CN107446883A - Treg细胞与心肌成纤维细胞共培养时的互促增殖作用 - Google Patents

Treg细胞与心肌成纤维细胞共培养时的互促增殖作用 Download PDF

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Abstract

本发明提供CD4+CD25+ Treg细胞(CD4+CD25+ regulatory T lymphocytes，Tregs)与心肌成纤维细胞(Cardiac Fibroblasts，CFs)共培养时的互促增殖作用。本申请人将Tregs与CFs在体外共培养48h后，Tregs明显促进CFs的增殖，CFs亦明显促进Tregs的活化及增殖。

Description

Treg细胞与心肌成纤维细胞共培养时的互促增殖作用
技术领域
本发明涉及CD4+CD25+Treg细胞与心肌成纤维细胞共培养时的互促增殖作用。
背景技术
心肌纤维化，其主要表现以心肌正常组织结构中细胞增殖、细胞外基质过度沉积，是多种心脏疾病发展至一定阶段所共有的病理改变。
心肌纤维化与高血压，心肌梗死，病毒性心肌炎，动脉粥样硬化等多种疾病的病理过程有着密切联系，同时也是慢性心衰进展过程中重要的病理表现，还可导致心律失常和心源性猝死等严重并发症，故预防和逆转心肌纤维化是临床治疗心力衰竭的关键点之一。心肌纤维化的发病机制至今尚未明确，有观点认为肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)的过度激活是引起心肌纤维化的关键。
调节性T细胞是免疫反应和炎症作用平衡中的关键因素之一。早在1995年，Sakaguchi就在研究中发现成年鼠中近10％的外周CD4+T细胞可表达IL-2受体α链CD25的信号表征，去除这群细胞会引起大鼠产生多种自身免疫性疾病，而再次回输该细胞就能阻止疾病的发生。因此将这群细胞命名为CD4+CD25+调节性T细胞(CD4+CD25+regulatory Tcells,Tregs)。在炎症反应中，机体免疫系统激活，免疫细胞可分泌大量的炎症因子，炎症因子可直接或间接引起或逆转心肌纤维化。
目前被广泛认可的T细胞活化的信号通路调控为：Kv1.3通道维持T淋巴细胞的静息电位，使T细胞处于能被活化的状态；T淋巴细胞被活化后，KCa3.1通道作为钙离子激活的钾离子通道会使膜电位超极化，使得Ca2+持续内流，促使钙释放激活Ca2+(Ca2+-releaseactivating Ca2+，CRAC)通道打开，上调内质网的钙库释放Ca2+的量，Ca2+增加后可通过钙依赖性的蛋白激酶通路启动各种细胞因子的转录，使其发挥免疫效能。
发明内容
而本申请人通过实验，发现Tregs在心肌纤维化进程中的表现与背景技术中所述并不相同，确切地说，得到了与现有技术相反的结论，即：正常大鼠CD4+CD25+Treg细胞与心肌成纤维细胞在体外共培养时，具有互促增殖作用；Tregs无法起到免疫效果，具有促心肌纤维化的作用。
因此，本发明的第一个目的是提供CD4+CD25+Treg细胞与心肌成纤维细胞共培养时的互促增殖作用。
作为优选，所述共培养为体外共培养。
作为优选，共培养48h后，CFs细胞增殖达平稳期。
作为优选，共培养后，Tregs时间依赖性地增加CFs的增殖；作为优选，所述时间依赖性是Tregs在0-48h内呈时间依赖性地增加CFs的增殖。
作为优选，共培养后，Tregs促进CFs的I型胶原、III型胶原及基质金属蛋白2(MMP2)的分泌。
作为优选，共培养后，CFs促进Tregs细胞内、外TGF-β和IL-10的分泌。
作为优选，共培养后，Tregs细胞内TGF-β的增加明显高于IL-10的增加。
作为优选，共培养后，CFs促进Tregs的Kv1.3、KCa3.1和CRAC三种离子通道mRNA的表达。
作为优选，共培养后，CFs明显促进Tregs的Kv1.3通道mRNA的表达。
作为优选，共培养后，CFs促进Tregs的Kv1.3通道的蛋白质表达。
本发明的第二个目的是要求保护本申请提出的：CD4+CD25+Treg细胞具有促心肌纤维化的作用。
本申请人通过正常成年SD大鼠脾脏CD4+CD25+Treg细胞(Tregs)体外与SD大鼠乳鼠心肌成纤维细胞(CFs)共培养，观察两种细胞的相互作用。具体方法为：免疫磁珠分选正常成年SD大鼠脾脏Tregs，差速贴壁法分选SD大鼠3日乳鼠的CFs，共培养一定时间后，CCK-8法检测各组CFs及Tregs增殖的相互影响，ELISA法检测CFs分泌的Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、基质金属蛋白2(MMP2)及Tregs细胞内、外的TGF-β及IL-10的相对表达水平，RT-qPCR技术检测Tregs的Kv1.3、KCa3.1及CRAC通道mRNA的相对表达水平，In-cell western blotting(ICWB)法检测Tregs细胞的Kv1.3通道蛋白质的相对表达水平。
本发明的实验结果为：两种细胞共培养48h后，CFs细胞增殖达平稳期，CFs与Tregs均明显相互促进增殖(P＜0.01)；CFs分泌的Ⅰ型、Ⅲ型胶原和MMP2的相对表达水平均明显增加(P＜0.01)。Tregs细胞内、外TGF-β和IL-10与共培养前相比均明显增加(P＜0.01)，但胞内的TGF-β的增加明显高于IL-10的增加(P＜0.01)，胞外两种因子增加无统计学差异；Tregs的Kv1.3、KCa3.1、CRAC通道mRNA的相对表达水平均明显增加(P＜0.01)；Tregs的Kv1.3通道蛋白质亦明显增加(P＜0.01)。
本发明的实验结论为：体外Treg与CFs共培养48h后，Tregs明显促进CFs的增殖，CFs亦明显促进Tregs细胞活化及增殖。
本发明为国家自然科学基金资助项目(编号：81360491)。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为共培养时，Tregs对CFs增殖影响的时间曲线；
图2为共培养48h时，CFs及Tregs增殖的互相影响；其中，A为CFs的增殖改变，B为Tregs的增殖改变；
图3为共培养48h后，Tregs促进CFs中I、III型胶原蛋白及MMP2的分泌；
图4为共培养48h后，CFs对Tregs内、外TGF-β及IL-10分泌水平的影响；
图5为共培养48h后，CFs对Tregs的三种离子通道mRNA的表达水平的影响；
图6为共培养48h后，CFs对Tregs细胞膜Kv1.3通道蛋白表达的影响。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例1
1.材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验对象 15周的雄性SD大鼠(新疆医科大学动物房)，体重控制在250～300g。
刚出生的SD乳鼠，母鼠喂养3日。
1.1.2 主要试剂和仪器 免疫磁珠分选器(德国美天旎)，Biotin Mouse Anti-RatCD4(BD 554836)，PE-Mouse-Anti-Rat CD25(BD 554866),大鼠淋巴细胞分离液(LTS1083，Sigma)，胎牛血清、RPMI1640培养液(Hyclone)，sybr试剂盒(Life)，小鼠抗大鼠KCNN1.3一抗ab105562(Abcam)，β-actin ab8226(Abcam)，800CW Goat anti-mouse(LI-COR)等。
1.2 实验方法
1.2.1 Tregs的分选 免疫磁珠分选法分选正常SD大鼠脾脏CD4+CD25+Tregs(详见相关试剂操作说明书)阳性分选得到Tregs，进行细胞计数及存活率的统计，用含10g/L牛血清，rmIL-2(10μL/mL)，TGF-β1(2.5×106IU/mL)，双抗(2μg/mL)，anti-CD3(10μL/mL)及HSP60(10μL/mL)的完全培养基于37℃5％CO2孵育48h待用，免疫磁珠分选法所得Tregs纯度≥95％。
1.2.2 SD大鼠乳鼠CFs的分选 取3日龄SD大鼠10只，于无菌环境下开胸取出心脏，剔除大血管等组织，留取心尖部心室组织，沿其纵轴剪3-4下，使其呈花瓣状，放入装有0.25g/mL的胰酶的玻璃瓶子中，置于摇床上，4℃30r/min消化过夜。第二天弃去大部分胰酶，加入等量完全培养液终止消化，弃上清。加入浓度为0.8g/mLII型胶原酶置37℃水浴箱震荡消化8-10min，收集上清于含有等体积培养液的离心管中。重复上述步骤3-4次，直到组织块基本消化完全为止。收集各次消化的液体，以1200r/min离心5min，弃上清，用完全培养基重悬，接种于第1个10cm的培养皿中，放入37℃5％CO2培养箱中孵育90min(第1次差速贴壁)。吸出尚未贴壁的细胞悬液置于第2个10cm的皿中，同样条件下在培养40min(第2次差速贴壁)，收集细胞悬液，台盼蓝染色计数，调整至108/L，并加入BrdU以抑制非心肌细胞增殖，接种于相应的培养皿中。在2次差速贴壁的第1和第2个10cm皿中(主要含CFs)加完全培养基(10g/L FCS，1g/L双抗，1g/L谷氨酸，1g/L非必需氨基酸)，于37℃5％CO2孵育箱中过夜，待用。
1.2.3 实验组协议 分为CFs、CFs+Tregs和Tregs组，每组接种104个CFs于96孔板中并置于37℃5％CO2孵育箱中适应性培养48h，贴壁率达到(80.0±5)％时换PBS空白培养基饥饿培养12h，同时对Tregs细胞饥饿处理，各组在含有10g/L牛血清，双抗(2μg/mL)的1640培养液中，于37℃，5％CO2孵育箱中培养48h。
1.2.4 共培养后，两种细胞的分离 共培养一定时间后，因Tregs不贴壁，为悬液，将其吸出，离心后用PBS重悬备用。因CFs为贴壁细胞，将实验孔板用PBS洗涤3次后备用。
1.2.5 共培养后，CCK-8法检测两种细胞的增殖改变 定量后对两种细胞中加入CCK-8试剂，于37℃，5％CO2孵育箱中孵育4h后检测吸光度(OD值)。
1.2.6 ECM的相关蛋白质相对表达水平的检测 将三组于37℃，5％CO2孵育箱中培养48h后，分别收集它们的培养液，按ELISA试剂盒步骤检测各组Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和MMP2的相对含量。
1.2.7 Tregs分泌的TGF-β与IL-10相对含量的检测 将饥饿处理后的CFs+Tregs，Tregs用含有10g/L牛血清，双抗(2μg/mL)的1640培养液，于37℃，5％CO2孵育箱中培养48h。收集两组培养液，离心分别收集上清液(即细胞外液)和Tregs细胞，对Tregs细胞进行(-20℃～37℃)反复冻融处理得到细胞内液。按ELISA试剂盒步骤检测各组细胞内、外液TGF-β和IL-10的相对含量。
1.2.8 Tregs的三种离子通道的mRNA的相对表达水平检测 RT-qPCR检测Tregs细胞的Kv1.3、KCa3.1、CRAC通路基因的表达。收集各组的Tregs，分别提取各组RNA并检测其浓度和纯度，立即进行逆转录以防RNA裂解(详细步骤见Thermo Reverse Translation Kit产品的操作说明书)。使用lifeGreen Master Mix试剂盒进行PCR扩增，于冰上配扩增体系(H2O，6.4μL，SYBR，10μL，Primer，0.8μL)加样品1.8μL。设定扩增程序Cycle1(1)50.0℃，2min；Cycle2(1)95.0℃，2min；Cycle3(40)95.0℃，15s，60℃，15s；Cycle4(1)60℃，15s；Cycle5(1)95℃，15s。
表1
1.2.9 Tregs细胞的Kv1.3通道蛋白质表达的检测 收集各组Tregs，用上述1640培养液混悬，分别布于U型黑壁96孔板中，每孔加100μL悬液(约104个细胞)，37℃孵育15min；每孔加50μL固定剂(4％多聚甲醛)室温下置于摇床上30r/h，固定20min；沿孔壁轻轻吸去上清，每孔加100μL封闭液(0.5g/L脱脂奶粉配置)置于摇床上30r/h封闭1h，沿孔壁轻轻吸去上清；每孔加50μL一抗(KCNN1.3小鼠抗人，用0.25g/L脱脂奶粉1:800稀释)于摇床上4℃，30r/h，过夜，用TBST洗脱一抗5次，用0.25g/L脱脂奶粉溶液稀释二抗，每孔加50μL二抗，于摇床上30r/h避光摇动1h，静置15min，沿管壁轻轻吸去上清液，加200μL TBST洗脱5次，弃洗脱液，用Odyssey的700和800通道扫描孔板，中等扫描质量，169μm的分辨率，3.0mm焦距，亮度为5进行检测。
2.实验结果
2.1 共培养后Tregs时间依赖性地增加CFs的增殖 Tregs细胞和CFs共培养48h时CFs增殖达平台期，共培养12h后，CFs的增殖均非常明显(CFs+Tregs vs CFs，P＜0.01)，并呈时间依赖性。见表2及图1。
表2 共培养不同时间Tregs对CFs细胞增殖改变的时间曲线(n＝8)
注：**P＜0.01为CFs+Tregs组vs CFs组。
2.2 共培养48h，CFs及Tregs的增殖相互影响明显增加共培养48h后，CFs与Tregs
的增殖改变明显高于单独培养时的增殖改变(P＜0.01)，见表3及图2。
表3 共培养48h，CFs及Tregs的增殖互相影响(n＝8)
注：**P＜0.01为CFs+Tregs组vs CFs组；##P＜0.01为Tregs+CFs组vs Tregs组。
2.3 共培养48h，Tregs促进CFs的I型胶原、III型胶原及MMP2的分泌 CFs与Tregs共培养48h后，CFs中Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和MMP2的表达水平均明显增加(CFs+Tregs vs CFs，P＜0.01)，见表4及图3。
表4 共培养48h，Tregs对CFs分泌的Ⅰ、Ⅲ型胶原和MMP2水平的影响(n＝8)
注：**P＜0.01为CFs+Tregs组vs Tregs组。
2.4 共培养48h，CFs促进Tregs细胞内、外TGF-β和IL-10的分泌，胞内TGF-β的分泌增加尤为显著 共培养48h后，Tregs细胞内、外两种关键细胞因子TGF-β和IL-10的水平均明显增加(CFs+Tregs vs CFs，P＜0.01)，且两种因子的增加细胞内明显高于细胞外(P＜0.01)，胞内TGF-β的分泌增加最为明显(5.8倍)，细胞外两种因子的增加无统计学差异。见表5及图4。
表5 共培养48h，CFs对Tregs细胞内、外TGF-β及IL-10分泌水平的影响(n＝3)
注：**P＜0.01为Tregs+CFs组vs Tregs组，##P＜0.01为细胞内vs细胞外
2.5 共培养48h，CFs促进Tregs的三种离子通道mRNA的表达相对升高，其中Kv1.3通道的表达升高最为明显 共培养48h后，Tregs的Kv1.3、KCa3.1和CRAC通道的mRNA相对表达水平明显升高(Tregs+CFs vs Tregs，P＜0.01)，见表6及图5。
表6 共培养48h，CFs对Tregs的三种离子通道mRNA的表达水平的影响(n＝8)
注：**P＜0.01为Tregs+CFs组vs Tregs组
2.6 共培养48h后，CFs促进Tregs的Kv1.3通道蛋白表达明显增加 共培养48h后，CFs促进Tregs的Kv1.3通道蛋白表达增加大于3倍(Tregs+CFs vs Tregs，P＜0.01)，如图6。
本发明的结果表明，Tregs与CFs共培养48h时CFs的增殖达稳定，Tregs能明显促进CFs的增殖(P＜0.01)，在共培养体系中CFs合成的Ⅰ型、Ⅲ型胶原和MMP2的相对表达量均显著增加(P＜0.01)，均说明Tregs可促进CFs的增殖。
本发明的结果显示，CFs+Tregs组的Kv1.3、KCa3.1及CRAC三种离子通道mRNA的表达较CFs组均有显著增加(P＜0.01)。研究认为(Estes DJ,Memarsadeghi S,Lundy SK,etal.High-throughput profiling of ion channel activity in primary humanlymphocytes[J].Analytical chemistry 2008；80(10):3728)，Kv1.3通道的活性可作为T细胞的功能活性标志物。基于Kv1.3通道mRNA的研究结果及Kv1.3通道在免疫疾病中靶标的地位，故主要选择对Kv1.3通道蛋白质的相对表达水平进行了检测，ICWB的结果显示，CFs+Tregs共培养体系中，Tregs膜上Kv1.3通道蛋白质的表达较CFs组明显增加(P＜0.01)。
以上研究结果在mRNA和蛋白的层面上证明了Kv1.3通道在Tregs活化过程中发挥了重要的作用。共培养后，CFs亦能促进Tregs上Kv1.3通道的高表达而引起Tregs的活化，且明显促进了Tregs的增殖(P＜0.01)，进而分泌细胞因子TGF-β和IL-10(P＜0.01)，且Tregs内的TGF-β分泌最为明显。因TGF-β是重要的促纤维化因子，说明这可能是使CFs增殖的最主要的原因之一。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.CD4+CD25+Treg细胞与心肌成纤维细胞共培养时的互促增殖作用。
2.根据权利要求1所述的互促增殖作用，其特征在于：所述共培养为体外共培养。
3.根据权利要求1所述的互促增殖作用，其特征在于：共培养48h后，CFs细胞增殖达平稳期。
4.根据权利要求1所述的互促增殖作用，其特征在于：共培养后，Tregs时间依赖性地增加CFs的增殖；作为优选，所述时间依赖性是Tregs在0-48h内呈时间依赖性地增加CFs的增殖。
5.根据权利要求1所述的互促增殖作用，其特征在于：共培养后，Tregs促进CFs的I型胶原、III型胶原及基质金属蛋白2的分泌。
6.根据权利要求1所述的互促增殖作用，其特征在于：共培养后，CFs促进Tregs细胞内、外TGF-β和IL-10的分泌。
7.根据权利要求6所述的互促增殖作用，其特征在于：共培养后，Tregs细胞内TGF-β的增加明显高于IL-10的增加。
8.根据权利要求1所述的互促增殖作用，其特征在于：共培养后，CFs促进Tregs的Kv1.3、KCa3.1和CRAC三种离子通道mRNA的表达；作为优选，所述CFs明显促进Tregs的Kv1.3通道mRNA的表达。
9.根据权利要求8所述的互促增殖作用，其特征在于：共培养后，CFs促进Tregs的Kv1.3通道的蛋白质表达。
10.CD4+CD25+Treg细胞具有促心肌纤维化的作用。
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