CN104994867A - 作为用于口服药物递送的载体的原生动物变体特异性表面蛋白(vsp) - Google Patents
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Abstract
本发明提供用于口服递送的组合物和采用VSP载体,例如贾第虫属可变表面蛋白(VSP),递送治疗剂的治疗方法。VSP药物载体可以与生物活性肽(如胰岛素、胰高血糖素或hGH)组合,且可以口服或粘膜施用。VSP载体对酸性pH和蛋白水解降解具有抗性,且在胃肠道中保护治疗剂不被降解。
Description
对电子递交的序列表的引用
与本申请一起提交的电子递交ASCII文本文件的序列表(文件名:3181_001PC01_sequence_listing_ST25.txt;大小:2,8138,935字节;创建日期:2013年7月1日)的内容通过引用并入本文。
技术背景
本发明涉及使用多肽载体将治疗剂递送至需要该治疗剂的受试者的组合物和方法。更具体地,本发明涉及作为用于递送治疗剂(如生物活性肽)的载体发挥作用的多肽,如贾第虫属(Giardia sp.)可变表面蛋白(variable surface protein)(VSP)。
由于易于施用、患者依从性和成本,口服递送代表了递送预防性和治疗性药剂的理想手段。然而,口服途径由于胃肠道(GIT)形成的众多屏障也是最困难的。主要的挑战是在胃和小肠上部的化学和酶降解,以及缺乏足够的穿过胃的渗透性。胃中的低pH可以使治疗剂遭受物理和化学降解。肽的物理降解一般涉及蛋白质的原始结构到更高阶结构的修饰,这可能是吸附、聚集、展开、沉淀和/或完全/部分降解为其氨基酸成分的结果。化学降解通常涉及键的裂解和导致新产物的形成。
贾第虫是能够在胃和小肠上部的恶劣环境条件下存活的肠道病原体。像许多原生动物微生物一样,贾第虫发生抗原性变异(参见例如,Zambrano-Villa等,Trends Parasitol.18:272-8(2002)),通过该机制它不断变换其主要的表面分子,从而允许该寄生虫逃避宿主的免疫反应并建立慢性和/或复发性感染(参见例如,Nash,Mol.Microbiol.45:585-90(2002))。这些表面抗原属于变体-特异性表面蛋白(VSP)家族,其是覆盖滋养体整个表面的膜内在蛋白。
VSP具有富含半胱氨酸的氨基末端区域以及包含跨膜区和短的胞质尾的保守羧基末端结构域(图1A)。在贾第虫的基因组中存在大约200个VSP基因的集合,但在任意给定时间只有一个VSP在该寄生虫的表面上表达(参见例如,Prucca等,Nature 456(7223):750-4(2008);Deitsch等,Microbiol.Mol.Biol.Rev.61:281-93(1997))。
因为贾第虫VSP的胞外部分使得该寄生虫能够在小肠上部的敌对环境内存活,与抗原共价结合的VSP已被用于运送(shuttle)候选抗原。已经观察到当口服施用包含与贾第虫抗原共价结合的VSP的疫苗时,该抗原完全保护动物不受贾第虫寄生虫的后续感染,表明该抗原在通过GIT时保存下来(Rivero等,Nat.Med.16(5):551-7(2010),参见例如,PCT公开号WP2010/064204和WO2011/120994,其整体在此通过引用并入本文)。
1型糖尿病通常在儿童和年轻成年人中诊断,并造成越来越大比例的国家医疗保健支出。1型糖尿病是由免疫系统的功能障碍引起的自身免疫性疾病,它攻击并摧毁产生胰岛素的胰岛的β-细胞。
施用外源胰岛素是可以用来控制与该疾病并发的血糖升高的唯一药物治疗。相反,2型糖尿病的特征是胰岛素分泌和胰岛素作用两者的缺陷,胰岛素缺乏通常在疾病过程的后期出现。在该疾病中,经常需要补充胰岛素来实现良好的葡萄糖水平控制(参见例如,DeWitt&Hirsch,JAMA 289:2254-2264(2003))。具有不同类型的可用的皮下胰岛素(Summers等,Clin.Ther.26:1498-1505(2004))。然而,调查表明部分2型糖尿病的患者由于预期的疼痛和不方便而对胰岛素治疗具有显著阻力(Peyrot等,Diabetes Care 28:2673-2679(2005))。最年轻的和最年长的患者最不可能接受可注射治疗,因此对想要开始胰岛素治疗的医生提出最大的挑战(Freemantle等,Diabetes Care 28:427-428(2005))。因此,患者的偏好驱动了开发口服、鼻用和吸入的胰岛素制剂的努力以避免皮下注射(Cefalu,Ann.Med.33:579-586(2001);Graham等,N.Engl.J.Med.356:497-502(2007))。因此,通过口服途径递送胰岛素的选择仍然是有吸引力的治疗策略。
胰高血糖素(胰腺分泌的肽激素)提高血糖水平。它的作用与降低血糖水平的胰岛素的作用相反。胰高血糖素指示用于严重低血糖的治疗。因为1型糖尿病患者与稳定的2型患者相比可能具有较少的血糖水平的增加,应当尽快给予补充的碳水化合物,尤其是对儿童患者。当减少肠道蠕动是有利时,胰高血糖素还指示作为胃、十二指肠、小肠和结肠放射学检查的辅助诊断。对于这种检查,胰高血糖素与抗胆碱能药物一样有效。然而,加入抗胆碱能剂可能造成增加的副作用。在胰岛素的情况下,开发适合口服递送的胰高血糖素形式是有吸引力的治疗策略。
生长激素缺乏是涉及脑垂体腺的失调,脑垂体产生生长激素和其他激素。人生长激素(hGH)在人体中刺激生长和细胞繁殖,也在脂质、蛋白质和碳水化合物的代谢中发挥作用。通常通过细菌发酵生产重组的hGH(Zeisel等,Horm.Res.37(Suppl 2):5–13(1992);Sonoda&Sigimura,Biosci.Biotechnol.Biochem.72:2675-80(2008))。当脑垂体腺没有产生足够的生长激素时,生长将会比正常的慢。生长激素对于儿童的正常生长是需要的。在成年人中,需要生长激素来维持适量的身体脂肪、肌肉和骨骼。hGH缺乏可能发生在任何年龄。患有生长激素缺乏症的儿童和一些成年人将会受益于生长激素治疗。为了治疗生长激素缺乏症,通常服用hGH(人生长激素)。hGH是可注射药物,其于患者皮肤的脂肪下一周注射数次(Brearley等,BMC Clin.Pharmacol.7:10(2007))。在胰岛素治疗的情况下,患者对开始注射疗法的抵抗和依从性对医生提出了挑战。因此,开发适合口服递送的hGH形式是有吸引力的治疗策略。
发明简述
本公开提供用于将治疗剂(例如生物活性肽,如胰岛素、胰高血糖素、或生长激素),例如通过口服或粘膜施用,递送至需要该治疗剂的受试者的靶位置的包含VSP-载体的组合物和方法。
更具体地,本公开提供VSP多肽如贾第虫寄生虫的可变表面蛋白(VSP)或其片段(例如,贾第虫VSP的细胞外结构域或其包含CXXC基序的片段)作为载体通过口服或粘膜施用递送治疗剂的用途。本发明的VSP载体没有通过肽键与治疗剂共价结合。
因此,本公开提供包含VSP载体和治疗剂的治疗组合物。在一些实施方案中,组合物配制用于口服施用。在其他实施方案中,组合物配制用于粘膜施用。在一些实施方案中,VSP载体是VSP、VSP样蛋白、VSP或VSP样蛋白片段、VSP或VSP样蛋白衍生物、或两个或更多个所述VSP载体的组合。
在一些实施方案中,VSP载体包含来自贾第虫的VSP或其片段。在其他实施方案中,来自贾第虫的VSP或其片段包含VSP细胞外结构域。在其他实施方案中,来自贾第虫的VSP是VSP1267。在一些具体的实施方案中,VSP载体包含氨基酸序列SEQ ID NO:2。在其他实施方案中,VSP载体进一步包含异源部分。在一些实施方案中,异源部分是蛋白质纯化标签序列。在一些实施方案中,蛋白质纯化标签序列是His6标签。在一些具体的实施方案中,VSP载体由序列SEQ ID NO:1组成。
在一些实施方案中,治疗剂是生物剂。在一些实施方案中,生物剂是生物活性肽。在一些实施方案中,生物活性肽是胰岛素,人生长激素、胰高血糖素,其片段、类似物、衍生物或变体,或两个或更多个所述生物活性肽的组合。在一些实施方案中,生物活性肽是天然胰岛素。在其他实施方案中,生物活性肽是重组胰岛素。在一些实施方案中,生物活性肽是胰岛素类似物。在其他实施方案中,胰岛素类似物是速效胰岛素。在其他实施方案中,胰岛素类似物是长效胰岛素。在一些实施方案中,速效胰岛素是门冬胰岛素(insulin Aspart)。在其他实施方案中,长效胰岛素是甘精胰岛素(insulin Glargine)。
在一些实施方案中,VSP载体与治疗剂的分子-分子比率范围从约10:1至约1:10。在其他实施方案中,VSP载体与治疗剂的分子-分子比率范围从约3:1至约1:3。在一些实施方案中,VSP载体与治疗剂的分子-分子比率是3:1。在其他实施方案中,VSP载体与治疗剂的分子-分子比率是1:1。在一些实施方案中,组合物进一步包含药学上可接受的赋形剂。
还提供将治疗剂递送至受试者中的靶位置的方法,该方法包括向需要该治疗剂的受试者施用包含VSP载体和治疗剂的治疗组合物。本公开还提供治疗受试者的疾病或状况的方法,包括向需要治疗的受试者施用有效量的包含VSP载体和治疗剂的治疗组合物。在一些实施方案中,疾病或状况是激素缺乏症。在一些实施方案中,疾病缺乏症是胰岛素缺乏症。在一些实施方案中,胰岛素缺乏症是1型糖尿病。
还提供治疗受试者的疾病或状况的方法,包括将VSP载体和治疗剂组合,其中所述VSP载体与所述治疗剂结合,以及向所述受试者施用有效量的所述VSP载体与治疗剂的组合。本公开还提供增强治疗剂对酶降解的抗性的方法,包括将VSP载体和治疗剂组合,其中所述VSP载体可以与所述治疗剂结合,且其中将VSP载体和治疗剂组合导致所述治疗剂对酶降解的抗性的增强。
本公开还提供增强治疗剂对pH变性的抗性的方法,包括将VSP载体和治疗剂组合,其中所述VSP载体可以与所述治疗剂结合,且其中将所述VSP载体和所述治疗剂组合导致所述治疗剂对pH变性的抗性的增强。还提供增强治疗剂对粘膜上皮细胞附着性的方法,包括将VSP载体和治疗剂组合,其中所述VSP载体可以与所述治疗剂结合,且其中将所述VSP载体和所述治疗剂组合导致所述治疗剂对粘膜上皮细胞附着性的增强。在一些实施方案中,粘膜上皮细胞是小肠上皮细胞。在其他实施方案中,粘膜上皮细胞是胃上皮细胞。在一些实施方案中,粘膜上皮细胞是口腔上皮细胞。
还提供制备可口服递送的组合物的方法,包括将VSP载体和治疗剂组合,其中所述VSP载体可以与所述治疗剂结合。本公开还提供制备适用于口服施用的可注射组合物(例如,可注射胰岛素制剂)的方法,包括将VSP载体和治疗剂组合,其中所述VSP载体可以与所述治疗剂结合。例如,可注射胰岛素组合物可以通过将可注射组合物与VSP载体组合重新配置或制备以适用于口服施用。本公开还提供制备适用于口服施用的可注射治疗剂的方法,包括将VSP载体和治疗剂组合,其中所述VSP载体可以与所述治疗剂结合。例如,可注射胰岛素组合物可以通过将可注射组合物与VSP载体组合重新配置或制备以适用于口服施用。在一些实施方案中,VSP载体是VSP、VSP样蛋白、VSP或VSP样蛋白片段、VSP或VSP样蛋白衍生物、或两个或更多个所述VSP载体的组合。在一些实施方案中,VSP载体包含来自贾第虫的VSP或其片段。在其他实施方案中,来自贾第虫的VSP或其片段包含VSP细胞外结构域。在一些实施方案中,来自贾第虫的VSP是VSP1267。在其他实施方案中,VSP载体包含氨基酸序列SEQ ID NO:2。在一些实施方案中,VSP载体进一步包含异源部分。在其他实施方案中,异源部分是蛋白质纯化标签序列。在一些实施方案中,蛋白质纯化标签序列是His6标签。在其他实施方案中,VSP载体由序列SEQ ID NO:1组成。在一些实施方案中,治疗剂是生物剂。在其他实施方案中,生物剂是生物活性肽。在一些实施方案中,生物活性肽是胰岛素,人生长激素,胰高血糖素,其片段、类似物、衍生物或变体,或两个或更多个所述生物活性肽的组合。在一些实施方案中,生物活性肽是天然胰岛素。在其他实施方案中,生物活性肽是重组胰岛素。在一些实施方案中,生物活性肽是胰岛素类似物。在其他实施方案中,胰岛素类似物是速效胰岛素。在一些实施方案中,胰岛素类似物是长效胰岛素。在其他实施方案中,速效胰岛素是门冬胰岛素。在一些实施方案中,长效胰岛素是甘精胰岛素。
附图简述
图1A是显示VSP结构特征的示意图。该图表明,VSP是具有富含CXXC基序(其中C代表半胱氨酸,和X可以是任意氨基酸)的可变细胞外区域、独特跨膜疏水区域和短的5个氨基酸长度的胞质尾的膜内在蛋白。
图1B示出了一组贾第虫滋养体的相差(左图)和免疫荧光(右图)分析。每个滋养体在其表面上表达单一VSP,如用抗VSP特异性单克隆抗体的表面标记所示的,每个滋养体表达的VSP各不相同。
图1C示出了滋养体表面的抗VSP特异性免疫金标记。标记了寄生虫的整个表面,包括腹盘和鞭毛,从而形成厚的表面包被。
图2A示出了与用100μg/mL或200μg/mL胰蛋白酶处理的两个不同的贾第虫分离物(WB和GS/M)相对应的相差(PC)图像和免疫荧光(IFA)图像。单克隆抗体G10/4识别GS/M分离物的VSPH7 VSP蛋白中的构象表位。单克隆抗体9B10检测WB分离物的VSP9B10 VSP蛋白中的非构象表位。
图2B示出了与在不同pH(1、3、5和8)下孵育的两个不同贾第虫分离物(WB和GS/M)相对应的相差(PC)图像和免疫荧光(IFA)图像。单克隆抗体G10/4识别GS/M分离物的VSPH7 VSP蛋白中的构象表位。单克隆抗体9B10检测WB分离物的VSP9B10 VSP蛋白中的非构象表位。
图3示出了滋养体胰蛋白酶化后检测三种贾第虫VSP(VSP9B10、VSP1267和VSPH7)存在的蛋白质印迹分析。滋养体用浓度为200μg/mL和2mg/mL的胰蛋白酶处理,或在没有胰蛋白酶的培养基中孵育(对照)。还示出了与小鼠抗碱性磷酸酶抗体(α-小鼠)相对应的对照样品。
图4示出了来自感染了WB9B10贾第虫滋养体的长爪沙鼠(Meriones unguiculatus)(沙鼠)(图4A)、对照沙鼠(图4B)和口服施用了纯化自转基因滋养体的全部贾第虫VSP组的沙鼠(图4C)的肠切片的免疫组织化学显微照片。
图5A示出了与VSP1267的细胞外部分加上C-末端His6标签(加框的氨基酸)相对应的重组贾第虫VSP的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)。N-末端信号肽加上了下划线。
图5B示出了通过SDS-PAGE和使用抗His6单克隆抗体的蛋白质印迹法纯化在杆状病毒系统中产生的重组VSP1267的步骤。
图6示出了与用不同浓度的胰蛋白酶和胰液素(胰液成分的混合物)预孵育的胰岛素(和)相对应的银染凝胶。标记MW的泳道对应于分子量梯。“胰岛素”和“胰蛋白酶”泳道分别是包含胰岛素和胰蛋白酶的对照泳道。
图7示出了7周大的雌性Balb/c小鼠的血糖水平,所述小鼠在2小时没有进食后接受所示剂量的胰岛素。图7A示出了施用后的血糖水平;而图7B示出了施用后的血糖水平。以1IU、5IU和50IU的剂量口服施用胰岛素。用PBS和1-5IU皮下施用的胰岛素作为对照。1IU似乎对于两种胰岛素是亚适量(加圆圈的)。
图8示出了7周大的雌性Balb/c小鼠的血糖水平,所述小鼠在2小时没有进食后接受单独的所示剂量的胰岛素或与VSP载体的组合。图8A示出了施用后的血糖水平;而图8B示出了施用后的血糖水平。用三种不同的制剂以图7中测定的亚适量(1IU)施用胰岛素:(i)单独施用胰岛素,(ii)以分子-分子比率1:1与VSP组合的胰岛素,和(iii)分子-分子比率1:3与VSP组合的胰岛素。用PBS和1-5IU皮下施用的胰岛素作为对照。1IU胰岛素与VSP载体的组合(对胰岛素与VSP的比率为1:1,和对胰岛素与VSP的比率为1:3)增强了胰岛素的生物作用(加圆圈的)。
图9通过蛋白质印迹法示出了抗hGH单克隆抗体(αhGH)的特异性。用该单克隆(αhGH)的两种稀释液(1/3000和1/2000)检测hGH(在大肠杆菌(E.coli)中重组产生的人生长激素)。还示出了含有抗碱性磷酸酶抗体(α小鼠-AP1)的对照。
图10A示出了pH对hGH稳定性的作用。上部图像是示出了在pH1.6、2.0、3.8、5.0、5.8、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0的培养基中孵育的hGH的pH介导降解的蛋白质印迹分析。用抗hGH单克隆抗体确定了hGH的存在。下部图像示出了hGH的银染检测。低pH,与在GIT中发现的相似,导致了蛋白质的降解(圆圈),而在更高pH下,hGH与对照相比保持不变。每个泳道含有10μg hGH。
图10B示出了在低pH下将VSP载体与hGH组合对hGH变性的作用。蛋白质印迹对应于样品对,其中没有VSP载体的hGH样品或hGH与VSP载体的比率为1:3的具有VSP载体的hGH样品经历相同的pH条件(pH 1.4、1.96、3.8、4.91、5.9、7.01、7.95、8.51、9.61和11.17)。在处理过程中丢失了pH 3.8下的hGH:VSP载体样品。用抗hGH单克隆抗体确定了hGH的存在。
图11A示出了胰蛋白酶对hGH稳定性的作用。上部图像是使用抗hGH单克隆抗体的蛋白质印迹染色。下部图像对应于银染。如圆圈区域所示,胰蛋白酶完全蛋白水解了hGH。
图11B表明以1:3hGH:VSP的比率组合VSP载体与hGH保护hGH不被胰蛋白酶(高达150μg/mL胰蛋白酶)降解。蛋白质印迹对应于样品对,其中没有VSP载体的hGH样品或hGH与VSP载体比率为1:3的具有VSP载体的hGH样品遭受相同的胰蛋白酶浓度(50、100、150、300和500μg/mL)。用抗hGH单克隆抗体确定了hGH的存在。
图12A在主图中示出了口服施用指定hGH剂量(50、100、200、400和800μg)后小鼠中hGH的血清水平。插图示出了皮下施用12.5μg剂量的hGH后小鼠中hGH的血清水平。
图12B示出了单独或以1:3的hGH:VSP载体比率与VSP载体组合口服施用hGH后小鼠中hGH的血清水平。
图13A示出了胰蛋白酶对胰高血糖素稳定性的作用。斑点印迹的上图显示胰蛋白酶蛋白水解的胰高血糖素。下图示出了以1:3胰高血糖素:VSP比率组合VSP载体与胰高血糖素保护胰高血糖素不被胰蛋白酶降解直到1:2(蛋白质:蛋白酶)的比率。
图13B示出了由向BALC/c小鼠单独或与VSP组合施用胰高血糖素造成的对血糖水平的影响。
图14A示出了衍生自嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)的VSP样蛋白(SEQ ID NO:590)的嵌合VSP蛋白(SEQ ID NO:589)的序列。将编码肠贾第虫(Giardia intestinalis)VSP1267信号肽和His6纯化标签的序列(SEQ ID NO:591)分别与VSP结构域序列(SEQ ID NO:592)的氨基末端和羧基末端融合,该VSP结构域位于来自四膜虫的VSP样蛋白的氨基酸位置977和1465之间。
图14B示出了如由使用抗hGH单克隆抗体的蛋白质印迹法测定的,不同浓度的胰蛋白酶对重组hGH的活性。
图14C表明hGH与来自嗜热四膜虫的VSP样蛋白的组合能够保护hGH免于在低pH和胰蛋白酶下降解,如在SDS-PAGE后的考马斯蓝染色和使用抗hGH单克隆抗体的蛋白质印迹所示的。
图15A表明IL-2或IL-10与VSP的组合能够保护IL-2和IL-10不被胰蛋白酶降解,如在SDS-PAGE后的考马斯蓝染色中所示的。
图15B表明IL-10与VSP的组合能够保护IL-10免于低pH诱导的降解,如在SDS-PAGE后的考马斯蓝染色中所示的。
图15C表明IL-2与VSP的组合能够保护IL-2和IL-2免于低pH诱导的降解,如在SDS-PAGE后的考马斯蓝染色中所示的。
发明详述
一般通过注射施用的生物活性肽(如胰岛素、胰高血糖素或生长激素)的口服递送提供减少注射次数、提高依从性和减少副作用发生的可观益处。然而,治疗剂(例如生物活性肽,如胰岛素、胰高血糖素或人生长激素(hGH))的成功口服递送涉及克服酶降解障碍、实现上皮通透性以及在制备过程中采取保存生物活性的步骤。为了解决这个问题,我们提供一个口服递送系统,其中生物活性肽(如胰岛素、胰高血糖素或hGH)与VSP载体组合,但不是通过肽键共价结合,以保护所述生物活性肽在胃肠道(GIT)中不被降解并促进它的全身性生物学作用。
因此,本公开涉及包含含有至少一个CXXC基序的VSP载体(例如,贾第虫VSP,VSP样蛋白,其片段、变体或衍生物)的治疗组合物,其中C是半胱氨酸氨基酸,和X是任意氨基酸,所述VSP载体可以与治疗剂组合和与其结合,且作为用于药物递送的载体发挥作用。本公开尤其涉及包含VSP载体(例如衍生自贾第虫VSP的细胞外结构域的多肽)的组合物,所述VSP载体具有对蛋白酶和不同pH的抗性,且能够附着于GIT中的上皮细胞。在一些实施方案中,这种VSP载体被用于形成适合于口服施用的病毒样颗粒(VLP)。
用于口服或粘膜施用的治疗剂与VSP载体的组合赋予所述治疗剂对pH诱导的降解和酶降解的增强的抗性,并增加了所述治疗剂对胃肠上皮的结合。在一些具体的方面,所述治疗剂是生物活性肽,如胰岛素、胰高血糖素或人生长激素。
定义
必须注意,如在本说明书和所附权利要求书中所用的,除非文中另有清楚说明,单数形式“一”(a)、“一个”(an)和“所述”(the)包括多数指代。术语“一”(或“一个”),以及术语“一个或更多”和“至少一个”在此可互换使用。
此外,在此所用的“和/或”是指具体公开两个指定特征或成分中每一个而有或没有另一个。因此,如在本文中所用的术语“和/或”(如在短语如“A和/或B”中)意欲包括“A和B”、“A或B”、“(单独的)A”和“(单独的)B”。类似地,如在短语例如“A、B和/或C”中所用的术语“和/或”意欲包括以下每一种实施方案:A、B和C;A、B或C;A或C;A或B;B或C;A和C;A和B;B和C;(单独的)A;(单独的)B;和(单独的)C。
除非另有定义,在此所用的所有技术和科学术语具有与本发明相关的领域的技术人员通常理解的含义。例如,生物医学和分子生物学简明词典(Juo,Pei-Show,第二版,2002年,CRC出版社)、细胞与分子生物学词典(第三版,1999年,学术出版社)和牛津生物化学与分子生物学词典(修订版,2000年,牛津大学出版社)为技术人员提供了在本公开中所用的很多术语的通用词典。
单位、前缀和符号以国际单位(SI)认可的形式表示。数值范围包括限定该范围的数字。除非另有说明,氨基酸序列按从左到右从氨基到羧基的方向书写。在此提供的标题不限制本发明实施方案的各个方面,该标题将说明书作为整体参考可以得到。因此,下面即将定义的术语通过参照说明书全文更完整地被定义。
可以理解,无论在此用语言“包含”描述的实施方案是什么,另外还提供用术语“由…组成”和/或“主要由…组成”描述的类似实施方案。
在此氨基酸用IUPAC-IUB生化命名委员会建议的其公知的三字母符号或一字母符号表示。类似地,核苷酸用其公认的单字母代码表示。
如在此所用,术语“贾第虫”或“贾第虫寄生虫”是指在一些脊椎动物的小肠中定殖和繁殖从而引起贾第虫病的后滴门(Metamonada)的厌氧带鞭毛的原生动物寄生虫的属。在世界范围内,贾第虫病在粪便-口腔卫生差的人群中是常见的,且主要的传染途径包括污染的水源或性行为。带鞭毛的贾第虫滋养体附着到小肠的上皮细胞(即肠粘膜的表面),在那里它们可以引起疾病而不会触发明显的炎症反应(Rivero等,Nat.Med.16:551-7(2010))。没有已知的毒性因子或毒素且表面蛋白质的可变表达使得其能够逃避宿主免疫应答和适应于不同的宿主环境(Rivero等,Nat.Med.16:551-7(2010))。它们的生命周期在主动游泳的滋养体和感染性的抗性包囊之间交替。贾第虫寄生虫感染人类,但也是一种最常见的感染猫、狗和鸟的寄生虫。哺乳动物宿主也包括牛、海狸、鹿和绵羊。
术语“贾第虫”涵盖不同物种,包括蓝氏贾第虫(Giardia lamblia)和鼠贾第虫(Giardia muris)。如在此所用,术语“蓝氏贾第虫”(也称为“肠贾第虫”(Giardia intestinalis)或“十二指肠贾第虫”(Giardiaduodenalis))是指最常见的人类肠道寄生虫之一。蓝氏贾第虫是在美国最普遍的寄生原生生物,其发病率可高达0.7%(Hlavsa等,MMWRSurveill.Summ.54:9-16(2005))。
如在此所用,术语“可变表面蛋白”、“VSP蛋白”或“VSP”是指覆盖贾第虫寄生虫的整个表面且是由宿主免疫系统识别的主要抗原的多肽。此处所定义的术语“VSP”也包括同源体,例如来自贾第虫的“VSP”蛋白直系同源体和旁系同源体、在其它生物体中发现的VSP和VSP样蛋白以及其片段、变体和衍生物。
对于第一家族或物种的VSP蛋白或VSP-编码基因所用的术语“同源体”是指第二家族或物种的不同VSP蛋白或VSP-编码基因,它们通过功能、结构或遗传分析被确定为与第一家族或物种的原始VSP蛋白或VSP-编码基因相对应的第二家族或物种的VSP蛋白或VSP-编码基因。如在此所用,术语“同源体”是指从共同祖先DNA序列遗传下来的与参考VSP蛋白或VSP-编码基因相关的任何VSP蛋白或VSP-编码基因。
术语“直系同源体”是指通过物种形成从共同祖先基因进化来的不同物种的VSP同源体。通常,直系同源体除了其在一级结构中的差异(突变)外,保留了相同或相似的功能。
术语“旁系同源体”是指通过共同祖先基因的遗传复制进化的相同物种中的VSP同源体。在很多情况下,旁系同源体表现出相关(但不总是相同)的功能。如果一个特定物种已经从与另外物种共有的祖先DNA序列进化出了多个相关基因,术语直系同源体可以包括术语旁系同源体。
最通常情况下,同源体具有功能、结构或遗传相似性。使用基因探针和PCR可以容易地克隆酶或基因的同源体的技术是已知的。使用功能分析和/或通过基因的基因组作图可以确认作为同源体的克隆的序列的身份。
VSP蛋白是具有多个CXXC基序(其中X是任何氨基酸)的富含半胱氨酸的蛋白质,其具有几种特定的特性,包括在某些VSP中存在CXC基序、贾第虫特异性的锌指基序和GGCY基序(Nash,Mol.Microbiol.45:585-590(2002);Adam等,BMC Genomics 10:424(2010))。更准确地说,VSP蛋白是大小从20到200kDa不等的1型膜内在蛋白,具有可变的氨基末端的富含半胱氨酸的区域(代表宿主/寄生虫界面并赋予蛋白质对蛋白水解消化和低pH的抗性的细胞外结构域)和保守的羧基末端区域(其包括疏水的跨膜区和免疫系统检测不到的只含有5个氨基酸的短胞质尾(CRGKA))。各个寄生虫的表面上在任何给定时间只有一个VSP蛋白被表达(Nash.Philos.Trans.R.Soc.Lond.B.Biol.Sci.352:1369-1375(1997)。
在本发明的情况中,术语“可变表面蛋白”、“VSP蛋白”或“VSP”包括完整集合的贾第虫VSP蛋白(特别是蓝氏贾第虫)的任何可变表面蛋白。实际上,贾第虫寄生虫编码对于A集VSP来说大约200个编码VSP的基因的集合(参见例如,Morrison等,Science 317:1921-1926(2010);Adam等,BMC Genomics 10:424(2010)),且Svard小组的两个报告描述了源自B和E集VSP的分离物的VSP集合(Jerlstrom-Hultqvist等,BMC Genomics 11:543(2010);Franzen等,PLoS Pathog.5(8):c1000560(2009))。VSP的细胞外结构域允许寄生虫在上部小肠的敌对环境中生存。VSP对可变的pH值(针对特定VSP的单克隆抗体的构象表位的反应性在pH值2和12之间保持不变)及胰蛋白酶和其它几种蛋白酶的消化具有非常高的抗性。此外,VSP保持附着于肠粘膜(Rivero等,Nat.Med.16(5):551-7(2010))。VSP蛋白的综合列表可以在www.ebi.ac.uk/interpro/IEntry?ac=IPR005127上找到。
必须进一步指出,包含至少一个CXXC基序(其中C代表半胱氨酸残基和X代表任何氨基酸残基)的多肽,如贾第虫VSP或其它微生物的VSP-样蛋白质也可以在体外通过遗传操作产生和在异源系统中产生。因此,也包括化学产生或细胞产生的多肽(包括那些具有在野生型的寄生虫中不存在的氨基酸变异的多肽)(例如贾第虫VSP的变体)。因此,VSP可以由任何本领域公知的方法制备,如固相合成、液相合成或遗传工程。
本发明的治疗组合物中所用的VSP可经历化学修饰。化学修饰的目的可以是获得具有抗体内酶降解的更高保护和/或提高的跨越膜屏障的能力的VSP,从而增加其半衰期和维持或改善其生物活性。根据本发明可以采用本领域中已知的任何化学修饰来修饰VSP。这样的化学修饰包括,但不限于:
(a)对VSP蛋白的N-末端和/或C-末端的修饰,例如N-末端酰化(优选乙酰化)或脱氨作用,或C-末端羧基基团改变为酰胺或醇基团的修饰;
(b)两个氨基酸之间酰胺键的修饰:连接两个氨基酸的酰胺键的氮原子或α-碳原子处的酰化(优选乙酰化)或烷基化(优选甲基化);
(c)连接两个氨基酸的酰胺键的α碳原子处的修饰,例如连接两个氨基酸的酰胺键的α碳原子处的酰化(优选乙酰化)或烷基化(优选甲基化);
(d)手性变化,如用相应的D-对映体代替一个或多个天然存在的氨基酸(L-对映体);
(e)其中用相应的D-对映体代替一个或多个天然存在的氨基酸(L-对映体)的逆向反转,以及氨基酸链(从C-末端到N-末端)的反转;和/或
(f)其中一个或多个α-碳被氮原子所替代的氮杂肽(azapeptide)。
术语“蛋白质”和“多肽”(如VSP蛋白)可互换使用以指由酰胺键(也被称为肽键)线性连接的单体(氨基酸)所组成的分子。肽、二肽、三肽或寡肽包括在“多肽”的定义内,且术语“多肽”可代替任何这些术语或与任何这些术语互换使用。术语“多肽”还意图指多肽表达后修饰的产物,包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、由已知保护/封闭基团的衍生化、蛋白水解裂解或通过非天然存在的氨基酸的修饰。多肽可以从天然生物来源分离或通过重组技术产生,但不是必须从指定的核酸序列翻译而来。多肽可以任何方式产生,包括通过化学合成。
术语“蛋白质”或“多肽”(如VSP蛋白)还包括变体,其包括任何包含具有与该多肽的序列具有至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约95%或至少约99%的氨基酸序列一致性的任何天然或遗传工程多肽的多肽。多肽变体可以通过遗传工程产生,例如通过插入、置换、缺失或其组合。本发明的蛋白质序列中的置换可以是保守的或非保守的。
根据本发明,当术语“蛋白质变体”应用于贾第虫VSP或其他微生物的VSP样蛋白时,这种变体应该能够保持附着于细胞,尤其是粘膜细胞,更特别是GIT的上皮细胞和作为治疗剂载体发挥作用的能力。变体可以是天然或非天然存在的。非天然存在的变体可以采用本领域已知的诱变技术产生。变体多肽可包含保守或非保守的氨基酸置换、缺失或添加。
如在此所用,当术语“片段”应用于VSP或其它微生物的VSP样蛋白质时(例如,在“VSP片段”或“VSP或其片段”这样的短语中),这样的片段应包括包含如在此定义的蛋白质或多肽以及任何多肽的至少约5、6、7、8、9、10、11、12、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、300、400、或500个连续的或不连续的氨基酸的任何多肽。这样的片段应该能够保持附着于细胞,尤其是粘膜细胞,更特别是GIT的上皮细胞且作为治疗剂载体发挥作用的能力。
本发明的多肽或蛋白质的“衍生物”是已经被改变以表现出在天然多肽或蛋白质中没有发现的额外特征,但仍然显示亲本多肽或蛋白质的有益性质(例如,抗蛋白水解酶降解的抗性或与胃肠上皮细胞的结合)的多肽或蛋白质。
本领域技术人员可以容易地识别在此公开的VSP蛋白序列的信号序列的位置。此外,技术人员应该理解,在此公开的VSP蛋白序列的信号序列可以被本领域已知的其他信号序列替代。在一些实施方案中,在本领域已知的另外的信号序列可以添加到此处公开的VSP蛋白序列上。
本领域的普通技术人员采用本申请中公开的方法和/或本领域已知的方法能够制备在此公开的VSP蛋白序列的变体、片段和衍生物,以及设计嵌合VSP蛋白。此外,本领域的普通技术人员基于在此公开的方法和本领域的公知常识能够识别功能结构域的位置,所述功能结构域使蛋白质能够作为在此公开的VSP蛋白及它们的直系同源体和旁系同源体中的VSP载体发挥作用。并且,本领域技术人员采用在此公开的方法和本领域的公知常识能够在无需过度实验的情况下验证VSP蛋白和它们的片段、变体或衍生物是否可以作为VSP载体发挥作用。
“分离的”多肽、蛋白质或者其片段、变体或衍生物是指不在其自然环境中的多肽或蛋白质。不需要特定的纯化水平。例如,可以简单地将分离的多肽或蛋白质从其原始或自然环境中去除。“重组”多肽或蛋白质是指通过重组DNA技术产生的多肽或蛋白质。为本发明的目的,在宿主细胞中表达的重组产生的多肽和蛋白质被认为是分离的,如通过任何适合的技术分离、分馏或者部分或基本上纯化的天然或重组多肽一样。
“蛋白质序列”或“氨基酸序列”是指多肽中沿氨基末端到羧基末端方向的氨基酸成分的线性表示,其中在所述表示中彼此相邻的残基在该多肽的一级结构中是连续的。
“保守的氨基酸置换”是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替换的一个置换。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族,包括碱性侧链(如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电极性侧链(如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支的侧链(如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此,如果多肽中的氨基酸被来自相同侧链家族的另一个氨基酸替换,该置换被认为是保守的。在另一个实施方案中,一串氨基酸可以被侧链家族成员的顺序和/或组成不同的结构上相似的串保守性替换。
术语两个多核苷酸或多肽序列之间的“百分序列一致性”是指考虑为了两个序列的最佳比对必须引入的添加或缺失(即,空位),序列在对比窗上共有的相同的匹配位置数。匹配的位置是相同核苷酸或氨基酸在靶序列和参考序列两者中存在的任何位置。靶序列中存在的空位不计数,因为空位不是核苷酸或氨基酸。类似地,参考序列中存在的空位不计数,因为计数的是靶序列核苷酸或氨基酸而不是来自参考序列的核苷酸或氨基酸。
序列一致性的百分比通过测定在两个序列中出现相同氨基酸残基或核酸碱基的位置数以产生匹配位置的数目,将匹配位置数除以比较窗中位置的总数和乘以100以产生序列一致性的百分比来计算。两个序列之间的序列比较和百分序列一致性的测定可以采用容易获得的用于在线使用和下载的软件完成。合适的软件程序可以从各种来源获得,并可用于蛋白质和核酸序列的比对。一个测定百分序列一致性的合适软件是b12seq(可以从美国政府的国家生物技术信息中心BLAST网页(blast.ncbi.nlm.nih.gov)获得的BLAST程序套件的部分)。B12seq通过BLASTN或BLASTP算法比较两个序列。BLASTN用于比较核酸序列,而BLASTP用于比较氨基酸序列。其他合适的软件是,例如Needle、Stretcher、Water或Matcher(EMBOSS生物信息程序套件的部分,且也可以从欧洲生物信息研究所(EBI)在www.ebi.ac.uk/Tools/psa上获得)。
与多核苷酸或多肽参考序列比对的单个多核苷酸或多肽靶序列内的不同区域各自可以具有它们自己的百分序列一致性。注意百分序列一致性值被四舍五入到最接近的十分位。例如,80.11、80.12、80.13和80.14被四舍五入到80.1,而80.15、80.16、80.17、80.18和80.19被四舍五入到80.2。也注意长度值总是整数。
本领域技术人员理解,用于计算百分序列一致性的序列比对的产生不限于专门由一级结构数据驱动的双元序列-序列比较。序列比对可以来自于多序列的比对。一个产生多序列比对的合适程序是ClustalW2,其可以从www.clustal.org获得。另一个合适程序是MUSCLE,其可以从www.drive5.com/muscle/获得。ClustalW2和MUSCLE也可以从例如EBI获得。
也理解,可以通过将序列数据与来自异质来源的数据例如结构数据(如晶体学蛋白质结构)、功能数据(如突变的位置)或系统发育数据整合。整合异质数据以产生多序列比对的一个合适程序是T-Coffee,其可以从www.tcoffee.org获得,且也可以从例如EBI获得。也理解用于计算百分序列一致性的最终比对可以自动或人工地监管。
术语“异源部分”是指多核苷酸、多肽、非肽聚合物或来自于与其比较的实体的部分不同实体的其他部分。例如,异源多肽可以是合成的,或来自于不同物种、个体的不同细胞类型或不同个体的相同或不同细胞类型。一方面,异源部分可以是与另一个多肽融合以产生融合多肽或蛋白质的多肽。另一方面,异源部分可以是非多肽。在一些实施方案中,VSP载体包含异源部分,如用于蛋白纯化的His6标签。在其他实施方案中,与在此提供的VSP载体组合的治疗剂可以与至少一个异源部分(如聚乙二醇(PEG))偶联或融合(重组地,或采用蛋白合成或化学偶联方法)以提高药代动力学和/或药效学性能(如体内半衰期)。能够提高治疗剂的体内半衰期的异源部分在本领域是已知的。
针对治疗剂的功能特征,如对由高或低pH引起的降解的抗性、对酶降解(如蛋白水解降解)的抗性或与靶细胞(如胃肠上皮细胞)的结合的术语“提高”用来指如在相当条件下测定的,相关功能特征相对于参考(例如,在不存在VSP载体的条件下施用的治疗剂)被提高。
在一些实施方案中,治疗剂的功能特征(如对GIT中酶降解的抗性)的提高是如在相当条件下测定的,高于参考(例如在不存在VSP载体的情况下GIT中该治疗剂如胰岛素对酶降解的抗性)例如至少约5%、至少约10%、至少约15%、至少约20%、至少约25%、至少约30%、至少约35%、至少约40%、至少约45%、至少约50%、至少约55%、至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%或至少约99%。
在一些实施方案中,治疗剂的功能特征(如在GIT中对酶降解的抗性)的提高是如在相当条件下测定的,相对于参考(例如与在在不存在VSP载体的情况下治疗剂如胰岛素在GIT中对酶降解的抗性相比时)提高例如至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约60倍、至少约70倍、至少约80倍、至少约90倍或至少约100倍。
针对治疗剂的功能特征,如对由高或低pH引起的降解的抗性、对酶降解(如蛋白水解降解)的抗性或与靶细胞(如胃肠上皮细胞)的结合的术语“降低”用来指如在相当条件下测定的,相关功能特征相对于参考(例如,在不存在VSP载体的情况下施用的治疗剂)的功能特征被降低。
在一些实施方案中,治疗剂的功能特征(如GIT中对酶降解的抗性)的降低是如在相当条件下测定的,相对于参考(例如在不存在VSP载体的情况下治疗剂如胰岛素在GIT中对酶降解的抗性)低例如至少约5%、至少约10%、至少约15%、至少约20%、至少约25%、至少约30%、至少约35%、至少约40%、至少约45%、至少约50%、至少约55%、至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%或至少约99%。
在一些实施方案中,治疗剂的功能特征(如在GIT中对酶降解的抗性)的降低是如在相当条件下测定的,相对于参考(例如当与在不存在VSP载体的情况下治疗剂如胰岛素在GIT中对酶降解的抗性相比时)低例如至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约60倍、至少约70倍、至少约80倍、至少约90倍或至少约100倍。
术语“多核苷酸”或“核苷酸”意欲包括单个核酸以及多个核酸,且指分离的核酸分子或构建体,例如信使RNA(mRNA)或质粒DNA(pDNA)。在某些实施方案中,多核苷酸包含传统的磷酸二酯键或非常规的键(如在肽核酸(PNA)中发现的酰胺键)。
术语“核酸”是指多核苷酸中存在的任何一个或多个核酸片段,例如DNA或RNA片段。“分离的”核酸或多核苷酸意指已经从其自然环境中移除的核酸分子,DNA或RNA。例如,为本发明的目的,载体包含的编码VSP多肽的重组多核苷酸认为是分离的。分离的多核苷酸的进一步实例包括在异源宿主细胞中保持的或在溶液中从其他多核苷酸纯化(部分地或实质地)的重组多核苷酸。分离的RNA分子包括本发明的多核苷酸的体内或体外的RNA转录物。根据本发明的分离的多核苷酸或核酸进一步包括合成产生的这种分子。此外,多核苷酸或核酸可以包括调控元件,如启动子、增强子、核糖体结合位点或转录终止信号。
如在此所用,“编码区”或“编码序列”是由可翻译为氨基酸的密码子组成的多核苷酸的一部分。虽然“终止密码子”(TAG、TGA或TAA)通常不翻译为氨基酸,它可以被认为是编码区的部分,但任何侧翼序列,如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子等不是编码区的部分。编码区的边界通常由5’末端的起始密码子(编码所得多肽的氨基末端)和3’末端的翻译终止密码子(编码所得多肽的羧基末端)确定。本发明的两个或更多个编码区可以存在于单一多核苷酸构建体(如单一载体上)或分离的多核苷酸构建体(如分离的(不同的)载体上)。然后,由此可见单一载体可以只包含单一编码区,或包含两个或更多个编码区,例如,单一载体可以如下所述独立地编码结合结构域A和结合结构域B。此外,本发明的载体、多核苷酸或核酸可以编码与编码本发明的结合结构域的核酸融合或未融合的异源编码区。异源编码区包括但不限于特指的元件或基序,例如分泌信号肽或异源部分(如His6标签)。
真核细胞分泌的某些蛋白质与分泌信号肽相关,所述分泌信号肽在生长的蛋白质链开始跨过糙面内质网输出时从成熟蛋白质切除。本领域的普通技术人员知道,信号肽通常与多肽的N-末端融合,且从完整的或“全长”多肽切除以产生分泌的或“成熟的”多肽形式。在某些实施方案中,采用天然信号肽或保留了指导与信号肽可操作相连的多肽的分泌的能力的该序列的功能性衍生物。或者,可以采用异源信号肽,例如人组织纤溶酶原激活物(TPA)或小鼠β-葡萄糖醛酸苷酶信号肽,或其功能性衍生物。
如在此所用,术语“宿主细胞”是指携带或能够携带重组核酸的细胞或细胞群体。宿主细胞可以是原核细胞(如大肠杆菌),或者另外地,宿主细胞可以是真核的,例如真菌细胞(例如酵母细胞,如酿酒酵母(Saccharomyces cerevesiae)、毕赤酵母(Pichia pastoris)或粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)),以及各种动物细胞,如昆虫细胞(如Sf-9)或哺乳动物细胞(如HEK293F、CHO、COS-7、NIH-3T3)。
术语“治疗剂”是指递送(例如,口服)于受试者以产生所需有益效果(如预防、抑制或阻止疾病或状况的症状和/或进展)的任何治疗活性物质。在一些实施方案中,治疗剂在其与VSP载体组合前可以预配制为,例如微囊、微球、微泡、脂质体、nisome、乳液、分散体等。治疗剂的定义还包括诊断活性剂和显像剂,如染料或荧光标志物。
如在此所用,术语“药学上可接受的”是指被美国或欧洲或其他政府的监管机构批准的,或在美国药典或其他普遍认可的药典中列举用于人类的。因此,术语“药学上可接受的”是指从毒理学和/或安全性角度对患者(如人类患者)可接受的那些性能和/或物质。
术语“药学上可接受的赋形剂”和“药学上可接受的载体”是指在药物组合物中所用的对治疗的宿主没有显著的不良影响且保留与其一起使用的治疗剂的治疗性能的赋形剂和载体。一个示例性的药学上可接受的载体是生理盐水。其他药学上可接受的载体和它们的制剂对本领域技术人员是已知的,且在例如通过引用并入此文的雷明顿药学(Remington's Pharmaceutical Science),(第十八版),主编A.Gennaro,1990,Mack出版公司,Easton,PA中描述。
短语“有效量”如在此所用是指包含治疗剂与VSP载体的组合的本发明治疗组合物,或包含此类治疗组合物的药物组合物以适用于任何医学治疗的合理收益/风险比产生所需效果有效的量。例如,“有效量”是有效降低或减少正在治疗的疾病或失调的至少一种症状,或降低或延迟与疾病或失调相关的一种或多种临床标志物或症状的开始,或改善或逆转疾病过程的量。
术语“治疗(treat)”或“处理(treatment)”如在此所用是指治疗性处理和预防或防护性措施,其中目的是预防或减缓(减少)受试者的不良生理变化或失调,如激素缺乏相关的疾病或状况的进展。有益的或理想的临床结果包括,但不限于症状的缓解、疾病程度的降低、稳定的疾病状态(即,不恶化)、疾病进展的延迟或延缓、疾病状态的改善或缓解以及消退(部分或全部),无论检测得到或检测不到。
术语“治疗”还意味着与没有接受治疗的预期存活相比延长的存活期。需要治疗的人包括已经患有状况或失调的人以及容易患有状况或失调的人或者其中要预防状况或失调的人。
术语“施用”如在此所用是指通过药学上可接受的施用途径向需要治疗的受试者(例如,人类受试者)给予包含与VSP载体组合的治疗剂的本发明治疗组合物,或包含本发明治疗组合物的药物组合物。在一些实施方案中,施用途径是口服或经粘膜。在其他实施方案中,施用途径选自皮下、肌肉内、鼻、静脉内和肺部给药。VSP载体可以作为包含至少一种治疗剂和至少一种药学上可接受的赋形剂的药物组合物的部分施用。
术语“受试者”和“患者”可互换使用,且是指需要诊断、预后或治疗的任何个体、患者或动物,尤其是哺乳动物受试者。哺乳动物受试者包括人类、家养动物、农畜和动物园的动物、体育用动物或宠物,如狗、猫、豚鼠、兔子、大鼠、小鼠、马、牛、奶牛等等。
引言
本公开提供包含VSP载体和治疗剂的治疗组合物。VSP载体是多肽,如肠道寄生虫蓝氏贾第虫的变体-特异性表面蛋白(VSP)和来自其他生物体的可以与治疗剂(如生物活性肽)结合的VSP样蛋白,并通过口服或粘膜途径将这种治疗剂有效递送。为确定VSP是否能够由于VSP对酸性pH降解的抗性、对蛋白水解降解的抗性以及对肠粘膜的附着而有效地与治疗剂(如生物活性肽)结合并用作载体来运输治疗剂通过胃肠道(GIT),我们采用了三种生物活性肽(胰岛素、胰高血糖素和人生长激素)作为通过口服途径递送的原型治疗剂。
在本文中实施例部分公开的结果表明,VSP载体可以用于通过口服或其中蛋白水解降解和/或暴露于低pH可以影响治疗剂的完整性的其他递送途径(如粘膜施用)有效地递送治疗剂。
术语“VSP载体”如在此所用是指可以与至少一种治疗剂结合的VSP蛋白(如贾第虫VSP、VSP样蛋白、VSP或VSP样蛋白片段、VSP或VSP样蛋白变体、VSP或VSP样蛋白衍生物、或两种或更多种所述VSP多肽的组合)。在某些实施方案中,所述至少一种治疗剂不是疫苗免疫原。
在一些实施方案中,VSP载体是“嵌合VSP”。如在此所用,术语“嵌合VSP”是指包含源自不同VSP蛋白的蛋白质子序列的工程化VSP蛋白。在一些实施方案中,子序列从来自于相同物种的VSP蛋白获得。在其他实施方案中,子序列从来自于不同物种的VSP蛋白获得。在一些实施方案中,嵌合VSP蛋白包含非VSP元件,例如,纯化标签(如His6或本领域已知的其他纯化标签)、可检测标签(如本领域已知的荧光或放射性标签)等等。例如,嵌合VSP蛋白可以包含含有来自第一VSP蛋白(如来自贾第虫VSP蛋白)的VSP结构域的子序列和来自不同蛋白质(如来自贾第虫的第二VSP蛋白)的信号序列。在其他实施方案中,嵌合VSP蛋白可以包含含有来自第一物种的第一VSP蛋白(如来自嗜热四膜虫的VSP蛋白)的VSP结构域的子序列和来自第二物种的不同VSP蛋白的信号序列(如来自贾第虫的信号肽)。在一些实施方案中,嵌合VSP可以包含超过一个VSP结构域。在一些实施方案中,嵌合VSP可以包含含有来自不同VSP蛋白的亚结构域(例如,一个或多个弗林蛋白酶样富含半胱氨酸的结构域、或一个或多个上皮生长因子样结构域)的VSP结构域,所述VSP蛋白可以来自相同物种或来自不同物种。
可以采用本领域已知的计算工具容易地识别VSP蛋白中的VSP结构域的位置。例如,可以扫描蛋白质序列以识别包含PFAM结构域模型PFAM03302(贾第虫变体-特异性表面蛋白)的子序列。也可以采用程序InterproScan来扫描候选蛋白以与蛋白印记数据库的INTERPRO集合匹配,特别是对于模型IPR005127(贾第虫变体-特异性表面蛋白)的存在。技术人员应当理解,选择以包括在嵌合VSP中的VSP结构域子序列的边界不需要与通过运算工具(如InterproScan)报告的边界精确地匹配。因此,本领域技术人员采用在此公开的方法和本领域的公知常识能够改变计算方式鉴别的VSP结构域的边界并无需过度的实验验证所得VSP结构域片段是否可以真正地作为VSP载体发挥功能。本领域技术人员还能够通过使用公众可得的工具(如可从www.cbs.dtu.dk/services/SignlaP获得的SignalP程序)识别用作嵌合VSP中成分的肽信号序列的位置。例如,可以使用SignalP程序识别表1中包括的VSP和VSP样蛋白中或根据其氨基酸序列中模型PFAM03302和/或IPR005125的存在鉴定为包含VSP结构域的其他蛋白中的信号肽的位置。
在一些情况下,天然VSP可能太大而无法成功地重组表达,其在细胞培养中的表达水平可能太低,或大尺寸可能妨碍稳定制剂的纯化或产生。因此,本公开提供生产VSP载体的方法,包含从大的候选VSP蛋白切除VSP结构域。在一些实施方案中,在切除的VSP结构域的羧基和/或氨基末端加入和/或去除氨基酸以优化所需性能,如表达水平、表达产量、纯化产量、溶液中的稳定性、制剂稳定性、对蛋白酶的抗性、pH稳定性、热稳定性、对GIT膜的附着性、与治疗剂结合的能力等等。
本发明的VSP载体不是通过肽键与治疗剂共价结合。因此,当应用于VSP载体和治疗剂之间的相互作用时,术语“结合的(bound)”及其语法变体(例如,“结合”、“结合于”、“连结”等)是指(i)共价非肽结合(如通过二硫键结合)或(ii)非共价结合,但不是VSP载体与治疗剂之间的肽键形成。
VSP载体与治疗剂之间非共价结合的非限制性实例包括离子键(如阳离子π键或盐键)、金属键、氢键(如二氢键、双氢复合物、低垒氢键(low-barrier hydrogen bond)或对称氢键)、范德华力、伦敦分散力、机械键、卤键、亲金作用、插层、堆叠、熵力或化学极性。
术语“结合”也指包含VSP载体的分子结构包封或部分包封治疗剂(例如生物活性肽,如胰岛素)。在一些实施方案中,术语“结合”指VSP载体与包封了治疗剂的大分子结构的相互作用(共价或非共价)。在这一方面,治疗剂可以包封于或包装于,例如,脂质双层、脂质体、纳米粒子、纳米管、纳米气泡、胶束、纳米球、纳米壳、纳米棒、化学笼、纳米角、量子点、纳米团簇、微泡、树枝状聚合物、aquasome、lipopolyplex、纳米乳液或其组合中。术语“结合”还包括VSP载体与脂质双层的结合或VSP载体插入到脂质双层中,所述脂质双层包含治疗剂(例如,插入到双层的疏水核心中的脂溶性药物)或包封治疗剂(例如,脂质双层是其中包装治疗剂的脂质体的部分)。
在一些实施方案中,VSP载体包含通常与将该VSP载体锚定至双层的疏水肽融合的异源部分。在其它实施方案中,将VSP载体锚定至双层的异源部分(如疏水肽或脂质锚)可以与VSP载体化学偶联。在一些实施方案中,VSP载体可以通过接头与异源部分遗传融合或偶联。术语“接头”是指共价连接VSP载体和异源部分的分子实体。接头可以包含,例如,硫醇基、烷基、二醇基或肽基。接头包括交联分子。参见其全文通过引用并入此文的国际专利公开号WO 2004/009116。
在一些实施方案中,VSP载体通过形成包含治疗剂的“病毒样颗粒”(VLP)与治疗剂结合,所述治疗剂在VLP的表面上或包封于VLP内。如在此所用,术语“病毒样颗粒”或“VLP”是指在其表面呈现贾第虫VSP或其片段的类似病毒颗粒的结构。根据本发明的病毒样颗粒是非复制性的,因为它缺乏全部或部分的病毒基因组,通常且优选地缺乏病毒基因组的全部或部分的复制性和感染性成分。术语“非复制性的”如在此所用是指不能复制包含在VLP中或不在VLP中的基因组。
如在此所用,术语“组合”(及其语法变体,如“组合的”或“复合”)是指掺混两种或多种成分(如VSP载体和治疗剂)以使得成分之间发生接触且这种接触允许所述两种或多种成分结合的过程。
在一些特定的实施方案中,治疗剂(例如生物活性肽,如IL-2)可以与VSP蛋白遗传融合(参见例如,在实施例9第1段中公开的初步实验)。在特定的实施方案中,治疗剂是与VSP化学偶联的纳米颗粒形式的生物活性肽(例如胰岛素、胰高血糖素、生长激素)。在一些实施方案中,治疗剂(如生物活性肽)不通过任何插入在治疗剂与接头之间的接头与VSP化学偶联。在一些实施方案中,治疗剂(如生物活性肽)通过插入在治疗剂和VSP之间的至少一个接头与VSP化学偶联。
在一些实施方案中,VSP载体可以与超过一个治疗剂(例如,超过一个生物活性肽)化学偶联。在一些实施方案中,两个或更多个VSP载体可以与一个治疗剂(例如,生物活性肽)化学偶联。在其他实施方案中,两个或超过两个VSP载体可以与超过一个治疗剂(例如,超过一个生物活性肽)化学偶联。在一些实施方案中,治疗剂在与VSP载体遗传融合或化学偶联时是生物活性的。在其它实施方案中,治疗剂(如生物活性肽)在与VSP载体遗传融合或化学偶联时是无活性的或仅仅是部分活性的,在这种情况下,可能需要化学和/或酶促裂解来释放治疗剂的活性(或更高活性)的形式。相反,在一些实施方案中,治疗剂(如生物活性肽)在与VSP载体遗传融合或化学偶联时是活性的,且可以采用化学和/或酶促裂解从VSP载体释放治疗剂的活性形式以使治疗剂失活。因此,当在GIT的部分(例如胃)中时,治疗剂(如生物活性肽)可以被VSP载体保护,而在其到达GIT的不同部分后被该GIT部分中普遍的不同条件(例如不同pH或特定的酶)降解或灭活。
在一些实施方案中,治疗剂(如生物活性肽)和VSP载体可以通过可以裂解(例如,化学地或通过蛋白酶)以使得治疗剂的活性形式从VSP载体释放的肽接头或其他类型的接头遗传融合或化学偶联。在一些实施方案中,治疗剂(如生物活性肽)和VSP载体可以通过可以裂解(例如,化学地或通过蛋白酶)以使得治疗剂的无活性形式从VSP载体释放的肽接头或其他类型的接头遗传融合或化学偶联。
在一些实施方案中,治疗剂(如生物活性肽)和VSP载体(结合的、遗传融合的、或化学偶联的)可以与另一分子结合、遗传融合或化学偶联以形成二价分子(例如,VSP载体和治疗剂两者均与C4b结合蛋白β链(C4PB)的羧基末端遗传融合)。
来自贾第虫VSP的VSP载体
在一些实施方案中,VSP载体包含选自在贾第虫寄生虫基因组的DNA水平上编码的VSP完整集合的VSP序列。这个集合由在不同贾第虫分离物中变化的大约200个同源VSP-编码基因(vsps)组成(参见,Adam等,BMC Genomics 11:424(2010))。应当进一步注意的是,贾第虫VSP的变体、片段和衍生物也可以用作根据本发明的VSP载体。表1展示了可以用作VSP载体的蛋白质的代表性的、非限制性的列表。
表1.可以用作VSP载体的VSP和VSP样蛋白的示例性列表
表1包括包含Interpro贾第虫变体-特异性表面蛋白基序IPR005127的585个VSP和VSP样蛋白的序列(序列列表在线公开于embl-ebi.org/interpro/IEntry?ac=IPR005127且从2012年6月12日起可公开获得)。可以用作根据本公开的VSP载体的其他VSP和VSP样蛋白是包含贾第虫变体-特异性表面蛋白基序PF03302的1079个蛋白序列,其可从版本26.0的Pfam数据库获得(序列列表在线公开于pfam.sanger.ac.uk/family/PF03302且从2012年6月12日起可公开获得)。在上述数据库中发表的且于上述公开日期可公开获得的蛋白序列的列表以其整体通过引用并入本文。
如上所述,贾第虫VSP,更尤其是贾第虫VSP的细胞外结构域,包含多个CXXC基序,优选被几个氨基酸、3-20个氨基酸、且更特别5-8个氨基酸分隔的多个CXXC基序(如通过多序列比对观察到的)。因此,在一些实施方案中,VSP载体是来自贾第虫的VSP或VSP样蛋白的片段、类似物或衍生物,其中VSP载体包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个CXXC基序。在一些实施方案中,VSP载体包含至少约40、至少约50、至少约60、至少约70、至少80、约90、或至少约100个来自贾第虫VSP的CXXC基序。
在特定的实施方案中,贾第虫寄生虫是蓝氏贾第虫。在一个实施方案中,贾第虫VSP可以是但不限于蓝氏贾第虫的VSP9B10(Uniprot:Q9GS24)、VSP1267(Uniprot:Q07317)、VSPA6(Uniprot:Q24970)、VSPSl(Uniprot:Q8I0P4)、VSPS2(Uniprot:Q8I8W6)、VSPS3(Uniprot:Q8I0M3)、VSPS4(Uniprot:E2RTM9)、VSPS5(Uniprot:Q8I8W4)、VSPS6(Uniprot:Q8I8W3)、VSPS7(Uniprot:Q8I8W2)、VSPS8(Uniprot:E2RTU6)、VSPAS1(Uniprot:Q8I0M3)、VSPAS2(Uniprot:8I8W0)、VSPAS3(Uniprot:Q8I8V9)、VSPAS4(Uniprot:Q8I0P4)、VSPAS5(Uniprot:Q8I8V8)、VSPAS6(Uniprot:Q8I8V7)、VSPAS7(Uniprot:Q8I8V6)、VSPAS8(Uniprot:Q8I8V5)、VSPAS9(Uniprot:Q8I8V4)、VSPAS10(Uniprot:Q8I8V3)、VSPAS11(Uniprot:Q8I8V2)、VSPAS12(Uniprot:E2RU01)或VSPH7(Uniprot:Q24992),或其片段、变体或衍生物。
在一个实施方案中,VSP载体包含贾第虫VSP的细胞外结构域,或其片段、变体或衍生物(因为所述细胞外结构域是包含贾第虫VSP蛋白的多个CXXC基序的氨基末端富含半胱氨酸的区域)。
贾第虫VSP的细胞外结构域是抗pH、温度和蛋白水解消化的结构域。因此,在另一个实施方案中,根据本发明的VSP载体只包含贾第虫VSP的细胞外结构域,或其片段、变体或衍生物。在特定的实施方案中,VSP载体包含VSP1267(SEQ ID NO:2)的细胞外序列,其包含N-末端信号肽。因此除去了贾第虫VSP的跨膜区和胞质尾。应当注意,也可以从VSP细胞外结构域除去肽信号。
在本说明书的最后包括了适合产生VSP载体的一系列VSP和VSP样蛋白,包括它们的序列、Uniprot登录号和Uniprot登陆名。Uniprot登录号和登录名和VSP蛋白号之间的对应可以从www.uniprot.org的Uniprot项确定。例如,Uniprot登录号Q07317及其登录名Q07317_GIAIN对应于VSP1267。
术语“VSP1267载体”是指重组产生的贾第虫VSP蛋白VSP1267的没有跨膜结构域和胞质尾的片段,但具有完整的信号肽且进一步包含C-末端His6标签(SEQ ID NO:1,如图5A所示)。在一些实施方案中,VSP载体是VSP1267(蛋白质序列是SEQ ID NO:2;DNA编码序列是SEQ ID NO:4)细胞外结构域的片段、变体或衍生物。在其他实施方案中,VSP载体是片段、变体或VSP9B10(蛋白质序列是SEQ IDNO:3;DNA编码序列是SEQ ID NO:5)。参见表2。
表2:示例性VSP载体的蛋白质和DNA序列
来自VSP样结构域的VSP载体
在一些实施方案中,VSP载体包含选自来自贾第虫以外的微生物的VSP样结构域、其片段、变体或衍生物的VSP序列。这些VSP样蛋白与贾第虫VSP共有序列同源性和生化性质。在一些实施方案中,选择用作VSP载体的VSP样序列包含多个CXXC基序。在一些实施方案中,这样的多个CXXC基序被5-8个氨基酸分隔。
贾第虫VSP1267的细胞外结构域序列(在此用作示例性VSP载体)与其他VSP样分子序列的比对导致在属于草履虫(Paramecium)、四膜虫(Tetrahymena)和内阿米巴(Entamoeba)的种的蛋白质中观察到多个CXXC基序的存在,特别地被5-8个氨基酸分隔的。因此,内阿米巴属的表面激酶、草履虫属和四膜虫属的表面蛋白的一级序列的代表性片段预测了VSP样结构中包含CXXC基序的保守性结构域(与负责对pH、温度和蛋白水解消化抗性的贾第虫VSP1267、9B10(SEQ ID NO:3)和H7相比)。
在一个实施方案中,四膜虫微生物是嗜热四膜虫。在另一个实施方案中,内阿米巴微生物是痢疾阿米巴。在另一个实施方案中,草履虫微生物是第四双小核草履虫。
在一个实施方案中,VSP载体包含VSP样蛋白的细胞外结构域、或其片段、变体或衍生物(因为所述细胞外结构域是包含贾第虫VSP蛋白的多个CXXC基序的氨基末端富含半胱氨酸的区域)。在另一个实施方案中,VSP载体只包含VSP样蛋白的细胞外结构域,或其片段、变体或衍生物。
因此,在一些实施方案中,VSP载体是包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、或40个CXXC基序的VSP样蛋白的片段、类似物或衍生物。在一些实施方案中,VSP载体包含至少约40、至少约50、至少约60、至少约70、至少约80、至少约90、或至少约100个来自VSP样蛋白的CXXC基序。
VSP作为治疗剂载体
VSP载体可以用于将治疗剂递送给需要的受试者。因此,在一些实施方案中,本公开提供包含VSP载体和治疗剂的治疗组合物。该治疗组合物可以配制成,例如,用于口服施用。在一些实施方案中,治疗组合物配制成用于粘膜施用。如以上公开的,VSP载体可以包含,但不限于,VSP、VSP样蛋白、VSP或VSP样蛋白片段、VSP或VSP样蛋白衍生物、或者两个或多个所述VSP载体的组合。在特定的实施方案中,VSP载体包含来自贾第虫的VSP9(如VSP1267)或其片段,例如,VSP细胞外结构域或这种细胞外结构域的片段。
在一些实施方案中,VSP载体包含VSP蛋白序列并进一步包含异源部分,例如,纯化标签(如His6标签)。在其他实施方案中,异源部分可以是能够改善药代动力学或药效学性能(如半衰期)的蛋白质、肽、聚合物等等。在特定的实施方案中,VSP载体是SEQ ID NO:1,即贾第虫VSP1267的细胞外结构域,包括N-末端信号肽和C-末端His6标签。
可以通过VSP载体递送的治疗剂包括生物剂。术语“生物剂”包括蛋白质和非蛋白质的治疗剂。示例性的非蛋白质治疗剂包括多糖、脂质、药物(如小分子药物)、核酸(如寡核苷酸)、脂多糖、核酶、遗传物质、朊病毒、病毒等等。
在本发明的一些实施方案中,治疗剂是药理学上有活性的多肽。在一些实施方案中,多肽是生物活性肽,例如细胞因子、白细胞介素(如IL-2或IL-10)、激素(如甲状旁腺素)、生长因子或受体。在特定的实施方案中,生物活性肽可以是,但不限于,胰岛素、人生长激素、胰高血糖素、甲状旁腺素、IL-2、IL-10、以及其片段、类似物、衍生物或变体,或两种或更多种这类生物活性肽的组合。以上提供的实例是非限制性的,且预期VSP载体可以用于递送其他生物活性肽和蛋白质。例如,VSP载体可以用于口服或粘膜递送包含抗原结合结构域的蛋白质,如抗体及其片段(例如scFv或包含scFv的分子)。
在一些特定的实施方案中,生物活性肽是胰岛素,例如天然胰岛素、重组胰岛素或胰岛素类似物。在一些实施方案中,胰岛素类似物是速效胰岛素(如门冬胰岛素)、长效胰岛素(如甘精胰岛素)或其组合。本领域已知很多胰岛素类似物。
治疗剂还可以包括通常称为药物的经典的低分子量治疗剂,包括但不限于,单独或组合的抗肿瘤剂、免疫抑制剂、抗增殖剂、抗凝血酶剂、抗血小板剂、抗脂质剂、抗炎剂、血管生成剂、抗血管生成剂、维生素、ACE抑制剂、血管活性物质、抗有丝分裂物质、金属蛋白酶抑制剂、NO供体、雌二醇或抗硬化剂(antisclerosing agent)。在一些实施方案中,药物是在水性条件下难溶的药物,例如抗生素。
治疗剂还可以是需要激活以具有治疗活性的化合物,例如前药或酶原。在此类实施方案中,治疗剂在与VSP载体组合施用于受试者后被代谢为所需的药物或生物剂。
在一些实施方案中,VSP载体直接与治疗剂结合。在其他方面,VSP载体与包含治疗剂的载体颗粒结合。因此,载体颗粒可以是病毒颗粒、病毒样颗粒(VLP)、纳米颗粒或脂质体。在一个特定的方面,载体颗粒是在其表面呈现治疗剂的病毒颗粒。在另一个方面,载体颗粒是不在其表面呈现治疗剂的病毒颗粒。在一个特定的方面,载体颗粒是在其表面呈现治疗剂的VLP。在另一个方面,载体颗粒是包封治疗剂的VLP。在一个特定的方面,载体颗粒是在其表面呈现治疗剂的纳米颗粒。在另一个方面,载体颗粒是包封治疗剂的纳米颗粒。在一个特定的方面,载体颗粒是在其表面呈现治疗剂的脂质体。在另一个方面,载体颗粒是包封治疗剂的脂质体。在另一个特定的方面,治疗剂包含于载体颗粒的表面内,例如在脂质体的脂质双层内。
在特定的实施方案中,载体颗粒是病毒样颗粒(VLP)。当使用病毒样颗粒时,它们可以根据本领域已知及例如在国际专利申请公开号WO2002/34893(其全文通过引用并入此文)中所描述的技术制备。在一些实施方案中,VLP在其表面呈现VSP载体和治疗剂。因此,在一些实施方案中,VSP载体可以与在VLP表面处暴露的治疗剂结合。
根据本发明的VSP载体可以形成允许将治疗剂正确递送至粘膜(例如肠粘膜)中而不在消化道中遭受降解的保护表面(像它在寄生虫滋养体中自然发生的一样)。
在某些实施方案中,在此提供的VSL载体不通过肽键与治疗剂共价连接。因此,在施用前,VSP载体与至少一种治疗剂“组合”。如上公开,术语“组合”是指掺混两种或更多种成分(如VSP载体和治疗剂)以使成分之间发生接触和这种接触允许所述两种或更多种成分的结合的过程。
在一些实施方案中,VSP载体可以与一种治疗剂组合。在其他实施方案中,VSP载体可以与超过一种治疗剂组合。在一些实施方案中,当VSP载体与超过一种治疗剂组合时,VSP载体可以只与一种治疗剂结合。在其他实施方案中,VSP载体可以与超过一种治疗剂结合。
在一些实施方案中,两种或更多种VSP载体可以与一种治疗剂组合。在其他实施方案中,两种或超过两种VSP载体可以与超过一种治疗剂组合。在一些实施方案中,当两种或超过两种VSP载体与超过一种治疗剂组合时,每种VSP载体可以只与一种治疗剂结合。在其他实施方案中,每种VSP载体可以与至少一种治疗剂结合。
在一些实施方案中,VSP载体与治疗剂的分子-分子比率(VSP载体:治疗剂)的范围是从约10:1至约1:10。在其他实施方案中,VSP载体与治疗剂的分子-分子比率(VSP载体:治疗剂)的范围是从约3:1至约1:3。在一些实施方案中,VSP载体与治疗剂的分子-分子比率(VSP载体:治疗剂)是3:1。在其他实施方案中,VSP载体与治疗剂的分子-分子比率(VSP载体:治疗剂)是1:1。
在一些实施方案中,VSP载体与治疗剂的分子-分子比率(VSP载体:治疗剂)是约1:1、约2:1、约3:1、约4:1、约5:1、约6:1、约7:1、约8:1、约9:1或约10:1。在一些实施方案中,VSP载体与治疗剂的分子-分子比率(VSP载体:治疗剂)大于10:1。在一些实施方案中,VSP载体与治疗剂的分子-分子比率(VSP载体:治疗剂)是约1:2、约1:3、约1:4、约1:5、约1:6、约1:7、约1:8、约1:9或约1:10。在一些实施方案中,VSP载体与治疗剂的分子-分子比率(VSP载体:治疗剂)小于1:10。
在一些方面,VSP载体与治疗剂共同施用,即,将它们同时向受试者施用,从而它们在施用时组合。在一些方面,VSP载体与治疗剂在施用前组合。在一些方面,VSP载体与治疗剂的组合可以在施用前至少约1分钟、至少约2分钟、至少约3分钟、至少约4分钟、至少约5分钟、至少约10分钟、至少约15分钟、至少约20分钟、至少约25分钟、至少约30分钟、至少约45分钟、至少约1小时、至少约2小时、至少3小时、至少约4小时或至少6小时发生。在一些实施方案中,VSP载体与治疗剂在施用前至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天或至少7天组合。在一些实施方案中,VSP载体与治疗剂以稳定的形式组合,该稳定形式可以在组合VSP载体和治疗剂后几天、几周或几个月使用。
VSP作为胰岛素载体
在某些方面,VSP载体可与胰岛素组合用于向受试者口服或粘膜施用。
如在此所用,术语“胰岛素”包含胰岛素类似物、天然的提取哺乳动物胰岛素(如人胰岛素)、重组生产的哺乳动物胰岛素(如人胰岛素)、从牛和/或猪源提取的胰岛素、重组产生的猪和牛胰岛素、在转基因动物中生产的胰岛素和任何这些胰岛素产物的混合物。该术语意欲包含通常用于治疗糖尿病的基本上纯化形式的多肽,但也包含以其可商购的药物形式(其包含附加的赋形剂)的术语的使用。用于与VSP载体组合的胰岛素可以是重组生产的,且可以是脱水的(完全干燥)或在溶液中。
术语“胰岛素类似物”是指如上定义的任何形式的“胰岛素”,其中多肽链内的一个或多个氨基酸被可选的氨基酸替换和/或其中一个或多个氨基酸被删除或其中在多肽链或氨基酸序列中加入一个或多个额外的氨基酸,其以降低的血糖水平发挥胰岛素的作用。一般地,术语“胰岛素类似物”包括,例如,如在美国专利号5,547,929(其全文通过引用并入此文)中公开的“赖脯胰岛素(insulin Lispro)”;包括赖脯胰岛素(LysPro insulin)和优泌乐(Humalog)胰岛素以及其他“超级胰岛素”类似物的胰岛素类似物,其中胰岛素类似物影响血糖水平的能力与传统胰岛素和在肝中比在脂肪组织中具有更高活性的肝选择性胰岛素类似物相比有实质性提高。术语“胰岛素类似物”还包括化学和酶修饰的胰岛素(例如化学转化为人胰岛素的哺乳动物胰岛素)、NPH胰岛素(例如中效低精蛋白锌胰岛素)、门冬胰岛素、谷赖胰岛素、甘精胰岛素、地特胰岛素、德谷胰岛素等等。
在一些实施方案中,胰岛素类似物是单体胰岛素类似物,它们是用于与胰岛素相同的一般用途的胰岛素样化合物,如赖脯胰岛素,例如施用来降低血糖水平的任何化合物。
“胰岛素类似物”是公知的化合物。已知胰岛素类似物分为两类:动物胰岛素类似物和修饰的胰岛素类似物(第716-20页,第41章,NolteM.S和Karam,J.H.,"Pancreatic Hormones&Antidiabetic Drugs"In Basic&Clinical Pharmacology,Katzung,B.G.,Ed.,Lange Medical Books,NewYork,2001)。历史上,动物胰岛素类似物包括广泛用于治疗糖尿病的猪胰岛素(与人胰岛素有一个氨基酸的差异)和牛胰岛素(与人胰岛素有三个氨基酸的差异)。随着基因工程技术的发展,对其进行了修饰以产生修饰的胰岛素类似物,包括速效胰岛素类似物或长效胰岛素类似物。在本申请的申请日之前,市场上已经有几种胰岛素类似物分子。例如,Eli Lilly以商标名上市了称为“Lispro”的速效胰岛素类似物,Novo Nordisk以商标名售卖另一种称为“Aspart”的速效胰岛素类似物。此外,Aventis以商标名上市了称为“Glargine”的长效胰岛素类似物,且Novo Nordisk以商标名上市了另一种称为“Detemir”的长效胰岛素类似物。上文引用的Nolte和Karam(2001)文献的表41-4提供了总称为胰岛素的广泛类型的分子的非限制性列表。
术语胰岛素还包括与一个或多个异源部分共价偶联的如上定义的胰岛素,其与天然胰岛素相比可以提高药代动力学和/或药效学性能,例如PEG化胰岛素(参见例如美国专利号6,890,518)。也参见美国专利号7,049,286、7,470,663、6,890,518及美国申请公开号US2008/0139784、US2011/0281791、US2009/0036353、US20110020871、US2009/0239785。
在一些实施方案中,VSP载体可以与具有促胰岛素活性的非胰岛素肽组合。在一些实施方案中,具有促胰岛素活性的非胰岛素肽是肠促胰素。在一些实施方案中,肠促胰素是胰高血糖素样肽-1(GLP1)受体激动剂。在一些实施方案中,VSP载体可以与GLP1或其类似物、变体、片段或衍生物组合。在一些实施方案中,GLP1类似物是利拉鲁肽(以VICTOZATM上市销售)。在其他实施方案中,GLP1类似物是阿必鲁肽。在再其他实施方案中,GLP1类似物是他司鲁肽。
在其他实施方案中,VSP载体可以与醋酸艾塞那肽(exendin-4)或其类似物、变体、片段或衍生物组合。在一些实施方案中,VSP载体可以与艾塞那肽(以和上市销售)组合。在其他实施方案中,VSP载体可以与lisexenatide组合。
仍在其他实施方案中,VSP载体可以与DPP-4抑制剂(列汀)组合。在一些实施方案中,DPP-4抑制剂是阿格列汀。在其他实施方案中,DPP-4抑制剂是例如,西他列汀(以上市销售)、维格列汀(以上市销售)、沙克列汀(以上市销售)、利格列汀(以上市销售)、度格列汀、吉格列汀、黄连素或羽扇豆醇。
作为胰高血糖素载体的VSP
在某些方面,VSP载体可与胰高血糖素组合用于向受试者口服或粘膜施用。
如在此所用,术语“胰高血糖素”包含胰高血糖素类似物、天然的提取哺乳动物胰高血糖素(如人胰高血糖素)、重组生产的哺乳动物胰高血糖素(如人胰高血糖素)、从牛和/或猪源提取的胰高血糖素、重组产生的胰高血糖素、在转基因动物中生产的胰高血糖素和任何这些胰高血糖素产物的混合物。该术语意欲包括通常用于治疗低血糖症的基本上纯化形式的多肽,但也包括以其可商购的药物形式(其包括附加的赋形剂)的术语的使用。用于与VSP载体组合的胰高血糖素可以是重组生产的。在一些实施方案中,胰高血糖素可以是脱水的(完全干燥)或在溶液中。
作为生长激素载体的VSP
在某些方面,VSP载体可与生长激素(如人生长激素)组合用于向受试者口服或粘膜施用。
术语“生长激素(GH)”一般是指由哺乳动物的垂体腺分泌的生长激素。虽然不是一个穷尽的列表,哺乳动物的实例包括人、猿、猴、大鼠、猪、狗、兔子、猫、奶牛、马、小鼠、大鼠和山羊。在本发明的一些实施方案中,哺乳动物是人。
术语“人生长激素”和“hGH”可互换使用,且是指具有天然人生长激素的氨基酸序列、结构和功能特征的蛋白质。如在此所用,hGH还包括天然人生长激素的任何异形体,包括但不限于,具有5、17、20、22、24、36和45kDa分子量的异形体(参见例如,Haro等,J.Chromatography B,720,39-47(1998))。因此,术语hGH包括天然hGH的191个氨基酸序列、促生长素、和包含N-末端甲硫氨酸的192个氨基酸序列(Met-hGH)和人蛋氨生长素(somatrem)(参见例如,美国专利号4,342,832和5,633,352)。hGH可以通过从生物来源分离和纯化获得或通过重组DNA方法获得。Met-hG通常通过重组DNA方法制备。
术语“人生长激素”还包括人生长激素衍生物。术语“人生长激素衍生物”是指与hGH的191氨基酸序列或Met-hGH的192氨基酸序列的氨基酸序列有至少约1%但不超过20%的差异的蛋白质。例如,衍生物可以与hGH的191氨基酸序列或Met-hGH的192氨基酸序列有约1%至约20%、约2%至约15%、或约5%至约10%的差异;蛋白质可以与hGH的191氨基酸序列或Met-hGH的192氨基酸序列有约1%、约2%、约3%、约4%、约51%、约6%、约7%、约8%、约9%、约10%、约11%、约12%、约13%、约14%或约15%的差异。衍生物与hGH的191氨基酸序列或Met-hGH的192氨基酸序列之间的差异可以是一个或多个置换(例如,保守性或非保守性置换)、缺失、添加(例如,插入或者氨基-或羧基-末端的添加)、修饰或其组合。
在一些实施方案中,hGH衍生物保持了191个氨基酸的hGH或192个氨基酸的Met-hGH氨基酸序列的生物活性和/或化学和/或物理性质。同样地,在一些实施方案中,包含衍生物的制剂(例如与结晶hGH衍生物复合的聚Arg的制剂)具有包含191个氨基酸的hGH或192个氨基酸的Met-hGH氨基酸序列的类似制备制剂(例如与结晶hGH复合的聚Arg的制剂)的化学和/或物理性质。
在本公开的各种实施方案中,人生长激素衍生物包含hGH或Met-hGH的有机阳离子、生物合成的hGH或Met-hGH蛋白的置换、缺失和插入变体、翻译后修饰(包括,但不限于脱酰胺、磷酸化、糖基化、乙酰化、聚集和酶裂解反应)的hGH或Met-hGH蛋白(参见例如,Haro等,J.Chromatography B,720,39-47(1998))、源自生物来源的化学修饰的hGH或Met-hGH蛋白、多肽类似物和包含与hGH或Met-hGH氨基酸序列类似的氨基酸序列的化学合成肽。用来制备hGH或Met-hGH的方法包括从生物来源分离、重组DNA方法、合成化学途径或其组合。编码hGH的不同DNA序列的基因包括hGH-N和hGH-V(参见例如,Haro等,J.Chromatography B,720,39-47(1998);Bennani-Baiti等,Genomics,29,647-652(1995))。hGH的冻干形式可商购且通常通过重组DNA方法制备。
VSP载体的生产
可以通过构建包含编码VSP载体的多核苷酸的表达载体实现VSP载体的重组表达。一旦获得编码VSP载体的多核苷酸,用于生产VSP载体的载体(vector)可以使用本领域公知的技术通过重组DNA技术产生。
通过表达包括VSP载体-编码核苷酸序列的多核苷酸来制备蛋白质的方法在本领域中是已知的。可以采用本领域技术人员公知的方法来构建包括VSP载体编码序列和合适的转录翻译控制信号的表达载体。这些方法包括,例如体外重组DNA技术、合成技术和体内遗传重组。因此,本公开提供包含编码VSP载体的核苷酸序列与启动子可操作连接的可复制载体。
可以通过常规技术将表达载体转移至宿主细胞,然后可以通过常规技术培养转染的细胞以产生VSP载体。因此,本发明包括包含编码VSP载体的多核苷酸(其与启动子可操作连接)的宿主细胞。合适的宿主细胞包括但不限于,微生物如细菌(例如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌(B.subtilis))、真菌细胞、哺乳动物细胞或昆虫细胞。
可以使用各种宿主表达载体系统来表达本公开的VSP载体。此类宿主表达系统代表目标编码序列可以通过其生产并随后纯化的媒介,但还代表当用合适的核苷酸编码序列转化或转染后时可以原位表达VSP载体的细胞。这些包括,但不限于微生物,如用包含VSP载体编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌(例如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌)、真菌细胞系统(例如酵母属(Saccharomyces)或毕赤酵母属(Pichia))、哺乳动物细胞系统(例如COS、CHO、BHK、293、NSO和3T3细胞)或昆虫细胞系统(Sf9、Hi5)。一旦VSP载体通过重组表达产生,它可以通过本领域已知的用于纯化蛋白质的任何方法纯化。
在一些实施方案中,编码VSP载体的DNA经密码子优化以在昆虫蛋白表达系统(例如杆状病毒表达系统)中表达。在一些实施方案中,VSP载体在昆虫蛋白表达系统(例如Sf9或Hi5昆虫细胞中的杆状病毒表达系统)中表达。
药物组合物
在另一个方面,本公开提供治疗组合物,包括但不限于,包含与一个或超过一个治疗剂组合的一个或超过一个的VSP载体(其与药学上可接受的赋形剂一起配制)的药物组合物。此类组合物可以包括一个VSP载体或者两个或更多个不同VSP载体的组合。例如,药物组合物可以包含与相同治疗剂结合或与超过一个治疗剂结合的VSP载体的组合。这些治疗剂可以具有互补的活性。在特定的方面,药物组合物包含单一VSP载体。在特定的实施方案中,药物组合物包含超过一个VSP载体。
包含一个或多个VSP载体的药物组合物也可以在联合疗法中施用。例如,联合疗法可以包括与至少一种其他疗法组合的药物组合物,所述药物组合物包含与至少一种治疗剂组合的至少一个VSP载体,其中所述疗法可以是免疫疗法、化疗、放疗或药物治疗。本发明的药物组合物可以包括一个或多个药学上可接受的盐。
在本发明考虑的药物组合物中可以使用的合适水性和非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物、植物油如橄榄油、和可注射的有机酯类,如油酸乙酯。适当的流动性可以通过例如使用包被材料(如卵磷脂)、在分散体的情况下通过保持所需颗粒尺寸和通过使用表面活性剂来维持。
在另一个方面,包含VSP载体的药物组合物还可以包含如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂的试剂。可以通过灭菌程序和通过包含各种抗细菌和抗真菌剂(例如,对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸等)来保证预防微生物的存在。在组合物中包括等渗剂(如糖、氯化钠等)也是所需的。此外,通过包含延迟吸收的试剂(如单硬脂酸铝和明胶)可以带来延长的吸收。
药学上可接受的载体包括用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌水性溶液或分散体和无菌粉末。用于药学活性物质的此类介质和药剂的使用在本领域中是已知的。除了与活性化合物不相容的任何常规介质或试剂,考虑其在本发明的药物组合物中的使用。在本发明的药物组合物中还可以包括补充活性化合物。
包含VSP载体的药物组合物中活性成分的实际剂量水平可以变化以获得对特定患者、组合物和施用方式有效地实现理想的治疗反应且对患者无毒性的活性成分的量。选择的剂量水平将取决于各种药代动力学因素,包括采用的具体组合物或其酯、盐或酰胺的活性、施用途径、施用时间、采用的具体化合物的排泄率、治疗持续的时间、与采用的具体组合物组合使用的其他药物、化合物和/或材料、被治疗患者的年龄、性别、体重、状况、总体健康和历史病史、以及在医学领域公知的类似因素。
包含VSP载体的药物组合物的治疗有效剂量可以通过疾病症状严重程度的降低、无疾病症状时间的频率和持续时间的增加、或由于疾病折磨引起的损伤或残疾的预防来表示。治疗有效剂量也可以防止或延迟疾病发作。因此,可以使用任何临床或生化监测分析来确定特定的治疗是否是治疗有效剂量。本领域技术人员能够根据受试者的体型、受试者症状的严重程度和选择的具体组合物或施用途径这类因素来确定这类量。
包含VSP载体的治疗组合物特别良好地适用于口服施用。或者,包含VSP的治疗组合物可以通过非肠道外途径施用,例如局部、上皮或粘膜施用途径,例如鼻内、口腔、阴道、直肠、舌下或局部施用。当然,包含VSP载体的治疗组合物可以采用本领域已知的多种方法中的一种或多种通过一种或多种可选施用途径施用。如技术人员将会理解的,施用途径和/或方式将根据所需结果变化。
在某些实施方案中,将包含VSP载体的治疗组合物配制用于口服或粘膜施用。用于口服或粘膜施用的剂量可以根据各种参数调整,且尤其根据相关病理学、或可选地所需的治疗持续时间而调整。
在配制时,包含VSP载体的药物组合物可以与剂型相容的方式且以治疗有效的这种量施用。制剂容易以各种剂型施用,例如药片或用于口服或粘膜施用的其他固体的类型、缓释胶囊和目前使用的任何其他形式。因此,药物组合物可以是喷剂、气雾剂、混合物、悬浮液、分散液、乳剂、凝胶剂、糊剂、糖浆剂、霜剂、软膏、植入物(耳、眼、皮肤、鼻、直肠和阴道)、乳房内制剂、阴道塞剂、栓剂或子宫剂(uteritories)的形式。在某些实施方式中,设想脂质体的使用。脂质体的形成和使用是本领域的技术人员已知的。
更特别地,在必要时,药物组合物配制为使得本发明的治疗组合物中的治疗剂对上胃肠道的酶降解和化学降解具有抗性。此外,在某些实施方案中,VSP载体应该能够附着于细胞,更特别是肠道的上皮细胞。
方法
本公开的VSP载体具有体外和体内的治疗性和诊断性用途。例如,VSP载体可以用来向培养物中(例如,体外或离体)或受试者中(例如,体内)的细胞施用治疗剂或诊断试剂以治疗、预防或诊断多种失调。在本发明中考虑的疾病、失调或生理状况可以是,但不限于,激素缺乏症、癌症、免疫疾病、自身免疫性疾病、同种异体移植排斥反应、病毒性疾病如流感或AIDS、寄生虫病、细菌感染或过敏。
本公开提供将治疗剂递送至受试者的靶位置的方法,包括施用包含VSP载体和治疗剂的治疗组合物。在公开的递送方法的一些特定实施方案中,VSP载体是VSP1267,且治疗剂是生物活性肽,如胰岛素、胰高血糖素或hGH。
还提供治疗受试者的疾病或状况的方法,包括向所述受试者施用有效量的包含VSP载体和治疗剂的治疗组合物。在一些实施方案中,疾病或状况是激素缺乏症。在特定的实施方案中,激素缺乏症是胰岛素缺乏症。在一些实施方案中,胰岛素缺乏症是1型糖尿病。在一些特定的实施方案中,治疗激素缺乏症的方法包括使用VSP1267载体和生物活性肽,如胰岛素、胰高血糖素或hGH。
本公开还提供治疗受试者的疾病或状况的方法,包括将VSP载体和治疗剂组合,和向所述受试者施用有效量的VSP载体与治疗剂的组合,其中VSP载体可以与治疗剂结合。在一些特定的实施方案中,VSP载体是VSP1267,且它与治疗剂组合,所述治疗剂是生物活性肽,如胰岛素、胰高血糖素或hGH。
本公开还提供制备可口服或粘膜递送的组合物的方法,包括将VSP载体和治疗剂组合,其中VSP载体可以与治疗剂结合。在一些特定的实施方案中,所述可口服或粘膜递送的组合物包含与治疗剂组合的VSP1267载体,所述治疗剂是生物活性肽,如胰岛素、胰高血糖素或hGH。
在此还公开制备适于口服或粘膜施用的可注射组合物的方法,包括将VSP载体和治疗剂组合,其中VSP载体可以与治疗剂结合。在一些特定的实施方案中,所述可口服或粘膜递送的可注射组合物包含与治疗剂组合的VSP1267载体,所述治疗剂是生物活性肽,如胰岛素、胰高血糖素或hGH。
在本公开中还提供提高治疗剂对酶降解抗性的方法,包括将VSP载体和治疗剂组合,其中VSP载体可以与治疗剂结合,且其中将VSP载体和治疗剂组合导致治疗剂对酶降解的抗性提高。在一些特定的实施方案中,VSP载体是VSP1267,且治疗剂是生物活性肽,如胰岛素、胰高血糖素或hGH。
本公开还提供提高治疗剂对pH变性的抗性的方法,包括将VSP载体和治疗剂组合,其中VSP载体可以与治疗剂结合,且其中将VSP载体和治疗剂组合导致治疗剂对pH变性的抗性提高。在一些特定的实施方案中,VSP载体是VSP1267,且治疗剂是生物活性肽,如胰岛素、胰高血糖素或hGH。
本公开还提供同时提高治疗剂对酶降解抗性和其对pH变性的抗性的方法,包括将VSP载体和治疗剂组合,其中VSP载体可以与治疗剂结合,且其中将VSP载体和治疗剂组合导致治疗剂对酶降解抗性的提高和对pH变性的抗性的提高。在一些实施方案中,当暴露于约1至约2之间、或约2至约3之间、或约3至约4之间、或约4至约5之间、或约5至约6之间、或约6至7之间、或约7至约8之间、或约8至约9之间、或约9至约10之间、或约10至约11之间、或约11至约12之间、或约12至约13之间、或约13至约14之间的pH范围时,VSP载体与治疗剂的组合提高治疗剂对pH介导的降解的抗性。在一些特定的实施方案中,VSP载体是VSP1267,且治疗剂是生物活性肽,如胰岛素、胰高血糖素或hGH。
还提供增强治疗剂对粘膜上皮细胞的附着性的方法,包括将VSP载体和治疗剂组合,其中VSP载体可以与治疗剂结合,且其中将VSP载体和治疗剂组合导致治疗剂对粘膜上皮细胞的附着性提高。在一些特定的实施方案中,VSP载体是VSP1267,且治疗剂是生物活性肽,如胰岛素、胰高血糖素或hGH。在一些实施方案中,粘膜上皮细胞是肠道上皮细胞。在其他实施方案中,粘膜上皮细胞是胃上皮细胞。在其他实施方案中,粘膜上皮细胞是口腔上皮细胞。粘膜递送,即通过VSP载体递送治疗剂至粘膜组织是指,例如,递送至支气管和其他呼吸道粘膜组织、牙龈、舌、鼻、口腔、胃肠道和泌尿生殖道粘膜组织。
本发明还提供在诊断中使用VSP载体的方法。在一些实施方案中,VSP载体可与一种或超过一种诊断试剂组合。本发明还提供使用VSP载体使特定靶标成像的方法。在一个实施方案中,VSP载体是在对特定靶标的存在、位置或发展成像的方法中使用的组合成像剂,例如绿色荧光蛋白、其他荧光标签(Cy3、Cy5、罗丹明和其他)、生物素或放射性核素。在一些方面案中,成像包含VSP载体的靶标的方法通过MRI、PET扫描、X-射线、荧光检测或本领域已知的其他检测方法进行。
包含VSP载体使用的疗法可与适合于预防、治疗、减少或改善疾病或其症状的常规疗法组合。示例性的常规疗法可以在医师的案头参考(Physician’s Desk Reference)(第56版,2002和第57版,2003)中找到。在一些实施方案中,使用VSP载体的疗法可与化疗、放疗、手术、利用生物制剂(例如,抗体或其抗原-结合片段、或肽,如生物活性肽)的免疫疗法、小分子、或本领域已知的另一个疗法组合。在一些实施方案中,组合疗法与包含VSP载体使用的疗法一起施用。在其他实施方案中,组合疗法与包含VSP载体使用的疗法单独地施用。
本公开还提供使用VSP载体监测疾病进展、复发、治疗或改善的方法。在一个实施方案中,监测疾病进展、复发、治疗或改善的方法通过成像、诊断或将化合物/靶标与在此展示的VSP载体接触的方法完成。
本公开还提供通过将溶解性差的药物(如小分子药物)与VSP载体组合来增加其溶解度的方法,其中溶解性差的药物与VSP载体的结合增加药物的溶解度。在一些实施方案中,溶解性差的药物是用来治疗激素失调的小分子药物(如抗糖尿病小分子药物)。在其他实施方案中,溶解性差的药物是抗生素。在一些实施方案中,抗生素是氨基糖苷类抗生素,如丁胺卡那霉素。在其他实施方案中,抗生素是糖肽类抗生素,如万古霉素。
试剂盒
还提供包含填充有在此公开的一种或多种药物组合物的一个或多个容器的药物包装或试剂盒。任选地与这些容器相关的可以是由监管药物或生物制品的制造、使用或销售的政府机构规定的形式的告示,该告示反映了监管制造、使用或销售用于人类施用的机构的批准。本公开提供可以在以上治疗和施用方法中使用的试剂盒。在一个方面,试剂盒包含在一个或多个容器中的VSP载体,优选以纯化形式。在一些实施方案中,试剂盒包含在一个容器中与治疗剂组合的VSP载体。在其他实施方案中,试剂盒包含在不同容器中的VSP载体和治疗剂。
等同
本领域技术人员应当理解或能够仅使用常规实验确定在此所述的本发明特定实施方案的许多等同。此类等同意图被以下权利要求涵盖。
在此引用的所有文献、专利和专利申请其全文在此通过引用明确并入此文。
实施例
实施例1.VSP对可变pH和对肠蛋白酶消化的抗性
VSP是原生动物寄生虫(如蓝氏贾第虫)的膜内在蛋白,其具有富含CXXC基序的可变细胞外区域、独特的跨膜疏水区和短的、5个氨基酸长度的胞质尾(图1A)(Lujan,Essays Biochem.51:177-91(2011);Prucca等,Annu.Rev.Microbiol.65:611-30(2011))。如图1B和1C所示,各滋养体(贾第虫寄生虫的主动、能动阶段,其在几种脊椎动物的小肠上部定殖并疾病症状的原因)在其表面上表达单一VSP。图1B显示相差(左图)和免疫荧光(右图)分析,表明如通过用抗VSP9B10特异性单克隆抗体标记的表面所证明的,在一组贾第虫滋养体中只有一个在其表面上表达VSP9B10VSP,而其他细胞表达不同的表面蛋白(Prucca&Lujan,Cell.Microbiol.11:1706-15(2011)。图1C示出了采用抗VSP特异性单克隆抗体的贾第虫滋养体的免疫电子显微图像。可以观察到寄生虫的整个表面被标记,包括腹盘和鞭毛,从而产生由VSP组成的厚的表面包被,其在小肠上部的高度水解环境中保护寄生虫(Pimenta等,Infect.Immun.59:3989-96(1991))。
当加入到培养物中时,纯化的VSP对细胞无毒性,且当通过口服途径施用时,它们对动物是无毒的。动物没有通常与贾第虫感染相关的减重和腹泻(参见Rivero等,Nat.Med.16(5):551-7(2010))。除了它们的无毒性,为可用作治疗剂载体,VSP必须能够在GIT的恶劣环境中存活。
为了确定VSP是否对可变pH和对蛋白水解消化有抗性,用胰蛋白酶和用可变pH处理两个不同的贾第虫分离物(克隆滋养体群体),并用免疫荧光分析监测这些条件对各个分离物表达的VSP的影响。
对于胰蛋白酶抗性分析,在pH7.4的PBS中重悬浮贾第虫寄生虫,并用与在小肠上部发现的胰蛋白酶相似的不同浓度的胰蛋白酶处理90分钟。然后,洗涤寄生虫,并与两种单克隆抗体一起孵育,每个抗体识别测试的两个分离物(GS/M分离物和WB分离物)中各自表达的特定VSP。单克隆抗体G10/4识别GS/M分离物的VSPH7中的构象表位。单克隆抗体9B10检测WB分离物的VSP9B10中的非构象表位。抗体使滋养体凝集并标记寄生虫的表面(Rivero等,Nat.Med.16:551-7(2010))。
在用100μg/mL或200μg/mL胰蛋白酶孵育后,观察到仍然可以通过单克隆抗体检测到两种VSP蛋白的存在,表明两种VSP在胰蛋白酶消化中保存下来(图2A)。
对于pH抗性分析,在从pH 1到pH 10的不同pH(以1pH增量增加)下RPMI细胞培养基中重悬浮贾第虫寄生虫(图2B只示出了pH1、3、5和10)。贾第虫寄生虫在不同pH下保持90分钟,洗涤,然后与相应的单克隆抗体一起孵育。在所有情况下,如免疫荧光显微镜测定的,VSPH7和VSP9B10中的VSP表位保持完整,表明两种VSP在暴露于不同pH下没有发生化学降解而保存下来(图2B)(Rivero等,Nat.Med.16:551-7(2010))。
对蛋白水解消化的抗性也在用胰蛋白酶处理滋养体之后使用蛋白质印迹分析VSP证明(图3)。在pH 7.4的PBS中重悬浮贾第虫寄生虫克隆WB-9B10、WB-1267和GS-H7(分别表达VSP9B10、VSP1267和VSPH7VSP),并在37℃下用不同浓度的胰蛋白酶(200μg/mL和2mg/mL)处理90分钟。然后,裂解寄生虫,并在SDS-PAGE凝胶的每条泳道中施用等同蛋白量。图3表明测试的三种VSP能够在暴露于胰蛋白酶时保存下来。
这些结果说明,VSP对化学和蛋白水解降解有抗性,且可以在与GIT上部中发现的环境条件相似的环境条件下保存下来。
实施例2.口服施用后VSP对肠粘膜的附着
在沙鼠中进行体内分析以测定口服施用后,VSP是否能附着于肠粘膜。用贾第虫寄生虫克隆WB-9B10滋养体感染一组沙鼠(图4,A图),第二组没有感染(图4,B图),并用自转基因滋养体纯化的整个VSP集合免疫第三组沙鼠(图4,C图)。来自每组的组织切片与抗VSP9B10单克隆抗体一起孵育,用辣根过氧化物酶标记的抗-小鼠免疫球蛋白检测,用3,3’-二氨基联苯胺显色,并用苏木精/曙红复染。
观察到与未感染动物(B图)相比,感染的动物或免疫的动物(A图和C图)在肠上皮细胞表面的染色水平有巨大差异,表明口服施用后,VSP仍然附着于肠粘膜。
这些结果与实施例1的结果一起表明,VSP在GIT的pH和酶条件下保存且成功附着于肠上皮细胞。这些理化性质允许VSP运送药物通过GIT,且在GIT中延长的停留时间允许VSP携带的药物从GIT传送到血流。
实施例3.VSP1267VSP载体的重组产生
设计并重组产生了修饰的VSP蛋白以获得用于口服施用实验的VSP载体。全长VSP包含信号肽、含有多个CXXC基序的富含半胱氨酸的细胞外区域、跨膜区和短胞质尾(图1A)。生成DNA构建体,其中去除了VSP1267的跨膜区和5个胞质残基,并在羧基末端添加了His6蛋白质纯化标签(图5A)(SEQ ID NO:1)。信号序列在图5A中加上了下划线。His6蛋白质纯化标签中的氨基酸在图5A中显示于方框中。
首先,采用pET28表达载体(Novagen)在大肠杆菌BL21中重组表达VSP载体。随后通过对于在杆状病毒中表达的重组DNA序列的密码子优化提高蛋白质产量。异源VSP产生通过对于采用杆状病毒表达系统在Sf9昆虫细胞中表达的重组DNA序列密码子优化之后,克隆编码VSP1267变体的VSP DNA片段(图5A)(SEQ ID NO:1)进行。蛋白质从细胞培养上清液表达,并利用在该蛋白质羧基末端部分中存在的His6标签通过Nickel Sepharose柱中的一步亲和纯化进行纯化(图5B)。结果表明,洗脱的VSP是高度纯化的。
实施例4.商业胰岛素对胰蛋白酶的敏感性
为了体外测试VSP载体保护生物活性肽不被降解的能力,评估了重组VSP1267在与GIT中存在的条件相似的条件下保护胰岛素的能力。天然胰岛素是分子量为5.8-6kDa的生物活性肽。在评估VSP在GIT中保护胰岛素不被体内降解的能力之前,体外测试了两种商业胰岛素对通过胰蛋白酶(高度纯化的胰腺蛋白酶)和胰液素(水解性胰腺酶的商业混合物)的蛋白水解的敏感性。
测试了两种商业胰岛素:
· 甘精胰岛素(Sanofi-Aventis)。与天然人胰岛素不同的是,位置A21的氨基酸天冬酰胺被甘氨酸替换,且在B链的C末端加入了两个精氨酸;MW:6063kDa。它是长效胰岛素。
· 门冬胰岛素(Novo/Nordisk)。与人胰岛素不同的是,正常情况下是脯氨酸的氨基酸B28被天冬氨酸残基取代。它是速效胰岛素。
图6示出了在将胰岛素与100、150、200、500和1000μg/mL的胰蛋白酶以及将胰液素以1:1和1:2的酶:底物比一起预孵育之后和的蛋白水解谱。用银染可视化胰岛素和它们的降解产物。胰岛素在分析的实验条件下不易降解。然而,对于观察到与胰岛素剂量相关的蛋白水解降解的增加。
实施例5.体内VSP保护胰岛素不被降解的能力
分析胰岛素与VSP载体VSP1267的组合以确定VSP是否可以(i)在口服施用时保护胰岛素不被降解以及(ii)促进其全身性生物作用,即调节血糖水平。因此,首先确定了胰岛素的口服亚最适量,然后确定该亚最适量的胰岛素与VSP载体的组合是否可以促进胰岛素的生物作用(参见图7)。
通过测试胰岛素的降血糖能力测量其生物活性。因此,在2小时没有进食的7周大的雌性Balb/c小鼠中定量血糖水平。该小鼠在饥饿时段后接受1IU、5IU和50IU口服剂量的(图7A)或(图7B)。在所示时间点测定血糖水平。作为阳性对照,也在皮下施用1-5IU的胰岛素之后定量血糖水平。这些实验表明,1IU的胰岛素是可以在随后测试与VSP载体组合施用胰岛素的实验中使用的亚最适口服剂量(参见图8)。
图8所示的结果表明,当通过口服途径施用时,与VSP载体组合施用胰岛素促进了胰岛素的作用。在该实验中,7周大的雌性Balb/c小鼠2小时没有进食,然后以图7中确定的亚适量(1IU)以三种不同制剂(i)单独施用胰岛素,(ii)以1:1的比率与VSP组合的胰岛素,和(iii)以1:3的比例与VSP组合的胰岛素接受胰岛素剂量,(图8A)和(图8B)。用PBS和1-5IU胰岛素皮下施用作为对照。1IU胰岛素与VSP的组合(对于以胰岛素/VSP比1:1,对于以胰岛素/VSP比1:3)增强了胰岛素的生物作用(带圆圈的)。
实施例6.VSP1267 VSP载体对人生长激素(hGH)的体外保护
为了评估VSP载体体外保护生物活性肽不被降解的能力,我们评估了重组VSP1267在与GIT中存在的条件相似的条件下保护人生长激素(191个氨基酸长度的蛋白质)(促生长素(Somatotropin),hGH)(Biosidus,阿根廷)的能力。与之前用单独VSP进行的分析相似,分析了VSP保护hGH免于由极端pH或由酶促蛋白水解引起的降解的能力。
首先,通过蛋白质印迹法测定抗hGH单克隆抗体(αhGH)的特异性(图9)。采用单克隆抗体αhGH的两种稀释液(1/3000和1/2000),和对照抗碱性磷酸酶抗体(α小鼠-AP1)检测hGH(在大肠杆菌中产生的重组人生长激素)。αhGH单克隆抗体只识别正确hGH分子量(22.1KDa)的一条带。采用不同量的hGH(0.25、0.5、1、5和10μg)。αhGH特异性单克隆抗体能够在非常高的稀释度下检测非常少量的激素。用作对照的抗小鼠抗体没有显示出反应。
随后采用抗hGH单克隆抗体测定hGH对不同pH的抗性程度。在不同pH(1.6、2.0、3.8、5.0、5.8、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0)下孵育hGH 90分钟。图10A的上图所示的蛋白质印迹结果和图10A的下图所示的激素银染检测表明,在较高的pH下,hGH与对照相比保持不变。在轻度酸性pH下激素经历自动蛋白水解过程,其不干扰抗GH抗体的识别(参见例如,Such-Sanmartín等,Growth Factors 27:255-64(2009))。然而,在非常低的pH(与在胃中发现的pH相似)下,部分激素高度降解(图10A,圆圈)。
当VSP载体以3:1VSP/hGH比加入hGH中且在不同pH(pH1.4、1.96、3.8、4.91、5.9、7.01、7.95、8.51、9.61和11.17)下孵育混合物时,相对于在不存在VSP的情况下hGH的hGH降解水平没有观察到显著变化(图10B)。
还用几种浓度的胰蛋白酶(0、100、150、200和500μg/mL)在37℃下处理hGH 90分钟。图11A的上图所示的蛋白质印迹结果和图11A的下图所示的激素银染检测表明,激素在甚至最低的蛋白酶浓度下降解。以3:1的比例加入VSP能够保护hGH不被胰蛋白酶降解(图11B)。这种保护效果在高达150μg/mL的胰蛋白酶浓度下观察到。
实施例7.与VSP载体组合施用的人生长激素(hGH)的体内保护
在口服施用后测试hGH血清水平,从而评估不同剂量和测量时间,以确定与VSP载体VSP1267组合的最佳剂量(图11A)。跟之前的实验一样,7周大的雌性Balb/c小鼠2小时没有进食,然后接受如图12A所示的剂量(即,50、100、200、400和800μg的hGH)。在平行实验中,皮下施用hGH(图11A,插图)。观察到单独的hGH以比皮下吸收低得多的水平被口服吸收(图11A,主图)。然而,这种口服吸收的时间和量高度可变。因此,无法确定吸收与这些变量(时间和浓度)之间的直接关系。尽管存在这些结果,我们采用50μg的剂量来评估hGH与VSP载体组合的效果。
图12示出了时间反应图,其显示了7周大的雌性Balb/c小鼠的血清hGH水平,该小鼠2小时没有进食,随后接受了与VSP载体组合的50μg剂量的hGH。与没有VSP载体的情况下口服施用单独hGH相比,口服施用1:3比率的hGH:VSP(50μg hGH与150μg VSP组合)提高了hGH的吸收。
实施例8.与VSP载体组合的甲状旁腺素的体外和体内保护
甲状旁腺激素(PTH)、甲状旁腺素或副甲状腺素是由甲状旁腺的主细胞分泌的包含84个氨基酸的多肽。它的作用是增加血液中的钙(Ca2+)浓度,而降钙素(由甲状腺的滤泡旁细胞(C细胞)产生的激素)的作用是降低钙浓度。PTH通过作用于甲状旁腺激素1受体(在骨骼和肾脏中水平高)和甲状旁腺激素2受体(在中枢神经系统、胰腺、睾丸和胎盘中水平高)增加血液中的钙浓度。PTH的半衰期大约是4分钟。它的分子量是9.4kDa。血液中的低水平PTH被称为甲状旁腺功能减退症。其起因包括手术事故(如常规甲状腺手术中不慎去除)、自身免疫性疾病和先天性代谢缺陷。甲状旁腺功能减退症可以例如用合成的PTH 1-34(特立帕肽)治疗。可以几种不同形式测量血液中的PTH:完整的PTH、N-末端PTH、中间分子PTH和C-末端PTH,且在不同临床情况中采用不同测试。
为了在体外评估VSP载体保护甲状旁腺素不被降解的能力,将评估VSP载体(例如VSP载体VSP1267)在与GIT中存在的条件相似的条件下保护人甲状旁腺素的能力。采用以上实施例中所述的方法分析VSP保护甲状旁腺素免于由极端pH或由酶促蛋白水解引起的降解的能力。
在不同pH下或与不同浓度的蛋白水解酶(如胰蛋白酶)孵育单独的或与VSP载体混合的甲状旁腺素。采用抗甲状旁腺素单克隆抗体检测pH和蛋白水解酶挑战之后甲状旁腺素的存在。
实验结果将表明VSP载体与甲状旁腺素的组合是否会提高甲状旁腺素对蛋白水解和对pH-诱导的降解的抗性。
将采用之前实施例中所述的方法进行体内分析,以确定与VSP载体组合口服施用甲状旁腺素是否会在GIT的条件下保护甲状旁腺素并相对于没有VSP载体的情况下口服施用甲状旁腺素导致吸收增加。例如,在向小鼠以不同剂量和甲状旁腺素/VSP比率口服施用甲状旁腺素(单独或与VSP载体组合)后,在不同时间点测量甲状旁腺素血清水平。结果将表明当甲状旁腺素与VSP载体组合施用时,与没有VSP载体的情况下口服施用单独甲状旁腺素相比,甲状旁腺素的吸收和甲状旁腺素的血清水平是否增加。
实施例9.与VSP载体组合的白细胞介素2(IL-2)的体外和体内保护
在初步实验中,制备了其中IL-2与VSP遗传融合的VSP-IL-2融合蛋白。这些重组蛋白之一包含与IL-2C-末端融合的VSP。在第二重组构建体中,VSP通过介于VSP C-末端和IL-2N-末端之间的接头与IL-2C末端融合。
白细胞激素-2(IL-2)是白细胞介素(免疫系统的细胞因子信号传导分子的一种)。它是吸引负责免疫的白血细胞(淋巴细胞或白细胞)的蛋白质。它是身体对微生物感染的自然反应的部分并参与区分外源(非自身)与自身。IL-2通过与由淋巴细胞表达的IL-2受体结合介导其作用。已经在很多临床试验中将IL-2作为用于治疗癌症、慢性病毒感染的免疫疗法以及作为疫苗佐剂进行测试。Prometheus LaboratoriesInc以商标名Proleukin生产了用于临床使用的重组形式的IL-2。它已经被食品和药物管理局(FDA)批准用于治疗癌症(恶性黑色素瘤、肾细胞癌),并正在治疗慢性病毒感染和作为疫苗加强剂(佐剂)的临床试验中。
为了体外评估VSP载体保护IL-2不被降解的能力,评估了VSP载体(例如重组VSP1267)在与GIT中存在的条件相似的条件下保护人IL-2的能力。采用以上实施例中所述的方法分析VSP保护IL-2免于由极端pH或由酶促蛋白水解(例如,通过胰蛋白酶和/或胰液素)引起的降解的能力。
在不同pH下或与不同浓度的蛋白水解酶(如胰蛋白酶)孵育单独的或与VSP载体混合的IL-2。使用SDS-PAGE凝胶的考马斯染色检测pH和蛋白水解酶挑战之后IL-2的存在。实验结果表明VSP载体与IL-2的组合提高了IL-2对蛋白水解和对pH-诱导的降解的抗性(图15A-C)。
将采用之前实施例中所述的方法进行体内分析,以确定与VSP载体组合口服施用的IL-2是否会在GIT的条件下保护IL-2且相对于没有VSP载体的情况下口服施用的IL-2导致吸收增加。例如,在向小鼠以不同剂量和IL-2/VSP比率口服施用IL-2(单独或与VSP载体组合)后,在不同时间测量IL-2的血清水平。通过监测调节性T细胞数/频率以及Treg上的CD25表达分析IL-2的生物作用。结果将表明当IL-2与VSP载体组合施用时,与没有VSP载体的情况下口服施用单独IL-2相比,IL-2的吸收和(i)IL-2的血清水平是否增加,(ii)和/或Treg数/频率是否增加,(iii)和/或使用流式细胞仪通过染色的平均荧光密度检测到的CD25分子表达是否增加。
实施例10.与VSP载体组合的白细胞介素10(IL-10)的体外和体内保护
白细胞介素-10(IL-10或IL10),也称为人细胞因子合成抑制因子(CSIF),是抗炎性细胞因子。在人体中,IL-10由IL10基因编码。IL-10能够抑制由如巨噬细胞和调节性T细胞的细胞产生的促炎性细胞因子(如IFN-γ、IL-2、IL-3、TNFα和GM-CSF)的合成。它还呈现出抑制抗原呈递细胞的抗原呈递的很强能力。然而,它也对某些T细胞是刺激性的,并刺激B细胞成熟和抗体产生。
为了体外评估VSP载体保护IL-10不被降解的能力,评估了VSP载体(例如重组VSP1267)在与GIT中存在的条件相似的条件下保护人IL-10的能力。采用以上实施例中所述的方法分析VSP保护IL-10免于由极端pH或由酶促蛋白水解(例如,通过胰蛋白酶和/或胰液素)引起的降解的能力。
在不同pH下或与不同浓度的蛋白水解酶(如胰蛋白酶)孵育单独的或与VSP载体混合的IL-10。使用SDS-PAGE凝胶的考马斯蓝染色来检测pH和蛋白水解酶挑战之后IL-10的存在。实验结果表明VSP载体与IL-10的组合提高了IL-10对蛋白水解和对pH-诱导的降解的抗性(图15A-C)。这些结果表明在VSP存在下的IL-10和IL-2(在之前的实施例中讨论的)对低pH和胰蛋白酶的蛋白水解作用有抗性。例如,测试的两种白细胞介素均没有被胰蛋白酶消化(即使是在1:10的比率下)或在pH 2下孵育之后降解。这与VSP载体可以保护其它生物活性肽如LANTUSTM胰岛素的观察一致。因此,VSP与白细胞介素如IL-2或IL-10的组合可以促进它们的肠道吸收和它们的全身效应。
将采用之前实施例中所述的方法进行体内分析,以确定与VSP载体组合口服施用IL-10是否保护IL-10免于GIT中的条件的影响且相对于没有VSP载体的情况下口服施用的IL-10导致吸收增加。例如,在向小鼠以不同剂量和IL-10/VSP比率口服施用IL-10(单独或与VSP载体组合)后,在不同时间测量IL-10的血清水平。结果将表明当IL-10与VSP载体组合施用时,与没有VSP载体的情况下口服施用单独IL-10相比,IL-10的吸收和IL-10的血清水平是否增加。
实施例11.与VSP载体组合的胰高血糖素的体外和体内保护
由胰腺分泌的肽类激素胰高血糖素提高血糖水平。它的作用与降低血糖水平的胰岛素相反。胰高血糖素是29个氨基酸的多肽。在人体中,其一级结构是HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT(SEQID NO:6)。该多肽的分子量是3485道尔顿。在严重低血糖的情况下,当受害者没有意识或因为其他原因无法口服葡萄糖时,施用胰高血糖素是至关重要的急救措施。胰高血糖素通过肌肉内、静脉内或皮下注射给药,并快速提高血糖水平。重构过程使得使用胰高血糖素变得麻烦(Meeran等,Endocrinology 140(1):244-50(1999);Longuet等,Cell Metab.8(5):359-71(2008))。
为了体外评估VSP载体保护胰高血糖素不被降解的能力,评估了VSP载体(例如重组VSP1267)在与GIT中存在的条件相似的条件下保护人胰高血糖素的能力。采用以上实施例中所述的方法分析VSP保护胰高血糖素免于由胰蛋白酶的酶蛋白水解引起的降解的能力。
在不同pH下或与不同浓度的蛋白水解酶(如胰蛋白酶)于37℃下孵育单独的或与VSP载体混合的胰高血糖素(1μg)1小时(图13A)。通过加入不含EDTA的蛋白酶抑制剂混合物(COMPLETETM,无EDTA,Roche Diagnostic)停止反应。采用抗胰高血糖素单克隆抗体检测pH和蛋白水解酶挑战之后胰高血糖素的存在。实验结果表明VSP载体与胰高血糖素的组合提高了胰高血糖素对胰蛋白酶水解和对pH-诱导的降解的抗性。图13A的上图显示了斑点印迹分析,其表明了胰高血糖素对胰蛋白酶作用的敏感度。图13A的下图示出了以1:3胰高血糖素:VSP的比率组合VSP载体与胰高血糖素保护了胰高血糖素不被比例高达1:2(蛋白:蛋白酶)的胰蛋白酶的降解。斑点印迹示出了样品对,其中不含VSP载体或以1:3胰高血糖素:VSP的比率含有VSP载体的胰高血糖素样品经历相同的胰蛋白酶浓度。
在这些分析中使用的胰高血糖素是由Eli Lilly Co.上市销售的重组多肽激素(r-胰高血糖素,Lilly)。如图13A所示,之前采用PeptideCutter软件(可从web.expasy.org/cgi-bin/peptide_cutter/peptidecutter.pl获得)进行的研究表明,胰高血糖素对胰蛋白酶的作用非常敏感。初步实验还表明,单克隆抗体抗胰高血糖素(Sigma-Aldrich Cat.No.G2654)能够通过斑点印迹检测1μg的胰高血糖素。
图13B表明,当口服共施用胰高血糖素时,VSP促进了胰高血糖素的生物作用。在7周大的BALC/c小鼠中评估了口服施用胰高血糖素的效果,该小鼠2小时没有进食,然后接受了所示剂量的单独的或与VSP组合的胰高血糖素。在所示时间测定血糖水平。当口服施用时,50μg胰高血糖素与VSP(150μg)的组合表现为与口服施用的单独胰高血糖素相比增强胰高血糖素的生物作用。此外,从该体内测试中明显注意到,接受口服施用胰高血糖素+VSP的动物其血糖水平相对于接受皮下(S.C)接种的动物(30分钟)更快地增加(15分钟),且口服胰高血糖素-VSP组的效果相对于s.c.组维持了更长的时间。
将采用之前实施例中所述的方法进行体内分析,以确定与VSP载体组合口服施用胰高血糖素是否会在GIT的条件下保护胰高血糖素且相对于没有VSP载体的情况下口服施用的胰高血糖素导致吸收增加。在向小鼠以不同剂量和胰高血糖素/VSP比率口服施用胰高血糖素(单独或与VSP载体组合)后,在不同时间测量胰高血糖素的血清水平(图13B)。
特别是,在7周大的BALC/c小鼠中评估了口服施用胰高血糖素的作用,该小鼠2小时没有进食,然后接受了单独的或与VSP组合的所示剂量的胰高血糖素。在所示时间测定血糖水平。当口服施用时,50μg胰高血糖素与VSP(150μg)的组合与口服施用的单独胰高血糖素相比表现为增强了胰高血糖素的生物作用。此外,在该体内测试中明显观察到,接受口服施用胰高血糖素+VSP的动物其血糖水平相对于接受皮下(S.C)接种的动物(30分钟)更快地增加(15分钟)。在口服接受胰高血糖素-VSP的组中观察到的效果相对于皮下接受该组合物的组维持了更长的时间。
实施例12.与VSP载体组合的溶解性差的小分子药物的递送
为了评估体外VSP载体有效递送溶解性差的治疗剂(例如,溶解性差的小分子药物如格列吡嗪、水溶解性差的BCS II类抗糖尿病药物;丁胺卡那霉素,氨基糖苷抗生素;或万古霉素,糖肽类抗生素)的能力,首先评估了VSP载体(例如重组VSP1267)在保护溶解性差的治疗剂免受GIT中存在的条件相似的条件影响的能力。采用本领域已知的方法分析VSP保护溶解性差的治疗剂免于由极端pH引起的降解的能力。例如,与VSP载体组合的治疗剂经历与GIT中存在的pH相似的pH水平,并采用质谱或色谱方法(如HPLC)监测该药物的降解。此外,可以通过本领域已知的方法测量VSP增溶治疗剂的能力。实验结果将表明VSP载体与溶解性差的治疗剂的组合是否在保护其不受与GIT中存在的条件相似的条件下降解的同时提高该治疗剂的溶解性。
将采用之前实施例中所述的方法和本领域已知的方法进行体内分析,以确定与VSP载体的组合口服施用溶解性差的治疗剂是否会有效地保持治疗剂在溶液中、在GIT的条件下保护治疗剂并且导致相对于没有VSP载体的情况下施用的治疗剂吸收增加。结果将表明当与没有VSP载体的情况下口服施用单独的溶解性差的治疗剂相比时,治疗剂与VSP的组合是否能够维持治疗剂在溶液中、在GIT的条件下保护治疗剂并且增加治疗剂的吸收和其血清水平。
实施例13.在其他生物体中存在的VSP样结构域具有与贾第虫VSP相同的性质
贾第虫VSP1267细胞外结构域(在此作为示例性VSP载体)的序列与其他VSP样分子序列的比对导致在特别地属于草履虫、四膜虫和内阿米巴属物种的蛋白质中多个CXXC基序的识别。因此,内阿米巴属物种的表面激酶、草履虫属物种和四膜虫属物种的表面蛋白的一级序列的代表性片段预示了包含负责对于pH、温度和蛋白水解消化的抗性的VSP样结构的CXXC基序的保守性结构域。
为了确定VSP样蛋白是否保留了贾第虫VSP细胞外结构域的性质并从而可以用作VSP载体或嵌合VSP蛋白的成分,采用标准分子生物学技术修饰编码VSP结构域(TTHERM_00826790假设蛋白;SEQ IDNO:590)的嗜热四膜虫VSP样蛋白的DNA片段以产生嵌合VSP。嵌合VSP蛋白(SEQ ID NO:589)包含编码分别与VSP结构域序列(SEQID NO:592)的氨基末端和羧基末端融合的肠贾第虫VSP1267信号肽(SEQ ID NO:591)和His6纯化标签的序列,该VSP结构域位于来自四膜虫的VSP样蛋白(SEQ ID NO:590)的氨基酸位置977和1465之间。所得嵌合VSP的序列如图14A所示。
将该嵌合VSP克隆至用于在Sf9昆虫细胞中表达的杆粒中。一旦表达并被分泌到培养上清液中,如实施例2所述在Nickel柱上纯化嵌合VSP蛋白。
用该嵌合VSP蛋白验证hGH对pH的稳定性和对胰蛋白酶的敏感性。图14B示出了如由使用抗hGH单克隆抗体的蛋白质印迹法测定的不同浓度胰蛋白酶对重组hGH的活性。1:25的激素:蛋白酶比率显示出测定pH和蛋白水解降解的最好结果。
图14C表明hGH与源生自嗜热四膜虫和肠贾第虫片段的嵌合VSP蛋白的组合能够保护hGH免于低pH和胰蛋白酶的降解,如在SDS-PAGE后的考马斯蓝染色中和使用抗hGH单克隆抗体的蛋白质印迹所示的。
这些结果表明,例如:
(a)来自贾第虫以外的物种的包含多个CXXC基序的多肽具有保护肽不被低pH和/或蛋白酶活性降解的能力,其在哺乳动物的肠道中可以促进吸收;
(b)有可能通过使用来自包含一个或几个VSP结构域的较大蛋白质的片段产生VSP载体;
(c)有可能通过组合两个不同VSP蛋白(在这种情况下,来自VSP蛋白的信号序列和来自VSP样蛋白的VSP结构域)的片段产生VSP载体;
(d)有可能通过组合来自两个不同生物体的蛋白片段(在这种情况下,来自肠贾第虫的一个序列和来自嗜热四膜虫的一个序列)产生VSP载体;
(e)有可能使用可能太大而无法重组表达的VSP蛋白(例如,2192个氨基酸长的TTHERM_00826790蛋白质),通过切除包含计算识别的VSP结构域(例如,在本实施例中采用的489个氨基酸长的VSP结构域片段)的较大VSP蛋白的一部分产生VSP载体。
本发明如上借助于说明了实现特定功能的功能构建模块及其关系进行了描述。在此为了说明方便任意界定了这些功能构建模块的界线。只要特定功能及其关系可以适当地进行,可以界定其他界线。
上述特定实施方案的说明将充分揭示本发明的一般性质,以使其他人能够通过运用本领域的技术知识在不背离本发明的总体构思的情况下无需过度试验容易地改进和/或调整此类特定实施方案的各种应用。因此,根据在此提出的教导和指导,此类调整和改进意图在公开的实施方案的等同物的含义和范围内。在此的用语或术语理解为用于说明的目的而不是限制的目的,因此技术人员应当按照教导和指导理解本说明书的术语或用语。
本发明的广度和范围不应当被任何上述示例性实施方案所限制,而只应当根据以下权利要求及其等同物限定。
Claims (60)
1.治疗组合物,包含VSP载体和治疗剂。
2.权利要求1所述的组合物,其配制用于口服施用。
3.权利要求1所述的组合物,其配制用于粘膜施用。
4.权利要求1-3任一项所述的组合物,其中所述VSP载体选自VSP、VSP样蛋白、VSP或VSP样蛋白片段、VSP或VSP样蛋白衍生物及两个或更多个所述VSP载体的组合。
5.权利要求4所述的组合物,其中所述VSP载体包含来自贾第虫的VSP或其片段。
6.权利要求5所述的组合物,其中所述来自贾第虫的VSP或其片段包含VSP细胞外结构域。
7.权利要求5或6所述的组合物,其中所述来自贾第虫的VSP是VSP1267。
8.权利要求4-7任一项所述的组合物,其中所述VSP载体包含SEQ IDNO:2的氨基酸序列。
9.权利要求4-8任一项所述的组合物,其中所述VSP载体进一步包含异源部分。
10.权利要求4-9任一项所述的组合物,其中所述异源部分是蛋白质纯化标签序列。
11.权利要求4-10任一项所述的组合物,其中所述蛋白质纯化标签序列是His6标签。
12.权利要求4-11任一项所述的组合物,其中所述VSP载体由SEQ IDNO:1的序列组成。
13.权利要求1-12任一项所述的组合物,其中所述治疗剂是生物剂。
14.权利要求1-13任一项所述的组合物,其中所述生物剂是生物活性肽。
15.权利要求1-14任一项所述的组合物,其中所述生物活性肽选自胰岛素,人生长激素,胰高血糖素,其片段、类似物、衍生物或变体,及两个或更多个所述生物活性肽的组合。
16.权利要求15所述的方法,其中所述生物活性肽是天然胰岛素。
17.权利要求15所述的方法,其中所述生物活性肽是重组胰岛素。
18.权利要求15所述的组合物,其中所述生物活性肽是胰岛素类似物。
19.权利要求18所述的组合物,其中所述生物活性肽是速效胰岛素。
20.权利要求18所述的组合物,其中所述生物活性肽是长效胰岛素。
21.权利要求19所述的组合物,其中所述速效胰岛素是门冬胰岛素。
22.权利要求20所述的组合物,其中所述长效胰岛素是甘精胰岛素。
23.权利要求1-22任一项所述的组合物,其中VSP载体与所述治疗剂的分子-分子比率的范围是从约10:1至约1:10。
24.权利要求23所述的组合物,其中VSP载体与所述治疗剂的分子-分子比率的范围是从约3:1至约1:3。
25.权利要求24所述的组合物,其中VSP载体与所述治疗剂的分子-分子比率是3:1。
26.权利要求24所述的组合物,其中VSP载体与所述治疗剂的分子-分子比率是1:1。
27.权利要求1-26任一项所述的组合物,进一步包含药学上可接受的赋形剂。
28.将治疗剂递送至受试者的靶位置的方法,包括向需要的受试者施用权利要求1-27任一项所述的治疗组合物。
29.治疗受试者的疾病或状况的方法,包括向需要的受试者施用有效量的权利要求1-27任一项所述的治疗组合物。
30.权利要求29所述的方法,其中所述疾病或状况是激素缺乏症。
31.权利要求30所述的方法,其中所述激素缺乏症是胰岛素缺乏症。
32.权利要求31所述的方法,其中所述胰岛素缺乏症是1型糖尿病。
33.治疗受试者的疾病或状况的方法,包括将VSP载体和治疗剂组合,和向所述受试者施用有效量的所述VSP载体和治疗剂的组合,其中所述VSP载体可以与所述治疗剂结合。
34.增强治疗剂对酶降解的抗性的方法,包括将VSP载体和治疗剂组合,其中所述VSP载体可以与所述治疗剂结合,且其中将所述VSP载体和所述治疗剂组合导致所述治疗剂对酶降解的抗性增强。
35.增强治疗剂对pH变性的抗性的方法,包括将VSP载体和治疗剂组合,其中所述VSP载体可以与所述治疗剂结合,且其中将所述VSP载体和所述治疗剂组合导致所述治疗剂对pH变性的抗性增强。
36.增强治疗剂对粘膜上皮细胞的附着性的方法,包括将VSP载体和治疗剂组合,其中所述VSP载体可以与所述治疗剂结合,且其中将所述VSP载体和所述治疗剂组合导致所述治疗剂对粘膜上皮细胞的附着性增强。
37.权利要求36所述的方法,其中所述粘膜上皮细胞是肠上皮细胞。
38.权利要求36所述的方法,其中所述粘膜上皮细胞是胃上皮细胞。
39.权利要求36所述的方法,其中所述粘膜上皮细胞是口腔上皮细胞。
40.制备可口服递送的组合物的方法,包括将VSP载体和治疗剂组合,其中所述VSP载体可以与所述治疗剂结合。
41.制备适于口服施用的可注射组合物的方法,包括将VSP载体和治疗剂组合,其中所述VSP载体可以与所述治疗剂结合。
42.权利要求28-41任一项所述的方法,其中所述VSP载体选自VSP、VSP样蛋白、VSP或VSP样蛋白片段、VSP或VSP样蛋白衍生物及两个或更多个所述VSP载体的组合。
43.权利要求42所述的方法,其中所述VSP载体包含来自贾第虫的VSP或其片段。
44.权利要求43所述的方法,其中所述来自贾第虫的VSP或其片段包含VSP细胞外结构域。
45.权利要求43或44所述的方法,其中所述来自贾第虫的VSP是VSP1267。
46.权利要求42-45任一项所述的方法,其中所述VSP载体包含SEQ IDNO:2的氨基酸序列。
47.权利要求42-46任一项所述的方法,其中所述VSP载体进一步包含异源部分。
48.权利要求42-47任一项所述的方法,其中所述异源部分是蛋白质纯化标签序列。
49.权利要求42-48任一项所述的方法,其中所述蛋白质纯化标签序列是His6标签。
50.权利要求42-49任一项所述的方法,其中所述VSP载体由SEQ IDNO:1的序列组成。
51.权利要求28-50任一项所述的方法,其中所述治疗剂是生物剂。
52.权利要求28-51任一项所述的方法,其中所述生物剂是生物活性肽。
53.权利要求28-52任一项所述的方法,其中所述生物活性肽选自胰岛素,人生长激素,胰高血糖素,其片段、类似物、衍生物或变体,和两个或更多个所述生物活性肽的组合。
54.权利要求53所述的方法,其中所述生物活性肽是天然胰岛素。
55.权利要求53所述的方法,其中所述生物活性肽是重组胰岛素。
56.权利要求53所述的方法,其中所述生物活性肽是胰岛素类似物。
57.权利要求56所述的方法,其中所述生物活性肽是速效胰岛素。
58.权利要求56所述的方法,其中所述生物活性肽是长效胰岛素。
59.权利要求57所述的方法,其中所述速效胰岛素是门冬胰岛素。
60.权利要求58所述的方法,其中所述长效胰岛素是甘精胰岛素。
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