CN104995514A

CN104995514A - 载体、该载体的制造方法、生物物质的免疫学测定方法

Info

Publication number: CN104995514A
Application number: CN201480008335.6A
Authority: CN
Inventors: 水内素晶; 和久井世纪; 山口哲司
Original assignee: JSR Corp
Current assignee: JSR Corp
Priority date: 2013-02-13
Filing date: 2014-02-12
Publication date: 2015-10-21
Also published as: WO2014126111A1; JPWO2014126111A1

Abstract

本发明提供一种用于以高灵敏度测定生物标记物等的生物物质量的载体、载体的制造方法、测定方法。一种载体，其特征在于，在表面具有聚合物，该聚合物含有具有亚磺酰基的重复单元。

Description

载体、该载体的制造方法、生物物质的免疫学测定方法

技术领域

本发明涉及在表面具有聚合物的载体、该载体的制造方法以及使用免疫反应以高灵敏度测定生物标记物等生物物质的生物物质免疫学测定方法。

背景技术

以往，血清、血浆、尿等各种生物体试样中含有的微量物质的测定一直采用放射免疫测定法(RIA)、酶免疫测定法(EIA)等免疫测定法。这时，作为不溶性载体，有时使用结合了抗原或抗体的磁性粒子。

然而，在非均相的免疫测定法中，存在起因于测定试样中含有的成分的干扰物质所致的、不依赖于抗原和抗体的特异性反应的所谓的“非特异性吸附”导致的空白值上升的问题。另外，在微量滴定板这样的一个反应容器进行从抗原抗体间的反应到检测反应的工序的情况下，存在容器的污染引起显著的空白值上升、测定精度降低的问题。

以往，为了减少非特异性吸附、容器的污染，报告了向反应体系中添加白蛋白、酪蛋白、明胶等来自生物的物质的方法；添加表面活性剂的方法(专利文献1～3)等。然而，使用来自生物体的封闭剂时，有BSE所代表的生物污染的问题，另一方面，使用表面活性剂则可举出某种程度的效果，但尚不能说是充分的。

现有技术文献

专利文献

专利文献1:日本特开昭58－187862号公报

专利文献2:日本特开昭60－53846号公报

专利文献3:日本特开昭61－260163号公报

发明内容

本发明要解决的课题是提供用于以高灵敏度测定生物标记物等的生物物质量的载体、载体的制造方法、测定方法。

本发明人等发现通过使用以含有具有亚磺酰基的重复单元的聚合物处理过的载体来抑制非特异性吸附，能够以高灵敏度测定生物物质。

即，本发明是以下的＜1＞～＜10＞。

＜1＞一种载体，其特征在于，在表面具有聚合物，该聚合物含有具有亚磺酰基的重复单元。

＜2＞根据＜1＞中记载的载体，其中，上述聚合物是含有在侧链具有亚磺酰基的重复单元的聚合物。

＜3＞根据＜1＞或者＜2＞中记载的载体，其中，上述聚合物进一步含有疏水性重复单元。

＜4＞根据＜1＞～＜3＞中任一项中记载的载体，其中，进一步担载有配体。

＜5＞根据＜1＞～＜4＞中任一项中记载的载体，其中，具有含有磁性物质的磁性粒子。

＜6＞一种上述载体的制造方法，其特征在于，使含有具有亚磺酰基的重复单元的聚合物与载体接触。

＜7＞一种生物物质的免疫学测定方法，其特征在于，包含将测定对象物质捕获至载体的工序，上述载体为＜4＞或＜5＞中记载的载体。

＜8＞根据＜7＞中记载的免疫学测定方法，其中，进一步包含清洗含有上述载体的反应体系来进行B/F分离的工序。

＜9＞根据＜7＞或＜8＞中记载的免疫学测定方法，其中，进一步包含测定上述载体所捕获的对象物质量的工序。

＜10＞一种测定方法，其特征在于，是在同一反应容器中进行如下工序的生物物质的免疫学测定方法:向磁性粒子捕获测定对象物质的反应工序，清洗含有上述磁性粒子的反应体系而进行B/F分离的清洗工序，测定磁性粒子所捕获的对象物质的测定工序；在反应容器内投入含有聚合物的溶液和上述磁性粒子，进行捕获反应，该聚合物含有在侧链具有亚磺酰基的重复单元。

根据本发明，在非均相的免疫测定法中能够减少起因于干扰物质的非特异性吸附。由此，能够降低背景噪音。因此能够在不对生物物质或者含有生物物质的血液献体等生物体试样进行稀释的情况下进行测定。另外，由于同时高效进行免疫反应，所以低值下的测定精度提高，分析时间缩短。另外，如果采用在反应容器中利用聚合物处理磁性粒子等载体的方法，则同时也能够防止免疫反应时的反应容器的污染，因此上述效果进一步提高。另外，本发明的方法，优选使用磁性粒子作为固相载体，这时被检测物的浓缩、清洗容易，另外，能够以短时间测定大量被检测物。

具体实施方式

本发明的载体的特征在于，在表面具有聚合物，该聚合物含有具有亚磺酰基的重复单元。

[含有具有亚磺酰基的重复单元的聚合物]

以下，将具有亚磺酰基的重复单元简称为“重复单元(A)”，将含有该重复单元的聚合物简称为“聚合物”。

作为重复单元(A)，只要是具有亚磺酰基的重复单元，则可以在主链具有亚磺酰基，也可以在侧链具有亚磺酰基，优选在侧链具有亚磺酰基。

另外，作为重复单元(A)，优选显示亲水性。这里，在本说明书中，亲水性是指具有与水的亲和力强的性质。具体而言，仅由1种重复单元构成的均聚物(由实施例的测定法得到的数均分子量为1万～10万左右的均聚物)在常温(25℃)下在纯水100g中溶解1g以上的情况下，该重复单元是亲水性的。

另外，作为上述重复单元(A)，优选表示亲水疏水的尺度的Hydrophile－Lipophile Balance(HLB值)为10以上。得到高的亲水性的情况下，HLB值更优选为15以上，进一步优选为20～40。

另外，本说明书中，HLB值是指由化合物的有机性的值与无机性的值的比率计算的值(小田式)，可以通过“Formulation Design withOrganic Conception Diagram”[1998年，NIHON EMULSION CO.，LTD]中记载的计算方法进行计算。例如，后述的制造例1中记载的N－1－1的共聚物中含有的亲水性重复单元的HLB值为(100×3+60×1+140×1)/(20×10+40×1－10×3)×10＝23.8。

另外，重复单元(A)没有特别限定，从防止非特异性吸附的观点出发，优选非离子性的。

另外，重复单元(A)，除了亚磺酰基之外，还可以具有羟基、羧基、氨基、磺基、硫醇基、磷酸基、醛基等亲水性基团。另外，该亲水性基团的位置和个数是任意的，但其位置优选为聚合物的侧链。另一方面，作为亚磺酰基以外的亲水性基团的个数，从得到适度的亲水性的观点出发，在1个重复单元中，优选0～12个，更优选0～10个，进一步优选0～5个，更进一步优选0～3个，再进一步优选1～3个，特别优选2或者3个。另外，上述亲水性基团中，从得到适度的亲水性的观点出发，优选羟基。应予说明，在不丧失本发明的效果的范围，聚合物中含有的多个亚磺酰基的一部分可以为硫醚基、磺酰基。

另外，作为上述重复单元(A)的优选的具体例，可举出侧链中含有至少一个下述式(1)表示的结构的重复单元。作为形成侧链中具有式(1)表示的结构的重复单元的聚合物种，可以使用公知的聚合物，其中优选(甲基)丙烯酸酯系的聚合物种、(甲基)丙烯酰胺系的聚合物种、苯乙烯系的聚合物种等。更具体而言，可举出下述式(2)表示的重复单元。

〔式(1)中，R³表示直接键合或者碳原子数1～24的2价的有机基团，R⁴表示碳原子数1～10的有机基团。〕

〔式(2)中，R¹表示氢原子或者甲基，R²表示－O－基、*－(C＝O)－O－基、*－(C＝O)－NR⁵－基、*－NR⁵－(C＝O)－基(R⁵表示氢原子或者碳原子数1～10的有机基团，*表示与式(2)中的R¹所键合的碳原子键合的位置)或者亚苯基，R³和R⁴与上述含义相同。〕

这里，对式(1)和(2)中的各符号进行详细说明。

R¹表示氢原子或者甲基，优选甲基。

另外，R²表示－O－基、*－(C＝O)－O－基、*－(C＝O)－NR⁵－基、*－NR⁵－(C＝O)－基或者亚苯基。作为该亚苯基，可举出1,2－亚苯基、1,3－亚苯基、1,4－亚苯基。

另外，上述R⁵表示的有机基团的碳原子数优选为1～10，更优选为2～8，进一步优选为2～6。作为上述有机基团，可举出烃基。该烃基是包含脂肪族烃基、脂环式烃基以及芳香族烃基的概念。

上述R⁵中的脂肪族烃基可以是直链状也可以是支链状，具体而言，可举出甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基、庚基、辛基等烷基。

另外，上述脂环式烃基大致分为单环的脂环式烃基和桥环烃基。作为上述单环的脂环式烃基，可举出环丙基、环己基等环烷基。另外，作为桥环烃基，可举出异冰片基等。

另外，作为上述芳香族烃基，可举出苯基等芳基。

像上述那样的R²中，从非特异性吸附抑制效果的观点出发，优选*－(C＝O)－O－基、亚苯基，特别优选*－(C＝O)－O－基。

R³表示直接键合或者碳原子数1～24的2价的有机基团。作为该直接键合，可举出单键。

这样的R³中，优选碳原子数1～24的2价有机基团。该2价有机基团的碳原子数优选为2～18，更优选为2～10，进一步优选为2～9，特别优选为3～6。

作为上述2价有机基团，可举出2价烃基。2价烃基优选为2价脂肪族烃基，可以是直链状，也可以是支链状。具体而言，可举出甲烷－1,1－二基、乙烷－1,1－二基、乙烷－1,2－二基、丙烷－1,1－二基、丙烷－1,2－二基、丙烷－1,3－二基、丙烷－2,2－二基、丁烷－1,2－二基、丁烷－1,3－二基、丁烷－1,4－二基、戊烷－1,4－二基、戊烷－1,5－二基、己烷－1,5－二基、己烷－1,6－二基、庚烷－1,7－二基、辛烷－1,8－二基等链烷二基。

另外，上述2价烃基可以具有取代基，也可以在碳－碳键间含有醚键。

作为上述2价的烃基可以具有的取代基，可举出上述亲水性基团。该取代基的个数优选为1～5，更优选为1～3，进一步优选为1或者2。

另外，作为上述2价的烃基可以含有的醚键的个数，优选0～5，更优选0～3。

另外，作为2价的有机基团的优选的具体例，可举出下述式(3)表示的连接基团、碳原子数1～24的链烷二基，更优选为式(3)表示的连接基团。

〔式(3)中，R⁶表示单键、－R⁸－O－基(R⁸表示碳原子数1～4的链烷二基)或者下述式(4)表示的连接基团，R⁷表示碳原子数1～4的链烷二基，n表示1或者2，**表示与式(1)、(2)中的硫原子键合的位置。〕

〔式(4)中，R⁹表示碳原子数1～4的链烷二基，R¹⁰表示碳原子数2或者3的链烷二基，m¹表示1或者2，m²表示1～3的整数。〕

作为上述R⁶，优选单键、－R⁸－O－基，特别优选单键。

另外，上述R⁷、R⁸以及R⁹表示的链烷二基的碳原子数为1～4，优选1或者2。

另外，上述链烷二基可以是直链状，可以是支链状，可举出与前述的链烷二基相同的基团。

另外，上述R¹⁰表示的链烷二基的碳原子数优选为2。另外，作为该链烷二基，可举出与R⁷表示的基团相同的基团。应予说明，m²为2或者3时，m²个的R¹⁰可以相同也可以不同。

另外，作为n和m¹，优选1，作为m²，优选1或者2。

另外，R⁴表示碳原子数1～10的有机基团。作为该有机基团，可举出与R⁵表示的基团相同的基团。另外，R⁴为烃基时，该烃基可以具有取代基，作为该取代基和其个数，可举出与上述2价的烃基可以具有的取代基和个数相同的例子。另外，从亲水性的观点出发，作为R⁴，优选不包含环烷基、芳基、芳烷基等环结构。

作为上述那样的R⁴的优选的具体例，可举出具有上述亲水性基团的碳原子数1～10的有机基团，更优选为下述式(5)表示的1价的基团、碳原子数1～10的烷基，进一步优选为式(5)表示的1价的基团。

〔式(5)中，k¹表示1～4的整数，k²表示0～4的整数，***表示与式(1)，(2)中的硫原子键合的位置。〕

式(5)中，作为k¹，优选1或者2。另外，作为k²，优选0～2的整数，更优选0或者1。

另外，作为重复单元(A)的合计含量的下限，从赋予水溶性、非特异性吸附抑制效果的观点出发，全部重复单元中，优选10摩尔％以上，更优选40摩尔％以上。特别是，本发明的聚合物含有由苯乙烯类衍生的重复单元作为后述的重复单元(B)时，重复单元(A)的合计含量的下限更优选为50摩尔％以上，进一步优选为60摩尔％以上，进一步优选为65摩尔％以上。

另一方面，作为上限，从水溶性赋予、与基材的吸附的观点出发，全部重复单元中，优选99摩尔％以下，更优选90摩尔％以下，特别优选85摩尔％以下。特别是，本发明的聚合物含有由苯乙烯类衍生的重复单元作为后述的重复单元(B)时，重复单元(A)的合计含量的上限更优选为80摩尔％以下，进一步优选为70摩尔％以下。

另外，作为以质量％计的重复单元(A)的合计含量的下限，从赋予水溶性、非特异性吸附抑制效果的观点出发，全部重复单元中，优选20质量％以上，更优选35质量％以上，进一步优选50质量％以上，更进一步优选60质量％以上，特别优选70质量％以上。特别是，本发明的聚合物含有由苯乙烯类衍生的重复单元作为后述的重复单元(B)时，重复单元(A)的合计含量的下限更优选为75质量％以上，进一步优选为80质量％以上。

另一方面，作为上限，从赋予水溶性、与基材的吸附的观点出发，全部重复单元中，优选99质量％以下，更优选98质量％以下，进一步优选95质量％以下，特别优选90质量％以下。

应予说明，重复单元(A)的含量可以通过¹³C－NMR等测定。

另外，作为本发明的聚合物，进一步优选含有疏水性重复单元(以下，也称为重复单元(B))。这里，疏水性是指具有与水的亲和性低的性质。具体而言，仅由1种重复单元构成的均聚物(由实施例的测定法得到的数均分子量为1万～10万左右的均聚物)在常温(25℃)下在纯水100g中溶解的量小于1g的情况下，该重复单元是疏水性的。

另外，作为上述重复单元(B)的HLB值，得到高疏水性的情况下，优选小于20，更优选小于15，进一步优选0.1以上且小于10。

作为重复单元(B)，可举出显示疏水性的公知的单元，没有特别限定，优选由选自苯乙烯类、(甲基)丙烯酸酯类和(甲基)丙烯酰胺类中的1种以上的单体衍生的单元。

作为上述由苯乙烯类衍生的重复单元，优选下述式(6)表示的重复单元。

〔式(6)中，R¹¹表示氢原子或者甲基，R¹²表示碳原子数1～10的有机基团，p表示0～5的整数。〕

式(6)中，作为R¹²表示的有机基团，可举出与R⁵表示的基团相同的基团，其碳原子数优选为1～6，更优选为1～3。另外，优选没有亲水性基团。应予说明，该有机基团可以被碳原子数1～3的烷氧基等取代。另外，p为2～5的整数时，p个的R¹²可以相同也可以不同。

另外，p表示0～5的整数，优选0～3，更优选0。

作为由苯乙烯类衍生的重复单元的具体例，可举出来自苯乙烯、4－甲基苯乙烯、2,4－二甲基苯乙烯、2,4,6－三甲基苯乙烯、4－乙基苯乙烯、4－异丙基苯乙烯、4－叔丁基苯乙烯、α―甲基苯乙烯等的重复单元。

另外，作为上述(甲基)丙烯酸酯类，例如，可举出(甲基)丙烯酸甲酯、(甲基)丙烯酸乙酯、(甲基)丙烯酸异丁酯、(甲基)丙烯酸2－乙基己酯等(甲基)丙烯酸C_1-10烷酯；(甲基)丙烯酸环己酯等(甲基)丙烯酸C_6-10环烷基酯；(甲基)丙烯酸1－甲氧基乙酯、(甲基)丙烯酸2－甲氧基乙酯等(甲基)丙烯酸C_1-10烷氧基C_1-10烷基酯；(甲基)丙烯酸1－金刚烷酯、(甲基)丙烯酸1－甲基－(1－金刚烷基乙基)酯、(甲基)丙烯酸三环[5.2.1.0^2,6]癸烷－8－基酯等具有碳原子数8～16的桥环烃基的(甲基)丙烯酸酯等。另外，这些(甲基)丙烯酸酯类中，作为上述C_1-10烷基，优选C_1-8烷基，作为上述C_6-10环烷基，优选C_6-8环烷基，作为上述C_1-10烷氧基，优选C_1-6烷氧基，作为碳原子数8～16的桥环烃基，优选碳原子数8～12的桥环烃基。

另外，作为(甲基)丙烯酸酯类，可以使用在末端具有(甲基)丙烯酰氧基的聚苯乙烯的大分子单体、在末端具有(甲基)丙烯酰氧基的聚(甲基)丙烯酸甲酯的大分子单体(东亚合成株式会社制大分子单体AA－6等)、在末端具有(甲基)丙烯酰氧基的聚(甲基)丙烯酸丁酯的大分子单体(东亚合成株式会社制大分子单体AB－6等)、在末端具有(甲基)丙烯酰氧基的聚二甲基硅氧烷的大分子单体(信越化学工业株式会社制改性硅油X－22－2475等)等在末端具有(甲基)丙烯酰氧基的大分子单体。通过使用这些大分子单体而得到接枝共聚物。

另外，上述(甲基)丙烯酸酯类中，优选具有碳原子数8～16的桥环烃基的(甲基)丙烯酸酯、(甲基)丙烯酸C_1-10烷氧基C_1-10烷酯，(甲基)丙烯酸C_1-10烷酯、在末端具有(甲基)丙烯酰氧基的大分子单体，更优选具有碳原子数8～16的桥环烃基的(甲基)丙烯酸酯、(甲基)丙烯酸C_1-10烷氧基C_1-10烷酯、(甲基)丙烯酸C_1-10烷酯，进一步优选具有碳原子数8～16的桥环烃基的(甲基)丙烯酸酯、(甲基)丙烯酸C_1-10烷酯，特别优选(甲基)丙烯酸C_1-10烷酯。

另外，作为上述(甲基)丙烯酰胺类，例如，可举出N,N－二C_1-10烷基(甲基)丙烯酰胺；N－异丙基(甲基)丙烯酰胺等N－C_1-10烷基(甲基)丙烯酰胺；N－(1,1－二甲基－2－乙酰基乙基)(甲基)丙烯酰胺等N－C_1-10烷酰基C_1-10烷基(甲基)丙烯酰胺以及(甲基)丙烯酰基哌啶等。另外，这些(甲基)丙烯酰胺类中，作为上述C_1-10烷基，优选C_3-10烷基，作为上述C_1-10烷酰基，优选C_1-6烷酰基。

另外，作为重复单元(B)的合计含量的下限，从与基材吸附的观点出发，全部重复单元中，优选1摩尔％以上，更优选10摩尔％以上，进一步优选15摩尔％以上。特别是重复单元(B)为由苯乙烯类衍生的重复单元时，重复单元(B)的合计含量的下限更优选为20摩尔％以上，进一步优选为30摩尔％以上。

另一方面，作为上限，从水溶性赋予、非特异性吸附抑制的观点出发，全部重复单元中，优选90摩尔％以下，更优选80摩尔％以下，进一步优选70摩尔％以下，更进一步优选60摩尔％以下。特别是重复单元(B)为由苯乙烯类衍生的重复单元时，重复单元(B)的合计含量的上限更优选为50摩尔％以下，进一步优选为40摩尔％以下，进一步优选为35摩尔％以下。

另外，作为以质量％计的重复单元(B)的合计含量的下限，从与基材的吸附的观点，全部重复单元中，优选1质量％以上，更优选2质量％以上，进一步优选3质量％以上，进一步优选5质量％以上，特别优选10质量％以上。

另一方面，作为上限，从水溶性赋予、非特异性吸附抑制的观点出发，全部重复单元中，优选80质量％以下，更优选65质量％以下，进一步优选50质量％以下，更进一步优选40质量％以下，特别优选30质量％以下。特别是重复单元(B)为由苯乙烯类衍生的重复单元时，重复单元(B)的合计含量的上限更优选为20质量％以下，进一步优选为18质量％以下。

应予说明，重复单元(B)的含量与重复单元(A)的含量同样地测定即可。

另外，作为聚合物中含有的重复单元(A)与重复单元(B)的摩尔比〔(A):(B)〕，从非特异性吸附抑制效果的观点出发，优选10:30～99:1，更优选10:20～99:1。特别是重复单元(B)为由苯乙烯类衍生的重复单元时，进一步优选10:15～50:1，更进一步优选10:10～10:1，特别优选10:8～10:3。

另外，作为上述重复单元(A)与重复单元(B)的质量比＜(A):(B)＞，从非特异性吸附抑制效果的观点出发，优选40:60～99:1，更优选55:45～99:1，进一步优选60:40～99:1。特别是重复单元(B)为由苯乙烯类衍生的重复单元时，进一步优选70:30～98:2，特别优选75:25～90:10。

另外，作为上述亲水性重复单元(A)和疏水性重复单元(B)的组合，从非特异性吸附抑制效果的观点出发，

优选以下组合：

(A)式(2)表示的亲水性重复单元:60～99质量％

(B)由选自苯乙烯类、(甲基)丙烯酸酯类和(甲基)丙烯酰胺类中的1种以上的单体衍生的疏水性重复单元:1～40质量％；

更优选以下组合：

(A)式(2)表示的、式(2)中的侧链部的羟基的个数为0～3个的亲水性重复单元:60～99质量％

(B)由选自苯乙烯类、具有碳原子数8～16的桥环烃基的(甲基)丙烯酸酯、(甲基)丙烯酸C_1-10烷氧基C_1-10烷基酯、(甲基)丙烯酸C_1-10烷基酯和(甲基)丙烯酰胺类中的1种以上的单体衍生的疏水性重复单元:1～40质量％；

进一步优选以下组合：

(A)式(2)表示的、式(2)中的侧链部的羟基的个数为1～3个的亲水性重复单元:60～99质量％

(B)由选自苯乙烯类、具有碳原子数8～16的桥环烃基的(甲基)丙烯酸酯、(甲基)丙烯酸C_1-10烷基酯和(甲基)丙烯酰胺类中的1种以上的单体衍生的疏水性重复单元:1～40质量％；

特别优选以下组合：

(A)式(2)表示的、式(2)中的侧链部的羟基的个数为1～3个且式(2)中的R²为*－(C＝O)－O－基的亲水性重复单元:70～99质量％

(B)由选自苯乙烯类、(甲基)丙烯酸C_1-10烷基酯和(甲基)丙烯酰胺类中的1种以上的单体衍生的疏水性重复单元:1～30质量％。

另外，本发明的聚合物可以具有上述重复单元(A)以外的亲水性重复单元(C)。作为这样的亲水性重复单元(C)，可举出由阴离子性的单体(阴离子性单体)、阳离子性的单体(阳离子性单体)或者非离子性的单体(非离子性单体)衍生的基团，它们可以含有1种或者2种以上。

作为上述阴离子性单体，可举出乙烯基苯甲酸、(甲基)丙烯酸等不饱和羧酸单体；苯乙烯磺酸、2－丙烯酰胺－2－甲基丙烷磺酸、异戊二烯磺酸等不饱和磺酸单体。如果使用不饱和磺酸单体，能够提高作为免疫诊断试剂的稀释液使用时的非特异性被检测物的信号抑制效果。

另外，作为阳离子性单体，可举出烯丙基胺、氨基苯乙烯、N,N－二甲基氨基丙基(甲基)丙烯酰胺氯甲基季铵盐等具有伯～季氨基和不饱和键的单体。

另外，作为非离子性单体，可举出(甲基)丙烯酸羟基乙酯、(甲基)丙烯酸甘油酯、(甲基)丙烯酸聚氧乙烯酯等具有羟基的不饱和羧酸酯单体；N－(2－羟基乙基)(甲基)丙烯酰胺等具有羟基的(甲基)丙烯酰胺单体。

作为上述重复单元(C)的合计含量，全部重复单元中，优选0～49摩尔％，更优选0～20摩尔％，进一步优选0～10摩尔％，特别优选0～1摩尔％。另外，以质量％计，优选0～49质量％，更优选0～20质量％，进一步优选0～10质量％，特别优选0～1质量％。

另外，本发明的聚合物为共聚物时，其重复单元的排列的方式没有特别限定，共聚物可以是嵌段共聚物、接枝共聚物、无规共聚物、交替共聚物中任一种。

另外，作为本发明的聚合物的两末端，优选氢原子、烷基、羟基、RAFT剂残基。

另外，作为本发明的聚合物的数均分子量(M_n)，优选5000～100万，更优选7000～20万，特别优选1万～15万。通过使数均分子量为5000以上，非特异性吸附抑制效果提高，另一方面，通过为100万以下，涂布性、处理性提高。

另外，作为分子量分布(M_w/M_n)，优选1.0～5.0，更优选1.0～4.0，进一步优选1.0～3.0，特别优选1.5～2.5。

应予说明，上述数均分子量和分子量分布可以根据后述的实施例中记载的方法进行测定。

另外，作为本发明的聚合物，从非特异性吸附抑制效果的观点出发，优选水溶性的聚合物。这里，本说明书中，水溶性是指将聚合物以成为1质量％的聚合物固体成分的方式添加·混合到水(25℃)中时通过目视观察为透明的性质。

另外，作为本发明的聚合物，优选非离子性的聚合物。

另外，作为本发明的聚合物，从赋予水溶性、非特异性吸附抑制效果的观点出发，优选HLB值为10～22的范围。

接下来，对本发明的聚合物的制造方法进行说明。

本发明的聚合物可以通过如下方式制造:(1)在公知的聚合物的侧链中导入硫醚基，将该硫醚基转变为亚磺酰基，(2)在聚合时使侧链部分具有硫醚基的单体聚合或者与其它单体共聚，将得到的(共)聚合物的硫醚基转变为亚磺酰基，(3)或者在聚合时使侧链部分具有亚磺酰基的单体聚合或者与其它单体共聚等。

举出下述共聚物(N－1)的制造方法为例对上述制造方法进行具体说明。

即，通过工序1－A－1和工序1－A－2，或者通过工序1－B或工序1－C，得到共聚物(S－1)，使用该共聚物经由共聚物(G－1)得到共聚物(N－1)。

(式中的各符号与上述含义相同。)

＜工序1－A－1＞

工序1－A－1是使化合物(A－1－1)与化合物(B－1)在聚合引发剂的存在下聚合而得到共聚物(M－1)的工序。

作为化合物(A－1－1)，例如，可举出(甲基)丙烯酸等，它们可以单独使用1种或者组合2种以上使用。

另外，作为化合物(B－1)，可举出上述苯乙烯类，作为其合计使用量，相对于化合物(A－1－1)，优选0.001～1.5摩尔当量，更优选0.005～0.8摩尔当量，进一步优选0.02～0.8摩尔当量，特别优选0.3～0.8摩尔当量。

另外，作为上述聚合引发剂，例如，可举出2,2'－偶氮二异丁腈、二甲基2,2'－偶氮二(2－甲基丙酸酯)、2,2'－偶氮二(4－甲氧基－2,4－二甲基戊腈等偶氮系引发剂；过氧化双(3,5,5－三甲基己酰)，过氧化苯甲酰等过氧化物，这些聚合引发剂可以单独使用1种或者组合2种以上使用。

聚合引发剂的合计使用量相对于化合物(A－1－1)，通常为0.0002～0.2质量倍左右。

另外，工序1－A－1中可以使用溶剂、链转移剂。作为溶剂，可举出二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、N－甲基吡咯烷酮等酰胺系溶剂；二甲基亚砜等的亚砜系溶剂；乙酸乙酯、乙酸丁酯、γ－丁内酯等酯系溶剂；甲苯、苯等芳香族系溶剂；1,4－二烷、二乙醚等醚系溶剂，这些溶剂可以单独使用1种或者组合2种以上使用。这些溶剂的合计使用量相对于化合物(A－1－1)通常为0.5～15质量倍左右。

另外，作为上述链转移剂，可举出巯基乙醇、硫代甘油、叔十二烷基硫醇等。

另外，工序1－A－1的反应时间没有特别限定，通常为0.5～24小时左右，反应温度可以在溶剂的沸点以下适当地选择，但通常为0～120℃左右。

＜工序1－A－2＞

工序1－A－2是将工序1－A－1中得到的共聚物(M－1)的－R²对化合物(C－1)的缩水甘油基或者环氧丙烷基进行开环加成而得到共聚物(S－1)的工序。

作为工序1－A－2中使用的化合物(C－1)，可举出乙二醇二缩水甘油醚、丙二醇二缩水甘油醚等，作为其合计使用量，相对于共聚物(M－1)中的由化合物(A－1－1)衍生的重复单元，优选1.5～10摩尔当量，更优选2～5摩尔当量。

另外，工序1－A－2优选在催化剂存在下进行。作为催化剂，可举出四丁基溴化铵等季铵盐；四丁基溴化、四丁基氯化等季盐，这些催化剂可以单独使用1种或者组合2种以上使用。

上述催化剂的合计使用量，相对于共聚物(M－1)中的由化合物(A－1－1)衍生的重复单元，通常为0.01～0.2摩尔当量左右。

另外，作为适用于工序1－A－2的溶剂，可举出与工序1－A－1相同的溶剂。

另外，工序1－A－2的反应时间没有特别限定，通常1～24小时左右，反应温度可以在溶剂的沸点以下适当地选择，通常为40～200℃左右。

＜工序1－B和工序1－C＞

工序1－B和工序1－C是使化合物(A－1－2)或者化合物(A－1－3)和化合物(B－1)在聚合引发剂的存在下聚合而得到共聚物(S－1)的工序。

作为化合物(A－1－2)，例如，可举出(甲基)丙烯酸缩水甘油酯，环氧丙烷基(甲基)丙烯酸酯，作为化合物(A－1－3)，可举出乙烯基苄基缩水甘油基醚、4－羟基丁基(甲基)丙烯酸酯缩水甘油基醚等。应予说明，这些可以单独使用1种或者组合2种以上使用。

工序1－B和工序1－C可以与上述工序1－A－1同样地进行。

应予说明，可以在上述工序1－A－1、1－A－2、工序1－B、工序1－C之前，预先使RAFT剂与单体中的一方反应来合成嵌段共聚物。作为RAFT剂，可举出三硫代碳酸十二烷基氰基甲酯、2－甲基－2－[(十二烷基硫烷基硫代羰基)硫烷基]丙酸、三硫代碳酸2－氰基－2－丙基十二烷基酯等。这些RAFT剂的使用量相对于上述单体通常为0.00001～0.1质量倍等量。

另外，化合物(B－1)也可以变更为衍生出前述的重复单元(B)的化合物而共聚，可以使用大分子单体作为该化合物来合成接枝共聚物。

＜工序2＞

工序2是使－SR⁴对工序1－A－2、工序1－B或者工序1－C中得到的共聚物(S－1)的缩水甘油基或者环氧丙烷基进行开环加成而得到共聚物(G－1)的工序。

作为工序2中使用的R⁴SH表示的化合物，可举出硫代甘油、巯基乙醇，从亲水性提高的观点出发，优选硫代甘油。

上述化合物的合计使用量，相对于由化合物(A－1－1)、(A－1－2)或者(A－1－3)衍生的重复单元，通常为0.1～20摩尔当量，优选为1～10摩尔当量。

另外，工序2优选在催化剂存在下进行。作为催化剂，可举出三乙基胺、N,N－二甲基－4－氨基吡啶等碱性催化剂，这些催化剂可以单独使用1种或者组合2种以上使用。

上述催化剂的合计使用量，相对于由化合物(A－1－1)、(A－1－2)或者(A－1－3)衍生的重复单元，通常为0.01～32摩尔当量。

另外，工序2优选在溶剂存在下进行。作为溶剂，除了可在工序1中使用的溶剂，还可举出乙醇、甲醇等醇系溶剂，或者它们的混合溶剂，其合计使用量相对于共聚物(S－1)通常为0.5～20质量倍左右。

另外，工序2的反应时间没有特别限定，通常为1～8小时左右，反应温度可以在溶剂的沸点以下适当地选择，通常为40～100℃左右。

应予说明，可以在工序1－B或者工序1－C之前实施工序2，其后实施工序1－B或者工序1－C的聚合。

＜工序3＞

工序3是使用氧化剂将工序2中得到的共聚物(G－1)的硫醚基转变为亚磺酰基而得到共聚物(N－1)的工序。应予说明，在不丧失本发明的效果范围内，共聚物中含有的多个亚磺酰基的一部分可以成为硫醚基、磺酰基。

上述氧化剂大致分为有机氧化剂和无机氧化剂，作为有机氧化剂，例如，可举出过乙酸、过苯甲酸、间氯过苯甲酸等。另一方面，作为无机氧化剂，例如，可举出过氧化氢、铬酸、高锰酸盐等。应予说明，这些氧化剂可以单独使用1种或者组合2种以上使用。

另外，氧化剂的使用量相对于由化合物(A－1－1)、(A－1－2)或者(A－1－3)衍生的重复单元，通常为1.0～10.0摩尔当量左右，优选为1.0～2.0摩尔当量。

工序3优选在溶剂存在下进行。作为该溶剂，可举出水；二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺等酰胺系溶剂；甲醇、乙醇等醇系溶剂等，这些溶剂可以单独使用1种或者组合2种以上使用，但优选水、醇系溶剂。

上述溶剂的合计使用量相对于共聚物(G－1)，通常为1～20质量倍左右，优选为1～15质量倍。

另外，工序3的反应时间没有特别限定，通常1～24小时左右，反应温度可以在溶剂的沸点以下适当地选择，通常为25～70℃左右。

应予说明，上述各工序中，各反应生成物的分离，根据需要，可以将过滤、清洗、干燥、重结晶、再沉淀、透析、离心分离、利用各种溶剂进行的提取、中和、色谱等通常的手段适当地组合来进行。

聚合物以溶解于水、甲醇、乙醇、异丙醇等醇系溶剂、水与醇的混合物等溶剂而成的聚合物溶液的形式使用。该聚合物溶液中的聚合物的含量相对于溶剂100质量份，优选0.001～15质量份，更优选0.01～10质量份。

[载体]

作为本发明中使用的载体，是能够用于免疫测定、在水系介质中稳定的不溶性的载体几即可，形状没有特别限定。例如，可举出磁性物质本身等的粉末、树脂中含有磁性物质的磁性粒子等粒子、网眼状、无纺布等滤网、薄片状、纤维状等。从少量的被检测物高灵敏度地检测生物标记物的情况下，从分离、清洗的容易性的观点出发，优选磁性物质或者树脂中含磁性物质的磁性粒子。作为磁性粒子，可以使用公知的磁性粒子，没有特别限定。

[磁性粒子]

作为磁性粒子，只要是能够因磁感应而容易磁化，就没有特别限制，例如，可举出四氧化三铁(Fe₃O₄)、三氧化二铁(γ－Fe₂O₃)、各种铁氧体、铁、锰、镍、钴、铬等金属、由钴、镍、锰等合金构成的磁性物质微粒、或者内部含有这些磁性物质的疏水性聚合物、亲水性聚合物等，优选地可举出以下磁性粒子，即，日本特开2008－32411号公报中记载的在含有超顺磁性微粒的母粒子的表面形成疏水性的第1聚合物层，在该第1聚合物层上形成至少在表面具有缩水甘油基的第2聚合物层，将该缩水甘油基进行化学修饰，由此导入了包含1个以上选自氧原子、氮原子和硫原子中的至少1种的原子的极性基团的磁性粒子。这里，作为超顺磁性微粒，代表性的是粒径20nm以下(优选为粒径5～20nm)的氧化铁系的微粒，可举出以MnFe₂O₄(Mn＝Co、Ni、Mg、Cu、Li_0.5Fe_0.5等)表现的铁氧体、以Fe₃O₄表现的磁铁矿或者γ－Fe₂O₃，优选包含饱和磁化强且残留磁化少的γ－Fe₂O₃和Fe₃O₄中的任一方。

另外，作为用于形成疏水性的第1聚合物层的单体，作为单官能性单体，例如可以例示苯乙烯、α－甲基苯乙烯、卤代苯乙烯等芳香族乙烯基单体，丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸乙酯、丙烯酸硬脂基酯、甲基丙烯酸硬脂基酯、丙烯酸环己酯、甲基丙烯酸环己酯、丙烯酸异冰片酯、甲基丙烯酸异冰片酯等烯键式不饱和羧酸烷基酯等。另外，作为交联性单体，可以例示乙二醇二丙烯酸酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯、三羟甲基丙烷三丙烯酸酯、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、季戊四醇三丙烯酸酯、季戊四醇三甲基丙烯酸酯、二季戊四醇六丙烯酸酯、二季戊四醇六甲基丙烯酸酯等多官能性(甲基)丙烯酸酯，丁二烯、异戊二烯等共轭二烯烃，二乙烯基苯、邻苯二甲酸二烯丙酯、丙烯酸烯丙酯、甲基丙烯酸烯丙酯等。

用于形成第2聚合物层的单体，以向粒子表面导入官能团为主要目的而含有20质量％以上的含缩水甘油基单体。通过将含有规定量的含缩水甘油基单体的第2单体部与第1单体部聚合，能够得到具有2个以上的缩水甘油基的第2聚合物层。这里，作为含缩水甘油基的共聚性单体，可以例示丙烯酸缩水甘油酯、甲基丙烯酸缩水甘油酯、烯丙基缩水甘油基醚等。

作为通过将第2聚合物层的缩水甘油基化学修饰而导入的极性基团，优选为可与抗原或者抗体反应的官能团，例如，优选为选自氨基、醛基、羧基和活性酯基中的至少1个。例如，得到的磁性粒子的第2聚合物层具有上述极性基和2,3－羟基丙基时，与抗原或者抗体的键合性良好。

[在表面具有聚合物的载体的制造方法]

本发明的在表面具有聚合物的载体，是用含有具有亚磺酰基的重复单元的聚合物处理上述载体而成的，可以使载体与该聚合物接触来制造，所述聚合物含有具有亚磺酰基的重复单元。

在免疫测定使用的载体上担载能够与测定对象物质特异性结合的配体例如抗体或者抗原，与聚合物的接触，可以在该配体的担载之前也可以在之后。

应予说明，对于载体上的配体的担载，例如，测定对象物质为抗原时，可担载能与其特异性结合的抗体，但作为该抗体，优选使用IgG，也可以使用F(ab’)2、Fab’、Fab等低分子化了的抗体。另外，不仅可以使用IgG，还可以使用IgM或者以与IgG相同的处理将IgM低分子化的片段。另外，单克隆抗体、多克隆抗体均可使用。

作为将配体固定于载体的方法，可使用物理吸附法，共价键法、离子键法之类的化学担载的方法等。作为物理吸附法，可举出将配体直接固定于载体的方法、与白蛋白等其它蛋白质化学键合后使其吸附而固定的方法等。

作为化学担载的方法，可举出利用可以通过将存在于载体表面的氨基、羧基、巯基、羟基、醛基、环氧基等进行化学修饰而能与抗体、抗原等配体分子键合的官能团，直接固定在载体上的方法；在载体与抗体、抗原等配体分子之间以化学键导入间隔分子(碳二亚胺化合物等)并固定的方法；使抗体、抗原等配体与白蛋白等其他蛋白质键合后，使该蛋白质与载体化学键合的方法等。

利用聚合物对该载体进行的处理，只要能够使聚合物与载体的表面接触规定时间，其手段就没有限定，例如，通过将载体浸渍于聚合物或者聚合物溶液中来进行。更详细而言，如下述(1)、(2)。

(1)使载体接触含有聚合物的溶液，残留有分散介质的状态下在溶液中使聚合物物理吸附于载体表面，其后，连同多余的聚合物将溶液除去的方法

(2)使载体接触含有聚合物的溶液后，除去溶剂，使聚合物的干燥膜形成于载体表面的方法

例如可以使磁性粒子分散在聚合物溶液中后，利用磁力收集磁性粒子而除去上清液，再次利用水、缓冲液使磁性粒子再分散等方法来进行。聚合物的使用量相对于载体100质量份，优选使用0.01～1000质量份，更优选使用0.1～500质量份。

浸渍优选通过分散、搅拌1～60分左右，更优选2～10分左右而进行。

对担载有配体的载体进行聚合物处理时，可以与免疫反应分开地预先进行，另外，也可以在进行免疫测定的反应容器中进行。在进行免疫测定的反应容器中进行聚合物处理时，优选在进行捕获反应前使聚合物接触磁性粒子的表面规定时间。这时，聚合物的使用量在反应体系中，优选0.01～2.00质量％，更优选0.1～0.5质量％。

在反应容器中进行利用聚合物进行的处理时，不仅磁性粒子表面被聚合物处理，反应容器也被表面处理，能够防止免疫反应时的反应容器的污染，能够更有效地减少由干扰物质所致的非特异性阻碍。

本发明的生物物质的免疫学测定方法的特征在于，包含将测定对象物质捕获至载体的工序(以下，也称为反应工序)，上述载体是用上述的聚合物进行处理而在其表面具有聚合物的状态。优选进一步包含清洗含有上述载体的反应体系而进行B/F分离的工序(以下，也称为清洗工序)；测定捕获至上述载体的对象物质量的工序(以下，也称为测定工序)。这里，载体只要在捕获反应时是用聚合物处理的状态即可，可以使用预先用聚合物处理过的载体或者也可以与利用聚合物进行的处理一起进行捕获反应。

使用磁性粒子作为在表面具有聚合物的载体时，优选包含以下工序的形式。

(1)一种测定方法，其特征在于，是在同一反应容器中进行如下工序的生物物质的免疫学测定方法，所述工序是将测定对象物质捕获至磁性粒子的反应工序，清洗包含上述磁性粒子的反应体系而进行B/F分离的清洗工序，测定捕获至磁性粒子的对象物质的测定工序；使用被含有具有亚磺酰基的重复单元的聚合物处理过的粒子作为上述磁性粒子。

(2)一种测定方法，其特征在于，是在同一反应容器中进行如下工序的生物物质的免疫学测定方法，所述工序是将测定对象物质捕获至磁性粒子的反应工序，清洗包含上述磁性粒子的反应体系而进行B/F分离的清洗工序，测定捕获至磁性粒子的对象物质的测定工序；在反应容器内注入含有聚合物的溶液，接着添加上述磁性粒子，进行捕获反应，该聚合物含有具有亚磺酰基的重复单元。

以下，举出载体为磁性粒子的情况为例对各反应工序进行说明，本发明不限于限于此。

＜反应工序＞

通过使磁性粒子与测定对象物质反应，介由固定于磁性粒子上的配体，优选介由与测定对象物质特异性地结合的抗体或者抗原，将该测定对象物质捕获至磁性粒子。应予说明，该反应体系中可以共存可与测定对象物质特异性地结合的被标记的抗体。

反应通常在pH5～10、优选pH6～8左右进行，没有特别限定。为了维持目标的pH，通常，使用缓冲液，例如可例示磷酸、三(羟基甲基)氨基甲烷等，但不限于这些。

另外，反应通常在室温～42℃进行5～60分钟。

上述反应的反应体系中可以根据需要添加盐类、白蛋白等蛋白质、表面活性剂等。

另外，在反应容器中进行利用聚合物对磁性粒子的处理时，可以在该聚合物存在的状态下直接进行捕获反应。

应予说明，预先进行利用聚合物对磁性粒子的处理时，在适当的容器中，将含有聚合物溶液和磁性粒子的溶液分散1～60分钟左右，优选2～10分钟左右，搅拌后，回收磁性粒子，供给到上述的反应·测定工序。

＜清洗工序＞

上述捕获反应结束后，进行B/F分离，该B/F分离是对包含捕获了测定对象物质的磁性粒子的反应体系进行清洗，除去未反应的成分、未反应的标记物质等。

作为从磁性粒子清洗·分离除去未反应的物质的方法，可通过重复如下操作来进行:使磁场作用于反应容器，使磁性粒子附着于反应容器壁并收集后，除去反应上清液，进一步根据需要加入适当的清洗液(含有0.01％TritonX100的TBS(20mM的Tris缓冲液0.9％Saline，pH7.4)等)，同样地使磁场作用后除去上清液。

＜测定工序＞

上述清洗工序后，对捕获至磁性粒子的测定对象物质进行测定。测定可以利用公知的免疫测定法，即，酶免疫测定法(EIA)、放射免疫测定法(RIA)、荧光免疫测定法(FIA)等进行。例如，如果标记物质是化学发光物质或者荧光色素，通过测定标记物质所发出的发光或者荧光，如果标记物质是酶，通过测定该酶活性，从而能够对测定对象物质进行测定。另外，标记物质为放射性同位素(Radioisotope)时，测定标记物质的放射活性即可。

另外，测定法可以是夹心法、竞争法、双抗体法等任意手法，从灵敏度、特异性等方面出发，优选使用夹心法。

基于夹心法测定时，添加可与测定对象物质特异性地结合的被标记的抗体(第二抗体)，根据介由测定对象物质而固定于磁性粒子的第二抗体的标记物进行测定。

第二抗体的标记可以用放射性同位元素、酶、生物素、荧光物质、化学发光物质、金胶体、胶乳、铁氧体粒子等直接标记，如上所述，从安全性高、可期待良好的测定结果方面考虑，优选酶标记。作为优选的标记酶，可举出稳定性优异、容易测定酶活性的过氧化物酶、碱性磷酸酶、半乳糖苷酶等。

结合的第二抗体的检测或者定量可以根据任意的公知的方法进行。例如，可以对用酶、发光体、荧光体等标记的第二抗体本身进行直接检测或者测定，或者也可以使用相对于第二抗体特异性的第三抗体，预先利用各种方法标记该第三抗体，对第三抗体的标记进行检测或者定量。

作为优选的检测法，如上所述，可举出相对于酶标记的第二抗体，使特异性基质(显色基质、荧光基质、化学发光基质)与该酶反应，产生显色、荧光、发光等而用测定仪器检测其信号的方法，特别优选使用能够进行高灵敏度检测的化学发光基质的方法。

以下，对在反应容器中进行利用聚合物对磁性粒子的处理的情况的测定法进行说明。

聚合物与磁性粒子的接触可以是任意顺序，但为了一起有效地处理反应容器表面和磁性粒子表面，优选通常将聚合物溶液注入到反应容器中使聚合物与反应容器表面充分接触后，添加担载有可与测定对象物质特异性地结合的抗体或者抗原的磁性粒子。聚合物与磁性粒子的接触优选通过放置1～60分钟，优选放置2～10分钟左右来进行。

例如，使用夹心法作为测定手段时，可以采用以下所示的1步法或者2步法。

＜1步法＞

a)在反应容器中注入聚合物溶液，接着添加含有担载有配体(优选可与测定对象物质特异性地结合的抗体或者抗原)的磁性粒子的溶液，接着，添加测定对象物质和可与测定对象物质特异性地结合的被标记的抗体并使其反应的工序

b)工序a)结束后，清洗反应体系而进行B/F分离的工序

c)测定捕获至磁性粒子的目标物质的工序

＜2步法＞

d)在反应容器中注入聚合物溶液，接着添加含有担载有配体(优选可与测定对象物质特异性地结合的抗体或者抗原)的磁性粒子的溶液，接着，添加测定对象物质使其反应的工序

e)工序a)结束后，清洗反应体系而进行B/F分离的工序

f)添加可与测定对象物质特异性地结合的被标记的抗体并使其反应的工序

g)工序f)结束后，清洗反应体系而进行B/F分离的工序

h)测定捕获至磁性粒子的目标物质的工序

作为本发明中使用的反应容器，能够不变换地在免疫反应的全部工序中使用，就没有限定。例如，可举出玻璃或者塑料制的管、将多个管一体成形而成的专用托盘、微量滴定板、专门设计的一边清洗一边重复使用的全自动EIA测定装置用的反应管等。

[测定对象物质和试样]

上述免疫学测定方法中，成为测定对象的物质是生物体试样中存在的特定物质(也称为生物物质)，例如可举出蛋白质、肽、糖质、脂质等。具体而言，例如，可以例示HBs抗原、抗HBs抗体等病毒相关的抗原或者抗体；抗支原体抗体、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、军团杆菌、弯曲杆菌、幽门螺杆菌、MRSA等细菌相关的抗原或者抗体；C反应性蛋白质(CRP)、类风湿因子等炎症标志物；α－甲胎蛋白、CEA、CA19－9、PSA等肿瘤标志物；激素；过敏原、过敏原特异IgE抗体等过敏相关的抗原或者抗体等。

应予说明，作为生物体试样，没有特别限定，例如可举出血清、血浆、血液、脊髓液等各种体液、尿等排泄物，从粪便等的稀释物除去固体成分而得的试样，各种组织的提取液等。

实施例

以下，举出实施例对本发明进行详细说明，本发明不限于这些实施例。

实施例中的各分析条件如下所示。

＜分子量测定＞

重均分子量(Mw)和数均分子量(Mn)使用Tosoh株式会社制TSKgelα－M柱，在流量为0.5毫升/分钟、洗脱溶剂为NMP溶剂(H₃PO₄:0.016M，LiBr:0.030M)、柱温为40℃的分析条件下，利用以聚苯乙烯为标准的凝胶渗透色谱(GPC)进行测定。

＜NMR谱＞

¹³C－NMR谱，使用d₆－DMSO作为溶剂和内部标准物质，通过BRUKER制MODEL AVANCE500(500MHz)测定。

制造例1共聚物(N－1－1)的合成

按照以下的合成路线得到共聚物(N－1－1)。

将甲基丙烯酸缩水甘油酯6.79质量份和苯乙烯2.27质量份、作为聚合引发剂的2,2'－偶氮二(异丁腈)0.272质量份和N,N－二甲基甲酰胺18.9质量份混合并加入烧瓶中。向其中吹入氮气，升温到70℃，聚合6小时，其后冷却至室温。利用甲醇进行再沉淀精制该溶液，减压干燥，由此得到共聚物(S－1－1)。

得到的共聚物(S－1－1)中，由甲基丙烯酸缩水甘油酯衍生的重复单元的含量为67摩尔％，由苯乙烯衍生的重复单元的含量为33摩尔％。应予说明，这些含量通过¹³C－NMR测定。

接着，将得到的共聚物(S－1－1)1质量份及硫代甘油4.47质量份和N,N－二甲基甲酰胺9.45质量份混合并加入烧瓶中。边向其中吹入氮气边升温至60℃，添加作为催化剂的三乙胺16.7质量份后，使其反应4小时，其后冷却至室温。利用水进行再沉淀对该溶液进行精制，冷冻干燥，由此得到共聚物(G－1－1)。

接着，使得到的共聚物(G－1－1)0.1质量份分散于0.844质量份的水中，加入到烧瓶中。向其中添加0.056质量份的30％过氧化氢水溶液，室温下反应18小时。将得到的水溶液透析，由此得到共聚物(N－1－1)(收率:27％)。将该共聚物(N－1－1)和水混合，调整浓度为1质量％，结果共聚物(N－1－1)溶解在水中。

另外，得到的共聚物(N－1－1)的数均分子量为23300，分子量分布为2.17。

共聚物(N－1－1)的结构通过¹³C－NMR进行确认。

另外，N－1－1的HLB值为17.6。

制造例2磁性粒子的制作

2.1 核粒子的制作

将2质量份75％过氧化二(3,5,5－三甲基己酰)溶液(日油株式会社制“PEROYL 355－75(S)”，以下，称为“PEROYL”)混合到20质量份1质量％十二烷基硫酸钠水溶液中，用超声波分散机进行细乳化。将其加入装有13质量份粒径0.77μm的聚苯乙烯粒子和41质量份水的反应器中，25℃下搅拌12小时。在另一容器中将95质量份甲基丙烯酸甲酯(以下，称为“MMA”)和5质量份三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(以下，称为“TMP”)乳化在400质量份0.1％十二烷基硫酸钠水溶液中，加入上述反应器，40℃下搅拌2小时后，升温至75℃聚合8小时。冷却到室温后，通过离心分离仅将粒子取出，进一步进行水洗，干燥、粉碎。将该粒子作为核粒子A－1。粒径为1.5μm。应予说明，粒径是指用岛津株式会社制作所制激光衍射式粒度分布测定机SALD－2000测定的体积平均粒径，以下如果没有特别说明则相同。

2.2 母粒子的制作(磁性物质层的形成)

在油性磁性流体(商品名:“EXP系列”，Ferrotec株式会社制)中加入丙酮使粒子析出沉淀后，将其干燥，由此得到具有疏水化处理过的表面的铁氧体系的超顺磁性微粒(平均一次粒径:0.01μm)。

接着，将15质量份上述核粒子A－1和20质量份上述疏水化了的超顺磁性微粒用混合器充分混合，使用Hybridization systemNHS－0型(奈良机械制作所株式会社制)，以叶片(搅拌翼)的圆周速度100m/秒(16200rpm)将该混合物处理5分钟，得到表面具有由超顺磁性微粒构成的磁性物质层的母粒子A－2(粒径:1.7μm)。

2.3 对母粒子形成第1、第2聚合物层

将十二烷基苯磺酸钠0.5质量％水溶液375质量份投入到1L可分离式烧瓶中，接着，投入15质量份母粒子A－2，用均质机分散后，加热到60℃。向加入到另一容器中的100质量份十二烷基苯磺酸钠0.5质量％水溶液中加入18质量份MMA、2质量份TMP和0.4质量份PEROYL并使其分散而得到预乳液，将该预乳液用1小时30分钟滴加到控制在60℃的上述1L可分离式烧瓶中(以上，为第1聚合物层的形成)。

滴加结束后，保持60℃搅拌1小时后，向加入到另一容器的75质量份十二烷基苯磺酸钠0.5质量％水溶液中加入10.5质量份甲基丙烯酸缩水甘油酯、1.5质量份TMP和0.3质量份PEROYL并使其分散而得到预乳液，将预乳液用1小时30分钟滴加到控制在60℃的上述1L可分离式烧瓶。其后升温到75℃，进一步持续聚合2小时，结束反应(以上，为第2聚合物层的形成)。

接着，利用磁性将上述可分离式烧瓶中的粒子分离，使用蒸馏水清洗。通过以上的工序得到形成有具有缩水甘油基的第2聚合物层的磁性粒子A－3(体积平均粒径:2.7μm)。

在通过磁性从磁性粒子A－3的水分散液分离出的粒子1.0质量份中加入1质量％硫酸水溶液10质量份，间接照射20分钟超声波使其分散，接着，在60℃搅拌5小时(缩水甘油基的水解)。

接着，通过磁性将上述粒子分离，使其分散在纯水中进行磁性分离、清洗，重复上述操作5次，再干燥。用10ml的吡啶清洗所得到的干燥粒子1.0质量份后使其分散在5ml的吡啶中后，加入在25ml的吡啶中溶解有3质量份的琥珀酸酐的溶液，在60℃搅拌2小时(羧基的导入)。反应后，利用磁性将上述粒子分离，用丙酮清洗3次，接着用0.1M氢氧化钠水溶液清洗3次，再用蒸馏水清洗4次后，使其分散于蒸馏水中，得到含有1.0质量份的导入了羧基的磁性粒子Ca－1的10质量％分散液。

制造例3抗体结合磁性粒子的制作

将制造例2中得到的含有导入了羧基的磁性粒子Ca－1的分散液进行磁性分离并除去上清液，用0.1M MES(pH5.5)清洗2次。进行磁性分离并除去上清液，以每1mg粒子中抗体为10μg的方式加入0.1MMES(pH5.5)和抗体溶液(抗PSA(前立腺特异抗原)抗体)，再以每1mg粒子为100μg的方式加入EDC(1－乙基－3－二甲基氨基丙基碳二亚胺盐酸盐(同仁化学公司制)，3mg/mL)并在25℃颠倒混和2小时。反应结束后，进行磁性分离除去上清液，用Tris缓冲液/0.01％Triton X－100清洗2次。接着，进行磁性分离并除去上清液，将缓冲液置换为50mM的Tris缓冲液，再进行磁性分离除去上清液，悬浮在含有BSA的缓冲液(50mM的Tris缓冲液，pH7.5，1重量％BSA)中，制成抗体结合粒子分散液(磁性粒子浓度0.05重量％)。

实施例1

将在TBS缓冲液(50mM的Tris缓冲液，pH7.5)中溶解制造例1得到的共聚物(N－1－1)而成的溶液(2质量％)25μL分注到96孔白板(corning公司制)的各孔中，接着对将制造例3中制备的抗体结合磁性粒子分散到含有BSA的缓冲液中而成的分散液25μL进行分注，接着依次分注样品(人血清或者标准溶液(含有PSA抗原的溶液:0～25ng/mL)25μL和ALP(碱性磷酸酶)标记抗PSA抗体液)25μL，在25℃反应20分钟。通过磁性分离分离粒子后，使用96孔白板用洗板机(Tecan Japan公司制，Hydro Flex)，用Tris缓冲液/0.01％Triton X－100进行清洗后，添加ALP的基质液(LUMIPULSE基质液:FUJIREBIO株式会社制)，在25℃反应5分钟，测定发光强度(ARVOX5(PerkinElmer公司制))。

应予说明，将共聚物溶液换为缓冲液(TBS缓冲液)，同样地操作，将其结果作为比较例。

(1)S/N

将标准溶液的发光强度作为信号，将空白的发光强度作为噪声，计算S/N比，利用共聚物的有无比较S/N(信号/噪声比)。

[表1]

与不含共聚物的条件比较，在含有的条件下S/N约为2倍，确认了对非特异性反应的封闭效果。

(2)灵敏度

用上述的方法计算S/N，将S/N＝2的抗原浓度作为灵敏度。即S/N＝2时的抗原浓度越低越为高灵敏度。如果将测定抗原溶液时的S/N＝2作为灵敏度，则为2.2pg/mL。

如果由下述的测定结果计算10pg/mL的S/N，则为137/25＝5.5。另一方面，抗原浓度为0pg/mL时，S/N为1。如果由这些值计算S/N＝2时的抗原浓度，则为2.2pg/mL。

[表2]

(3)与ELISA法的比较

对于血清试样(被检测物A～E)，用实施例1的方法和以下所示的ELISA法测定PSA抗原，比较测定灵敏度。

＜ELISA法＞

在NUNC公司制ELISA板(MAXISORP)上用PBS将PSA抗体稀释为2μg/mL的浓度，每孔加入50μL，在4℃放置一夜使其吸附。接着加入200μl/孔的封闭液(1质量％BSA，0.05质量％Tween20，50mM的PBS pH7.4)，在37℃放置5小时进行封闭。

生物素标记PSA抗体用标记抗体稀释缓冲液(1质量％BSA，0.05质量％Tween20，in 50mMPBS pH 7.4)制备成1μg/mL来使用。HRP标记抗生物素蛋白(Sigma公司制)用缓冲液(1质量％BSA，0.05质量％Tween20，in 50mMPBS pH 7.4)稀释2000倍。

将上述ELISA板用Tris缓冲液/0.01％Triton X－100清洗3次后，将用被检测物稀释缓冲液(1质量％BSA，0.05质量％Tween20，in50mMPBS pH 7.4)稀释5倍的血清和标准溶液每孔100μl加入各孔中，在37℃反应1小时。用Tris缓冲液/0.01％Triton X－100清洗3次后，加入100μl/孔的生物素标记抗体，在37℃反应1小时。用Tris缓冲液/0.01％Triton X－100充分清洗，加入100μl/孔的作为基质的TMB溶液(和光纯药公司制)，10分钟后加入100μl/孔的1N HCl，测定450nm的波长。

＜结果＞

对于含有约430pg/mLPSA的血清被检测物A，可以用实施例1的测定方法也可以用ELISA法对抗原浓度进行定量。另一方面，对于含有少于430pg/mL的抗原的被检测物B～E，不能用ELISA法测定抗原浓度，但根据实施例1的测定方法能够测定ELISA法的检测极限以下的血清被检测物B、C、D以及E，确认了本测定方法是高灵敏度的。

[表3]

实施例2

将在TBS缓冲液(50mM的Tris缓冲液，pH7.5)中溶解制造例1得到的共聚物(N－1－1)而成的溶液(2质量％)25μL分注到96孔白板(corning公司制)的各孔中，接着对使制造例3中制备的抗体结合磁性粒子分散在含有BSA的缓冲液而成的分散液25μL进行分注，接着依次分注样品(人血清或者标准溶液(含PSA抗原的溶液:0～25ng/mL)25μL，在25℃反应20分钟。

通过磁性分离将粒子分离后，使用96孔白板用洗板机(Tecan Japan公司制，Hydro Flex)，用Tris缓冲液/0.01％Triton X－100清洗后，分注标记物溶液(ALP(碱性磷酸酶)标记抗体溶液)50μL，在25℃反应20分钟。通过磁性分离将粒子分离后，使用96孔白板用洗板机(Tecan Japan公司制，Hydro Flex)，用Tris缓冲液/0.01％Triton X－100进行清洗后，添加ALP的基质液(LUMIPULSE基质液:FUJIREBIO株式会社制)，在25℃反应5分钟，测定发光强度(ARVOX5(PerkinElmer公司))。

应予说明，将共聚物溶液换成缓冲液(TBS缓冲液)，同样地操作，将其结果作为比较例。

[表4]

实施例3

将具有羧基的上述磁性粒子进行磁性分离并除去上清液，用以TBS缓冲液(50mM的Tris缓冲液，pH7.5)稀释的共聚物(N－1－1)稀释液(0.3％，1.5％)清洗2次。进行磁性分离除去上清液，以粒子浓度为0.025％的方式分散于用TBS缓冲液稀释成0.3或者1.5％的共聚物(N－1－1)稀释液中，在25℃反应一夜。

以50μL/孔分注将实施了封闭处理的96孔板的孔用共聚物(N－1－1)进行处理而得的0.025％粒子液，进行磁性分离并除去上清液，用Tris缓冲液/0.01％Triton X－100清洗5次。接着以50μL/孔分注被TBS稀释的50μg/mL HRP(Horseradish peroxidase)标记抗小鼠IgG抗体稀释液，在25℃边振荡20分钟边反应。进行磁性分离并除去上清液，各孔用Tris缓冲液/0.01％Triton X－100清洗5次并除去上清液后，以50μL/孔分注HRP用化学发光基质(SuperSignalR ELISA PicoChemiluminescent Substrate，Thermo公司)，5分钟后测定化学发光量，由该吸光度通过校正曲线法计算抗体吸附量。应予说明，加入不含共聚物(N－1－1)的TBS而同样地反应，将其作为对照。将结果示于表5。

[表5]

由此，对共聚物(N－1－1)可确认具有抑制磁性粒子上的非特异性吸附的效果。

Claims

1.一种载体，其特征在于，在表面具有聚合物，该聚合物含有具有亚磺酰基的重复单元。

2.根据权利要求1所述的载体，其中，所述聚合物是含有在侧链具有亚磺酰基的重复单元的聚合物。

3.根据权利要求1或2所述的载体，其中，所述聚合物进一步含有疏水性重复单元。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的载体，其中，进一步担载有配体。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的载体，其中，具有含有磁性物质的磁性粒子。

6.一种载体的制造方法，其特征在于，使含有具有亚磺酰基的重复单元的聚合物与载体接触。

7.一种生物物质的免疫学测定方法，其特征在于，包含将测定对象物质捕获至载体的工序，

所述载体为权利要求4或5所述的载体。

8.根据权利要求7所述的免疫学测定方法，其中，进一步包含清洗含有所述载体的反应体系而进行B/F分离的工序。

9.根据权利要求7或8所述的免疫学测定方法，其中，进一步包含测定所述载体所捕获的对象物质量的工序。

10.一种测定方法，其特征在于，是在同一反应容器中进行如下工序的生物物质的免疫学测定方法，所述工序为将测定对象物质捕获至磁性粒子的反应工序，清洗含有所述磁性粒子的反应体系而进行B/F分离的清洗工序，和测定磁性粒子所捕获的对象物质的测定工序；

在反应容器内投入含有聚合物的溶液和所述磁性粒子，进行捕获反应，该聚合物含有在侧链具有亚磺酰基的重复单元。