液涂板的结果，可以看到酸性培养基中经过细胞吞噬作用之后剩余的细菌量大约为中性环境中的50％，说明酸性环境中的细胞吞入了更多的细菌。

7.酸性环境对中性粒细胞肌动蛋白聚合的影响

我们所感兴趣的中性粒细胞的极化，趋化，吞噬等功能的发挥都涉及到细胞的形态变化，而这种变化是以细胞内骨架蛋白的不断解聚与重组为基础的。为了研究酸性环境影响中性粒细胞功能的机制，因此我们首先检测了酸性环境对细胞内球状肌动蛋白(G-actin)聚合成纤维状肌动蛋白(F-actin)的影响。首先我们用罗丹明标记的鬼笔环肽标记不同pH条件下的细胞中的F-actin蛋白，通过酶标仪检测荧光强度反应细胞内F-actin的水平。从结果图7中可以看到，酸性环境中细胞F-actin的荧光强度显著高于对照组(pH7.4)，说明在酸性环境中actin蛋白的聚合水平升高。

8.酸性环境对中性粒细胞肌动蛋白谷胱甘肽化的影响

F-actin是细胞内重要的骨架蛋白，是由G-actin单体聚合而成的纤维状结构。影响actin聚合的因素很多，而G-actin自身的谷胱甘肽化修饰水平就是其中重要的影响因素之一。前面的实验证明了在酸性环境中细胞中的F-actin水平升高，为了探究其中的原因，我们又进一步利用免疫共沉淀技术检测了actin蛋白的谷胱甘肽化水平。我们将不同条件下培养的中性粒细胞总蛋白用肌动蛋白的抗体进行pull down，随后的western blot用抗谷胱甘肽化的抗体检测谷胱甘肽化的肌动蛋白的水平。对照组仍然用肌动蛋白抗体进行western blot检测。结果如图8所示，在细胞总的肌动蛋白相同的情况下，酸性环境中谷胱甘肽化修饰的肌动蛋白明显降低。

免疫共沉淀法检测细胞肌动蛋白谷胱甘肽化水平

①细胞裂解：纯化的中性粒细胞在体外用酸性和中性培养基培养4小时后收集细胞，用预冷的PBS洗两遍，约3×10⁷cells加入RIPA裂解液200μl，冰上裂解20分钟，12000rmp，4℃离心10分钟，取上清。

②免疫沉淀

a)预纯化裂解产物：每1ml细胞裂解液加入20μl agarose slurry(50％)，4℃缓慢颠倒混匀10分钟。14000g，4℃离心5分钟除去beads，上清转移至另一EP管中。

b)抗体孵育：测定蛋白浓度，用PBS将蛋白浓度稀释至约1μg/μl，加入anti-actin抗体，缓慢颠倒，室温2小时，或4度过夜。

c)Protein A/G-Agarose孵育：加入30-40μl protein A/G-agarose，4℃缓慢颠倒混匀2小时(说明书提供，可根据实际情况优化时间条件)。

d)收集免疫沉淀物：1000rpm离心3分钟，去上清，用细胞裂解液(预冷的RIPA)洗沉淀3次。

③煮样：用30-60μl SDS loading buffer重悬沉淀物，100℃煮样10分钟(使珠子和免疫复合物解离)，离心，或-20℃冻存。

④Western Blot

SDS-PAGE凝胶电泳

a)将玻璃板洗净，无水乙醇去脂，干燥后安装。依据需分离的目的蛋白分子量大小配置适当浓度的分离胶，小心注入玻璃板间隙中，注意不要产生气泡，并为浓缩胶留有足够的空间。轻轻在顶层加满去离子水封闭，以阻止空气中的氧对凝胶聚合的抑制作用；室温放置50分钟。

b)分离胶完全聚合后，倒掉封闭液，用吸水纸吸干残留液体，注入浓缩胶，立即插入梳子，小心避免产生气泡，室温放置50分钟。

c)浓缩胶聚合后，取出梳子，将胶板安置入电泳槽中，加入电泳缓冲液。将蛋白样品缓慢加入孔内。

d)电泳开始，上层胶用70V跑约30分钟，染料进入分离胶后，增加电压至110V，继续电泳直到染料抵达分离胶底部，断开电源。

转膜

a)剪大小相同的6张滤纸和1张硝酸纤维素膜(NC膜)，其大小与分离胶大小一致。浸入转移缓冲液中，平衡15分钟。

b)电泳结束后，从电泳槽内取出胶板，均衡用力撬开玻璃板。弃掉浓缩胶，将分离胶置于转移缓冲液中。

c)按顺序安装转移装置：负极-3张滤纸-凝胶-NC膜-3张滤纸-正极，将各层分别对齐，每一层都用玻璃棒除尽气泡，将此三明治结构装入湿转槽中，接通电源，按0.5-0.8mA/cm2，转移1.5小时。转膜在低温中进行，注意搅拌。

免疫染色

a)转移结束后，将转印膜加入5％脱脂牛奶中，于摇床上室温孵育2小时。

b)封闭结束后，将NC膜转移至塑料袋中，加入按比例(1:1000)稀释好的一抗溶液(实验组为抗谷胱甘肽化抗体，input为抗肌动蛋白抗体)，封口机封口，4℃孵育过夜。

c)取出NC膜，PBST洗膜三次，每次10分钟，将NC膜置于塑料袋中，加入稀释好的二抗稀释液(HRP偶联的山羊抗兔，1:10000)。室温下摇动1小时。

d)取出NC膜，PBST洗膜三次，每次10分钟。

ECL显色

以下步骤在避光条件下进行。将ECL显色底物液A、B液以1:1比例混合，按膜面积0.1ml/cm²淋在NC膜表面。将膜表面的液体去除，置于ImageQuant LAS 4010荧光化学发光成像仪中，自动曝光成像。

9.酸性环境提高了细胞内Akt磷酸化水平

通过之前的实验，我们看到细胞外的酸性环境使得细胞内pH也随之下降，细胞内活性氧的水平下降。同时，我们还检测到酸性环境中，细胞内肌动蛋白的谷胱甘肽化修饰降低，F-actin水平升高。在对中性粒细胞中，存在一个由活性氧-肌动蛋白-PI3K/Akt信号通路组成的loop环，对调节中性粒细胞的自发凋亡起到重要作用。根据我们的实验结果，我们推测细胞外酸性环境延迟中性粒细胞的凋亡可能与这个loop环相关。为了验证，我们进一步检测了酸性环境对PI3K/Akt信号通路中Akt磷酸化的影响。PI3K具有磷脂酰肌醇激酶活性，能够催化细胞膜上的磷脂酰肌醇二磷酸(PIP2)磷酸化生成磷脂酰肌醇三磷酸(PIP3)，后者募集Akt蛋白使其发生磷酸化，从而激活下游通路。图9-a是在中性粒细胞自发凋亡过程中Akt磷酸化水平的变化趋势，可见随着细胞的自发凋亡，Akt磷酸化水平逐渐下降，反映了PI3K/Akt信号通路活性在调节中性粒细胞自发凋亡中的作用。随后我们检测了细胞体外培养24小时后，酸性环境中细胞Akt的磷酸化水平。从图9-b中，我们可以看出，随着细胞外培养基pH的降低，Akt的磷酸化水平升高。上述结果可以初步证明Akt在酸性环境中能维持较高水平的活化状态，这可能是酸性环境延缓了Akt在中性粒细胞自发凋亡中的失活速度，导致细胞中PIP3/Akt促存活信号通路持续处于激活状态，促进了细胞的存活。

10.拉库春林(Latrunculin)处理对中性粒细胞Akt磷酸化及凋亡的影响

拉库春林是一种细胞骨架去稳定剂，能够结合G-actin单体，抑制其聚合。之前的实验结果表明酸性环境中细胞内肌动蛋白聚合水平升高。为了阐明肌动蛋白聚合程度与中性粒细胞Akt磷酸化以及细胞凋亡的影响，我们用latrunculin处理中性粒细胞，降低细胞内F-actin的水平。对Akt磷酸化水平及细胞凋亡的检测结果如图10所示，在培养体系中加入拉库春林后，细胞中Akt磷酸化水平比对照组明显降低，而细胞凋亡速度也明显加快。该结果表明细胞内肌动蛋白聚合水平与Akt信号以及细胞凋亡密切相关。

11.酸性环境调节中性粒细胞特性的作用路径

至此，本发明阐明了酸性环境中Akt磷酸化，肌动蛋白谷胱甘肽化，肌动蛋白聚合，细胞凋亡之间的联系。即酸性环境中肌动蛋白谷胱甘肽化水平降低，因此F-actin聚合水平升高。而肌动蛋白的聚合程度又会影响Akt信号通路，进而影响细胞凋亡。活性氧产生能够调节细胞内蛋白质的谷胱甘肽化水平，改变肌动蛋白的聚合程度，进一步影响中性粒细胞的特性，如图11所示。

Claims (8)

1.细胞外酸性环境在降低中性粒细胞内肌动蛋白的谷胱甘肽化水平中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：细胞外酸性环境通过抑制细胞内活性氧的产生，进而降低了细胞内肌动蛋白的谷胱甘肽化水平。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的细胞外酸性环境是指：控制细胞外环境的pH值为：6.0≤pH值<7.0。

4.一种降低中性粒细胞肌动蛋白的谷胱甘肽化水平的方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：选用RPMI 1640培养基加10％(体积)胎牛血清，调节pH值为：6.0≤pH值<7.0(盐酸或碳酸或乳酸进行调节)，0.22μm滤器滤菌，用该培养基对中性粒细胞进行体外培养4小时。

5.细胞外酸性环境在延迟中性粒细胞凋亡中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：细胞外酸性环境通过抑制细胞内活性氧的产生，降低了细胞内球状肌动蛋白的谷胱甘肽化水平和促进纤维状肌动蛋白的形成，进而激活Akt信号通路，引起细胞凋亡的延迟。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述的细胞外酸性环境是指：控制细胞外环境的pH值为：6.0≤pH值<7.0。

8.一种中性粒细胞体外保存方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：选用RPMI 1640培养基加10％(体积)胎牛血清，调节pH值为：6.0≤pH值<7.0(盐酸或碳酸或乳酸进行调节)，0.22μm滤器滤菌，用该培养基对中性粒细胞进行体外培养。