BR112015000183B1

BR112015000183B1 - Composição terapêutica

Info

Publication number: BR112015000183B1
Application number: BR112015000183-1A
Authority: BR
Inventors: David Klatzmann; Eliane Piaggio; Hugo Lujan
Original assignee: Consejo Nacional De Investigaciones Científicas Y Técnicas (Conicet); Universidad Católica De Córdoba; Assistance Publique Hopitaux De Paris; Université Pierre Et Marie Curie (Paris 6)
Priority date: 2012-07-06
Filing date: 2013-07-05
Publication date: 2022-12-13
Also published as: BR112015000183A2; EP2869829B1; WO2014006502A8; NZ704285A; EP3398610B1; CA2878322C; AR093225A1; EP2869829A1; US20150157735A1; EP3398610A1; AU2017265167A1; US20140011739A1; MX353649B; CN104994867A; WO2014006502A1; US20180228913A1; US9757471B2; AU2017265167B2; US9457096B2; CA2878322A1

Abstract

PROTEÍNAS DE SUPERFÍCIE ESPECÍFICAS DE VARIANTE (VSP) DE PROTOZOÁRIO COMO CARREADORES PARA ENTREGA DE FÁRMACO ORAL. A invenção fornece composições para entrega oral e métodos de tratamento com o uso de carreadores de VSP, tais como Giardia sp., proteínas de superfície variáveis (VSP), para entregar agentes terapêuticos. Os carreadores de fármaco de VSP podem ser combinados com peptídeos bioativos, por exemplo, insulina, glucagon ou hGH e podem ser administrados via oral ou via mucosa. Os carreadores VSP são resistentes a pHs ácidos e à degradação proteolítica e protegem agentes terapêuticos de degradação no trato gastrointestinal.

Description

Referência à listagem de sequência enviada eletronicamente

[001] O conteúdo da listagem de sequência enviada eletronicamente em arquivo de texto ASCII (Nome: 3181_001PC01_sequence_listing_ST25.txt; Tamanho: 28.138.935 bytes; eData de Criação: 1 de julho de 2013) depositado com o pedido e está incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade.

Fundamentos

[002] A presente invenção refere-se a composições e métodos para entregar agentes terapêuticos a um indivíduo que necessita dos mesmos com o uso de carreadores de polipeptídeo. Mais particularmente, apresente invenção se refere apolipeptídeos como proteínas de superfície variável de Giardia sp. (VSPs) que atuam como carreadores para a entrega de agentes terapêuticos como peptídeos bioativos.

[003] A Entrega oral representa o meio ideal de entrega de agentes profiláticos e terapêuticos devido à facilidade de administração, conformidade de paciente e custo. Entretanto, a rota oral também é a mais difícil devido às inúmeras barreiras impostas pelo trato gastrointestinal (GIT). Os principais desafios são degradação química e enzimática no estômago e no intestino delgado superior e a falta de permeabilidade suficiente pelo estômago. Um baixo pH no estômago pode submeter agentes terapêuticos a uma degradação física e química. A degradação física de peptídeos envolve de modo geral a modificação da estrutura nativa de uma proteína para uma estrutura de ordem superior que pode ser um resultado da adsorção, agregação, desdobramento, precipitação e/ou degradação completa/parcial aos componentes de aminoácidos dos mesmos. A degradação química normalmente envolve clivagem de ligação e leva à formação de novos produtos.

[004] kGiardiaé um patógeno intestinal que é capaz de sobreviver às condições ambientais rígidas no estômago e no intestino delgado superior. Como muitos microrganismos protozoários, a G/a/tf/a passa por variação antigênica (consulte, por- exe/np/o, Zambrano- Villa et al., Trends Parasitol. 18: 272 a 8 (2002)), um mecanismo pelo qual a mesma alterna continuamente as moléculas de superfície principal da mesma, o que permite ao parasita para se esquivar da resposta imunológica do hospedeiro e estabelecer infecções crônicas e/ou recorrentes (consulte, por exe/np/ü, Nash, Mol. Microbiol. 45:585 a 90 (2002)). Esses antígenos de superfície pertencem a uma família de proteínas de superfície específicas de variante (VSPs) que são proteínas de membrana integradas que cobrem toda a superfície de trofozoítos.

[005] As VSPs possuem uma região rica em cisteína amino-terminal e um domínio carboxi- terminal conservado que inclui uma região transmembrana e uma cauda citoplásmica curta (Figura 1A). Existe um repertório de cerca de 200 genes de VSP no genoma da Giardia, mas somente uma VSP é expressa na superfície do parasita em qualquer dado momento (consulte, por exemplo, Prucca et al., Nature 456(7223):750 a 4 (2008); Deitsch et al., Microbiol. Mol. Biol. Rev. 61:281 a 93 (1997)).

[006] Visto que a porção extracelular de VSPs de G/arz7/apermite que o parasita sobreviva dentro do ambiente hostil do intestino delgado superior, VSPs ligados de forma covalente a antígenos são usados para transferir antígenos candidatos. Foi observado que quando vacinas que compreendem VSPs ligados de forma covalente a antígenos de Giardia são administradas oralmente, as vacinas protegem completamente animais de infecções subsequentes pelos parasitas Giardia, o que indica que os santígenos sobreviveram à passagem pelo GIT (Rivero et al., Nat. Med. 16(5):551 a 7 (2010), consulte, por exemplo, Publicações PCT no WP2010/064204 e no_WO2011/120994, as quais são incorporadas ao presente documento a título de referência em sua totalidade).

[007] O diabetes tipo 1 normalmente é diagnosticado em crianças e jovens adultos e é responsável por uma proporção crescente de gastos no sistema de saúde nacional. O diabetes tipo 1 é uma doença autoimune que resulta de uma disfunção do sistema imunológico que ataca e destrói as células β das ilhotas pancreáticas que produzem insulina.

[008] A administração de insulina exógena é a única medicação que pode ser usada para controlar os aumentos no açúcar do sangue que ocorrem com a doença. O diabetes tipo 2, ao contrário, é caracterizado por defeitos tanto na secreção de insulina quanto na ação da insulina, com uma deficiência em insulina normalmente emergindo depois durante a progressão da doença. A suplementação de insulina é, com frequência, necessária para se obter bom controle de níveis de glicose nessa doença (consulte, por exempio, DeWitt & Hirsch, JAMA 289:2254 a 2264 (2003)). Existem diferentes tipos de insulina subcutânea disponíveis (Summers et al., Clin. Ther. 26:1498 a 1505 (2004)). Entretanto, as pesquisas indicam resistência substancial à terapia por insulina na parte de pacientes com diabetes tipo 2 devido à dor antecipada e à inconveniência (Peyrot et al., Diabetes Care 28:2673 a 2679 (2005)). Os pacientes mais jovens e mais velhos são os menos prováveis de aceitar a terapia injetável e, assim, mostram o maior desafio para médicos que querem iniciar o tratamento por insulina (Freemantle et al., Diabetes Care 28:427 a 428 (2005)). Consequentemente, os esforços em desenvolver formulações orais, nasais e inaladas de insulina têm sido motivados pela preferência dos pacientes em evitar injeções subcutâneas (Cefalu, Ann. Med. 33:579-586 (2001); Graham et al., N. Engl. J. Med. 356:497 a 502 (2007)). Assim, a opção de entregar insulina pela rota oral permanece uma estratégia terapêutica atraente.

[009] Glucagon, um hormônio peptídico secretado pelo pâncreas, eleva os níveis de glicose no sangue. O efeito do mesmo é oposto àquele da insulina que diminui os níveis de glicose no sangue. O glucagon é indicado e usado como um tratamento para hipoglicemia grave. Devido aos pacientes com diabetes tipo 1 poderem ter um aumento menor nos níveis de glicose no sangue em comparação a um paciente do tipo 2 estável, carboidratos suplementares devem ser dados tão rápido quanto possível, especialmente para um paciente pediátrico. O glucagon também é indicado como um auxiliar no diagnóstico no exame radiológico do estômago, duodeno, intestino delgado e cólon quando uma mobilidade intestinal diminuída é vantajosa. O glucagon é tão eficaz para esse exame quanto os fármacos anticolinérgicos. Entretanto, a adição do agente anticolinérgico pode resultar em efeitos colaterais maiores. Como no caso da insulina, o desenvolvimento de formas de glucagon adequadas para a entrega oral é uma estratégia terapêutica atraente.

[0010] A deficiência de hormônio do crescimento é um distúrbio que envolve a glândula pituitária, o que produz hormônio do crescimento e outros hormônios. O hormônio do crescimento humano (hGH) estimula o crescimento e a reprodução de células em humanos, também exercendo a atividade do mesmo no metabolismo de lipídios, proteínas e carboidratos. O hGH recombinante normalmente é produzido por fermentação bacteriana (Zeisel et al., Horm. Res. 37(Suppl 2):5-13 (1992); Sonoda & Sigimura, Biosci. Biotechnol. Biochem. 72:2675 a 80 (2008)). Quando a glândula pituitária não produz hormônio do crescimento suficiente, o crescimento será mais lento que o normal. O hormônio do crescimento é necessário para o crescimento normal em crianças. Em adultos, o hormônio do crescimento é necessário para manter as quantidades apropriadas de gordura corporal, músculo e osso. A deficiência de hGH pode ocorrer em qualquer idade. Crianças e alguns adultos com deficiência de hormônio do crescimento irão se beneficiar da terapia por hormônio do crescimento. Para tratar deficiências de hormônio do crescimento, é geralmente prescrito hGH (hormônio do crescimento humano). O hGH é um fármaco injetável que é injetado debaixo da gordura da pele do paciente diversas vezes por semana (Brearley et al., BMC Clin. Pharmacol. 7:10 (2007)). Como no caso de tratamento por insulina, a resistência do paciente ao início da terapia injetável e a conformidade são desafios para os médicos. Consequentemente, o desenvolvimento deformas de hGH adequadas para entrega oral é uma estratégia terapêutica atraente.

Breve resumo

[0011] Apresente revelação fornece composições e métodos que compreendem carreadores de VSP para a entrega de agentes terapêuticos, por exemplo, peptídeos bioativos como insulina, glucagon ou hormônio do crescimento, para uma localização alvo em um indivíduo que necessita do mesmo, por exemplo, através de administração oral ou mucosal.

[0012] Mais particularmente, a revelação fornece o uso de um polipeptídeo de VSP, por exe/np/o, uma proteína de superfície variável (VSP) do parasita £/M&ou um fragmento da mesma (por exemplo, o domínio extracelular de uma VSP de £/M&ou um fragmento que compreende motivo CXXC da mesma) como um carreador para entregar um agente terapêutico através de administração oral ou mucosal. Os carreadores de VSP da invenção não são ligados de forma covalente aos agentes terapêuticos através de ligações peptídicas.

[0013] Consequentemente, a presente revelação fornece uma composição terapêutica que compreende um carreador de VSP e um agente terapêutico. Em algumas modalidades, a composição é formulada para administração oral. Em outras modalidades, a composição é formulada para administração mucosal. Em algumas modalidades, o carreador de VSP é uma VSP, uma proteína similar a VSP, um fragmento de VSP ou proteína similar a VSP, um derivado de VSP ou proteína similar a VSP ou uma combinação de dois ou mais dos ditos carreadores de VSP.

[0014] Em algumas modalidades, o carreador de VSP compreende uma VSP de Giardia ou um fragmento da mesma. Em outras modalidades, a VSP de 6fc/tf/ãou um fragmento da mesma compreende um domínio extracelular de VSP. Em outras modalidades, a VSP de Grâ/tf/aé a VSP1267. Em algumas modalidades específicas, o carreador de VSP compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:2. Em outras modalidades, o carreador de VSP compreende adicionalmente uma porção química heteróloga. Em algumas modalidades, a porção química heteróloga é uma sequência de etiqueta de purificação de proteína. Em algumas modalidades, a sequência de etiqueta de purificação de proteína é uma etiqueta de His6. Em algumas modalidades específicas, o carreador de VSP consiste da sequência de SEQ ID NO:1.

[0015] Em algumas modalidades, o agente terapêutico é um agente biológico. Em algumas modalidades, o agente biológico é um peptídeo bioativo. Em algumas modalidades, o peptídeo bioativo é insulina, hormônio do crescimento humano, glucagon, fragmentos, análogos, derivados ou variantes dos mesmos ou uma combinação de dois ou mais dos ditos peptídeos bioativos. Em algumas modalidades, o peptídeo bioativo é uma insulina natural. Em outras modalidades, o peptídeo bioativo é uma insulina recombinante. Em algumas modalidades, o peptídeo bioativo é um análogo de insulina. Em outras modalidades, o análogo de insulina é uma insulina de ação rápida. Em outras modalidades, o análogo de insulina é uma insulina de longa duração. Em algumas modalidades, a insulina de ação rápida é insulina aspart. Em outras modalidades, a insulina de longa duração é insulina glargina.

[0016] Em algumas modalidades, a razão de molécula para molécula de carreador de VSP para o agente terapêutico fica na faixa de cerca de 10:1 a cerca de 1:10. Em outras modalidades, a razão de molécula para molécula de carreador de VSP para o agente terapêutico fica na faixa de cerca de 3:1 a cerca de 1:3. Em algumas modalidades, a razão de molécula para molécula de carreador de VSP para o agente terapêutico é 3:1. Em outras modalidades, a razão de molécula para molécula do carreador de VSP para o agente terapêutico é 1:1. Em algumas modalidades, a composição compreende adicionalmente um excipiente aceitável farmaceuticamente.

[0017] Também é fornecido um método de entrega de um agente terapêutico para uma localização alvo em um indivíduo que compreende administrar uma composição terapêutica que compreende um carreador de VSP e um agente terapêutico para um indivíduo que necessita do mesmo. Apresente revelação também fornece um método de tratamento de uma doença ou condição em um indivíduo que compreende administrar uma quantidade eficaz de uma composição terapêutica que compreende um carreador de VSP e um agente terapêutico um indivíduo que necessita do mesmo. Em algumas modalidades, a doença ou condição é uma deficiência hormonal. Em algumas modalidades, a deficiência hormonal é uma deficiência em insulina. Em algumas modalidades, a deficiência em insulina é diabetes tipo 1.

[0018] Também é fornecido um método de tratamento de uma doença ou condição em um indivíduo que compreende combinar um carreador de VSP e um agente terapêutico onde o carreador de VSP se liga ao agente terapêutico e administrar uma quantidade eficaz da combinação de carreador de VSP e agente terapêutico ao indivíduo. A revelação imediata também fornece um método de aumento da resistência de um agente terapêutico à degradação enzimática que compreende combinar um carreador de VSP e um agente terapêutico onde o carreador de VSP pode se ligar ao agente terapêutico e em que combinar o carreador de VSP e o agente terapêutico resulta em maior resistência do agente terapêutico à degradação enzimática.

[0019]Apresente revelação também fornece um método de aumento da resistência de um agente terapêutico à desnaturação por pH que compreende combinar um carreador de VSP e um agente terapêutico onde o carreador de VSP pode se ligar ao agente terapêutico e onde combinar o carreador de VSP e o agente terapêutico resulta em uma maior resistência do agente terapêutico à desnaturação por pH. Também é fornecido um método de aumento da capacidade de fixação de um agente terapêutico a células epiteliais mucosais que compreende combinar um carreador de VSP e um agente terapêutico onde o carreador de VSP pode se ligar ao agente terapêutico e onde combinar o carreador de VSP e o agente terapêutico resulta em uma maior capacidade de fixação do produto terapêutico a células epiteliais mucosais. Em algumas modalidades, as células epiteliais mucosais são células epiteliais intestinais. Em outras modalidades, as células epiteliais mucosais são células epiteliais gástricas. Em algumas modalidades, as células epiteliais mucosais são células epiteliais orais.

[0020] Também é fornecido um método de fabricação de uma composição administrável oralmente que compreende combinar um carreador de VSP e um agente terapêutico onde o carreador de VSP pode se ligar ao agente terapêutico. Apresente revelação também fornece um método de fabricação de uma composição injetável (por exemplo, uma formulação de insulina injetável) adequada para administração oral que compreende combinar um carreador de VSP e um agente terapêutico onde o carreador de VSP pode se ligar ao agente terapêutico. Por exemplo, uma composição de insulina injetável pode ser reformulada ou adequada para administração oral pela combinação da composição injetável comum carreador de VSP. A presente revelação também fornece um método de fabricação de um agente terapêutico injetável adequado para administração oral que compreende combinar um carreador de VSP e um agente terapêutico onde o carreador de VSP pode se ligar ao agente terapêutico. Por exemplo, uma composição de insulina injetável pode ser reformulada ou adequada para administração oral ela combinação da composição injetável comum carreador de VSP. Em algumas modalidades, o carreador de VSP é uma VSP, uma proteína similar a VSP, um fragmento de VSP ou proteína similar a VSP, um derivado de VSP ou proteína similar a VSP ou uma combinação de dois ou mais dos ditos carreadores de VSP. Em algumas modalidades, o carreador de VSP compreende uma VSP de Gfc/tf/ãou um fragmento da mesma. Em outras modalidades, a VSP de Giardia ou um fragmento da mesmac ompreende um domínio extracelular de VSP. Em algumas modalidades, a VSP de G/a/tf/aé a VSP1267. Em outras modalidades, o carreador de VSP compreende a sequência de aminoácidosd a SEQ ID NO:2. Em algumas modalidades, o carreador de VSP compreende adicionalmente uma porção química heteróloga. Em outras modalidades, a porção química heteróloga é uma sequência de etiqueta de purificação de proteína. Em algumas modalidades, a sequência de etiqueta de purificação de proteína é uma etiqueta His6. Em outras modalidades, o carreador de VSP consiste da sequênciade SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, o agente terapêutico é um agente biológico. Em outras modalidades, o agente biológico é um peptídeo bioativo. Em algumas modalidades, o peptídeo bioativo é insulina, hormônio do crescimento humano, glucagon, fragmentos, análogos, derivados ou variantes dos mesmos ou uma combinação de dois ou mais dos ditos peptídeos bioativos. Em algumas modalidades, o peptídeo bioativo é uma insulina natural. Em outras modalidades, o peptídeo bioativoé uma insulina recombinante. Em algumas modalidades, o peptídeo bioativo é um análogo de insulina. Em outras modalidades, o análogo de insulina é uma insulina de ação rápida. Em algumas modalidades, o análogo de insulina é uma insulina de longa duração. Em outras modalidades, a insulina de ação rápida é insulina Aspart. Em algumas outras modalidades, a insulina de longa duração éi nsulina Glargina.

Breve descrição dos desenhos/figuras

[0021] A Figura 1A é um diagrama que mostra as características estruturais de VSPs. O diagrama mostra que as VSPs são proteínas de membrana integradas com uma região extracelular variável rica em motivos CXXC (onde C indica uma cisteínae X pode ser qualquer aminoácido), regiões hidrofóbicas de transmembrana únicas e uma cauda citoplásmica curta de 5 aminoácidos de comprimento.

[0022] A Figura 1B mostra ensaios de contraste de fase (painel esquerdo) e de imunofluorescência (painel direito) que mostra um grupo de trofozoítos de Giardia. Cada trofozoíto expressa uma única VSP na superfície do mesmo, a qual é diferente para cada trofozoíto conforme demonstrado pel aidentificação de superfície com um anticorpo monoclonal específico anti-VSP.

[0023] A Figura 1C mostra uma identificação immunogold específica anti-VSP da superfície de um trofozoíto. A superfície inteira do parasita é identificada, o que inclui o disco ventral e os flagelos, o que gera um revestimento de superfície espesso.

[0024] A Figura 2A mostra imagens de contraste de fase (PC) e imagens imunofluorescentes (IFA) que correspondem a dois isolados de G/a/tf/adiferentes (WB e GS/M) tratados com 100 μg/mlou 200 μg/mlde tripsina. O anticorpo monoclonal G10/4 reconhece um epítopo conformacional na proteína VSP VSPH7 do isolado GS/M. O anticorpo monoclonal 9B10 detecta um epítopo não conformacional na proteína VSP VSP9B10 do isolado WB.

[0025] A Figura 2B mostra imagens de contraste de fase (PC) e imagens imunofluorescentes (IFA) que correspondem a dois isolados de G/ardÉdiferentes (WB e GS/M) incubados em diferentes pHs (1, 3, 5 e 8). O anticorpo monoclonal G10/4 reconhece um epítopo conformacional na proteína VSP VSPH7 do isolado GS/M. O anticorpo monoclonal 9B10 detecta um epítopo não conformacional na proteína VSP VSP9B10 do isolado WB.

[0026]A Figura 3 mostra uma análise Western blot que detecta a presença de três VSPs de Giardia (VSP9B10, VSP1267 e VSPH7) após atrofozoítotripsinização. Os trofozoítos foram tratados com tripsina emc oncentrações de 200 μg/mle 2 mg/ml ou incubados em um meio sem tripsina (controle). Uma amostra de controle que corresponde a um anticorpo de fosfatase antialcalina de camundongo (α-camundongo) também é mostrado.

[0027]A Figura 4 mostra microfotografias imunohistoquímicas de seções intestinais de Meriones unguicuiatusomero\\ozo infectados comtrofozoítos de 67a/r//aWB9B10 (Figura 4A), gerbilos de controle (Figura 4B) egerbilos aos quais todo o repertório de VSPs de Giardia purificadas de trofozoítos transgênicos foi administrado oralmente (Figura 4C) (Rivero et al., Nat. Med. 16:551 a 7 (2010).

[0028]A Figura 5A mostra a sequência de aminoácidos de uma VSP de G/a/tf/arecombinante que corresponde à porção extracelularde VSP1267 mais uma etiqueta His6 de C-terminal (aminoácidos encapsulados) (SEQ ID NO:1). O peptídeo de sinal do N-terminal estásublinhado.

[0029]A Figura 5B mostra as etapas de purificação de VSP1267 recombinante produzida no sistema de Baculovirus por SDS-PAGE e Western blotting com o uso de um anticorpo monoclonal anti-His6.

[0030]A Figura 6 mostra géis manchados com prata que correspondem às insulinas (NOVORAPID® e LANTUS®) pré-incubadas com diferentes concentrações de tripsina e pancreatina (uma mistura de componentes de suco pancreático). A faixa identificada MW corresponde a uma escala de peso molecular. As faixas "ins" e "tripsina" são faixas de controleque contêm insulina e tripsina, respectivamente.

[0031]A Figura 7 mostra níveis de glicose no sangue nos camundongos Balb/c fêmeas, 7 semanas de idade, que foram deixados sem admissão de alimento por 2 horas e, então, receberam as doses indicadas de insulina. A Figura 7A mostra níveis de glicose no sangue após administração de LANTUS®; enquanto que a Figura 7B mostra níveis de glicose no sangue após administração de NOVORAPID®. As insulinas foram administradas oralmente em doses de 1 IU, 5 IU, e 50 IU. A PBS e uma administração subcutânea de insulina em 1 a 5 IU foram usadas comoc ontroles. 1 IU pareceu ser uma dose subótima para ambas as insulinas (circulada).

[0032]A Figura 8 mostra níveis de glicose no sangue em camundongos Balb/c fêmeas, 7 semanas de idade, que foram deixados sem admissão de alimento por 2 horas e, então, receberam as doses indicadas de insulina, sozinha ou combinada comum carreador de VSP. A Figura 8A mostra níveis de glicose no sangue após administração de LANTUS®; enquanto que a Figura 8B mostra níveis de glicose no sangue após a administração de NOVORAPID®. As insulinas foram administradas na dose subótima identificada na Figura 7 (1 IU) em três formulações diferentes (i) de insulina administrada sozinha, (ii) insulina combinada com VSP em uma razão 1:1 de molécula para molécula e (iii) insulina combinada com VSP em uma razão 1:3 de molécula para molécula. A PBS e uma administração subcutânea de insulinaem 1 a 5 IU foram usadas como controles. A combinação de 1 IU de insulina comum a ação biológica da insulina melhorada por carreador de VSP, em uma razão de 1:1 de insulina para carreador de VSP para LANTUS® e em uma razão de 1:3 de insulina para carreador de VSP para NOVORAPID® (circulada).

[0033] A Figura 9 mostraa especificidade do anticorpo monoclonal anti-hGH (αhGH) por Western blot. Duas diluições do monoclonal (αhGH) (1/3000 e 1/2000) foram usadas para detectar hGH (hormônio do crescimento humano produzido de forma recombinante em E. co//). Um controle que contém um anticorpo de fosfatase antialcalina (a Camundongo-AP1) também é mostrado.

[0034] A Figura 10A mostrao efeito de pH na estabilidade de hGH. A imagem de topo é um Western blot que mostra a degradação mediada por pH de hGH incubado em um meio a um pH de 1,06, 2,0, 3,8, 5,0, 5,8, 7,0, 8,0, 9,0, 10,0 e 11,0. A presença de hGH foi determinada com o uso de um anticorpo monoclonal anti-hGH. A imagem de fundo mostra a detecção de manchamento de prata de hGH. Baixos pHs, similares àqueles encontrados no GIT, causaram degradação da proteína (círculos), enquanto que em altos pHs, o hGH permaneceu inalterado em comparação ao controle. Cadafaixa continha 10 μg de hGH.

[0035] A Figura 10B mostrao efeito de combinação de um carreador de VSP com hGH na desnaturação de hGH embaixo pH. Os Western blots correspondem a pares de amostras nas quais amostras de hGH sem um carreador de VSP ou comum carreador de VSP em uma razão de 1:3 de hGH para carreador de VSP foram submetidas às mesmas condições de pH (pH 1,4, 1,96, 3,8, 4,91, 5,9, 7,01, 7,95, 8,51, 9,61 e 11,17). A amostra de carregador de hGH:VSP em pH de 3,8 foi perdida durante o processamento. A presença de hGH foi determinada com o uso de um anticorpo monoclonal anti-hGH.

[0036] A Figura 11A mostra o efeito de tripsina na estabilidade de hGH. A imagem de topo é um manchamento Western blot com o uso de um anticorpo monoclonal anti-hGH. A imagem de fundo corresponde ao manchamento de prata. A tripsina proteolizou completamente hGH conforme indicado pelas áreas circuladas.

[0037] A Figura 11B mostra que a combinação de um carreador de VSP com hGH em uma razão de 1:3 de hGH para VSP protege a hGH da degradação por tripsina por até 150 μg/mlde tripsina. Os Western blots correspondem a pares de amostrasn os quais amostras de hGHs em um carreador de VSP ou comum carreador de VSP em uma razão de 1:3 de hGH para carreador de VSP foram submetidas às mesmas concentrações detripsina (50, 100, 150, 300 e 500 μg/ml). A presença de hGH foi determinada com o uso de um anticorpo monoclonal anti-hGH.

[0038] A Figura 12A mostra no painel principal da mesma os níveis séricos de hGH em camundongos após administração oral das doses de hGH especificadas (50, 100, 200, 400 e 800 μg). O suplemento mostra os níveis séricos de hGH em camundongos após administração subcutânea de uma dose de 12,5 μg de hGH.

[0039] A Figura 12B mostra níveis séricos de hGH em camundongos após administração oral de hGH sozinho ou em combinação comum carreador de VSP em uma razão de 1:3 de hGH para carreador de VSP.

[0040] A Figura 13A mostra o efeito de tripsina na estabilidade de glucagon. O painel de topo do Dot blot mostra glucagon proteolizado por tripsina. O painel de fundo mostra que a combinação de um carreador de VSP com glucagon em uma razão de 1:3 de glucagon para VSP protege glucagon da degradação de tripsina até uma razão de 1:2 (proteína:protease).

[0041] A Figura 13B mostra o efeito em níveis de glicose no sangue que resultam da administração oral de glucagon sozinha ou combinada com VSP para camundongos BALC/c.

[0042] A Figura 14A mostra a sequência de uma proteína de VSP quimérica (SEQ ID NO: 589) derivada de uma proteína similar a VSP de Teira/y/πe/ra (hermcDhila (SEQ ID NO: 590). A ssequências que codificam o peptídeo de sinal (SEQ ID NO: 591) de Giardia /77test//7a//sVSP1267 e uma etiqueta de purificação de His6 foram fundidas respectivamente aoamino-terminal ecarboxi-terminal da sequência de um domínio de VSP (SEQ ID NO: 592) localizado entre posições de aminoácido 977 e 1465 da proteína similar a VSPdeTefrahymena.

[0043] A Figura 14B mostra a atividade de diferentes concentrações de tripsina em hGH recombinante conforme detectada por Western blotting com o uso de um anticorpo monoclonal anti-hGH.

[0044] A Figura 14C mostra que a combinação de hGH com uma proteína similar a VSPdeT TOeemopOHa pode proteger hGH de degradação embaixo pHetripsina, conforme demonstrado em um manchamento de azul de coomassieapós SDS-PAGE e Western blotting com o uso de um anticorpo monoclonal anti-hGH.

[0045] A Figura 15A mostra que a combinação de IL-2 ou IL-10 com uma VSP foi capaz de proteger IL-2 e IL-10 da degradação de tripsina conforme demonstrado em um manchamento de azul de coomassieapós SDS-PAGE.

[0046] A Figura 15B mostra que a combinaçãode IL-10 com uma VSP para proteger IL-10 de baixa degradação induzida por pH conforme demonstrado em um manchamento de azul de coomassieapós a SDS-PAGE.

[0047] A Figura 15C mostra que a combinação de IL-2 com uma VSP foi capaz para proteger IL-2 e IL-2 de baixa degradação induzida por pH conforme demonstrado em um manchamento de azul de coomassieapós SDS-PAGE.

Descrição detalhada

[0048] A entrega oral depeptídeos bioativos como insulina, glucagon ou hormônio do crescimento que, de modo geral, são administrados através de injeção, oferece benefícios consideráveis em termos de número diminuído de injeções, conformidade aprimorada e incidência reduzida de efeitos colaterais. Entretanto, a entrega oral bem-sucedida de agentes terapêuticos, porexemplo, peptídeos bioativoscomoinsulina, glucagon ou hormônio do crescimento humano (hGH), envolve superar as barreiras de degradação enzimática, obter permeabilidade epitelial e tomar providências para conservar a bioatividade durante o processo de formulação. Para solucionar esse problema, é fornecido um sistema de entrega oral no qual peptídeos bioativos, por exemplo, insulina, glucagon ou hGH, são combinados com, mas não combinados de forma covalente através de ligações peptídicas comum carreador de VSP para protegeros peptídeos bioativos da degradação no trato gastrointestinal (GIT) e para promover a ação biológica sistêmica dos mesmos.

[0049] Consequentemente, a presente revelação é orientada para composições terapêuticas que compreendem carreadores de VSP (por exemplo, VSPs de Giardia, proteínas similares a VSP, fragmentos, variantes ou derivados dos mesmos) que compreendem pelo menos um motivo CXXC em que C representa um aminoácido de cisteína e X representa qualquer aminoácido que pode ser combinado e ligado a agentes terapêuticos e funciona como carreadores para entrega de fármaco. A revelação se refere em particular a composições que compreendem carreadores de VSP, poio exemplo, polipeptídeos derivados do domínio extracelular de VSP de (j/ã/tf/ã, que são resistentes a proteases e a diferentes pHs e que podem se fixar a células epiteliais no GIT. Em algumas modalidades, tais carreadores de VSP são usados para formar Partículas Similares a Vírus (VLPs) adequadas para administração oral.

[0050] A combinação de agentes terapêuticos com carreadores de VSP para administração oral ou mucosal confere a tais gentes terapêuticos uma maior resistência à degradação induzida por pHe à degradação enzimática, assim como um aumento na ligação de tais agentes terapêuticos ao epitélio gastrointestinal. Em alguns aspectos específicos, os agentes terapêuticos são peptídeos bioativos como insulinas, glucagon ou hormônio do crescimento humano.

Definições

[0051] Deve ser observado que, conforme usadas neste relatório descritivo e nestas reivindicações, as formas singulares "um", "uma", "o" e “a” incluem referentes no plurala menos que o contexto dite claramente o contrário. Os termos "um" (ou "uma"), assim como os termos "um ou mais" e "pelo menosum" podem ser usados de forma intercambiável no presente documento.

[0052] Ademais, "e/ou", onde usado no presente documento, deve ser tomado como uma revelação específica de cada um dos dois recursos ou componentes especificados com ou sem o outro. Assim, o termo "e/ou", conforme usado em uma frase como "A e/ou B" no presente documentos se destina a incluir "A e B," "A ou B", "A" (sozinho) e "B" (sozinho). De forma similar, o termo "e/ou" conforme usado em uma frase como "A, B e/ou C" se destina a abranger cada uma das seguintes modalidades: A, B e C; A, B ou C; A ou C; A ou B; B ou C; A e C; A e B; B e C; A (sozinho); B (sozinho); e C (sozinho).

[0053] A menos que seja definido o contrário, todos os termos técnicos e científicos usados no presente documento têm o mesmo significado conforme normalmente compreendido pelo versado na técnica à qual esta invenção está relacionada. Por exemplo, “The Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology”, Juo, Pei-Show, 2a edição, 2002, CRC Press; “The Dictionary of Cell and Molecular Biology”, 3a edição, 1999, Academic Press; eo“Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology”, Revisado, 2000, Oxford University Press, fornecem a um versado na técnica um dicionário geral de muitos dos termos usados nesta revelação.

[0054] Unidades, prefixos e símbolos são denotadas na forma aceita pelo Système International de Unites (SI). As faixas numéricas são inclusivas dos números que definem a faixa. Menos onde indicado o contrário, as sequências de aminoácidos são escritas da esquerda para a direita em uma orientação de amino para carboxi. Os cabeçalhos fornecidos no presente documento não são limitações dos vários aspectos ou modalidades da invenção, as quais podem ter como referência todo o relatório descritivo. Consequentemente, os termos definidos imediatamente abaixo são definidos de forma mais completa por referência ao relatório descritivo em sua totalidade.

[0055] É compreendido que sempre que as modalidades são descritas no presente documento com a linguagem "que compreende", modalidades de outra forma análogas descritas em termos de "que consiste de" e/ou "que consiste essencialmente de" também são fornecidas.

[0056] Os aminoácidos são referidos no presente documento por ou símbolos de três letras normalmente conhecidos dos mesmos ou pelos símbolos de uma letra recomendados pelo IUPAC-IUB Biochemical Nomenclatur e Commission. Os nucleotídeos, de forma similar, são referidos pelos códigos de uma única letra normalmente aceitos.

[0057] Conforme usados no presente documento, os termos "Giardid' ou "parasita Giardid' se referem a um gênero de protozoário flagelado anaeróbico da disposição Metamonada que se coloniza e reproduz no intestino delgado de diversos vertebrados, o que causa a giardiose. No mundo inteiro, a giardiose é comum dentre pessoas com baixa higiene fecal- oral e os modos principais de transmissão incluem suprimentos de água contaminados ou atividade sexual. Os trofozoítos flagelados de GiarXim fixam a células epiteliais do intestino delgado (/sto 4 a superfície da mucosa intestinal), onde os mesmos podem causar uma doenças em acionar uma resposta inflamatória considerável (Rivero et at, Nat. Med. 16:551 a 7 (2010)). Não existem fatores de virulência ou toxinas conhecidos e a expressão variável de proteínas de superfície permitem a evasão de respostas imune de hospedeiro e a adaptação a diferentes ambientes de hospedeiro (Rivero et at, Nat. Med. 16:551 a 7 (2010)). As alternativas do ciclo de vida dos mesmos entre um trofozoíto que nada ativamente e um cisto resistente infeccioso. O parasita Giardia infecta humanos, mas também é um dos parasitas mais comuns que infectam gatos, cachorros e pássaros. Os hospedeiros mamíferos também incluem vacas, castores, cervos e ovelha.

[0058] O termo "Giardid abrange diferentes espécies, o que inclui Giardia lambliae Giardia muros. Conforme usado no presente documento, o termo "£/M/d /a/77d//a" (também denominado Giardia intestinaiis ou Giardia duodena/is} se refere a um dos parasitas intestinais mais comuns de humanos. A Giardia lamblia é o protista parasítico mais predominante nos Estados Unidos, ondea incidência do mesmo pode ser tão alta quanto 0,7% (Hlavsa eta/., MMWR Surveill. Summ. 54:9 a 16 (2005)).

[0059] Conforme usado no presente documento, os termos "proteína de superfície variável," "VSP proteína" ou "VSP" se referem apolipeptídeos que cobrem a superfície inteira da parasita de 67a/z7/a e são os principais antígenos reconhecidos pelo sistema imune do hospedeiro. O termo "VSP" conforme definido no presente documento também inclui homólogos, por exemplo, ortólogos e parálogos de proteínas "VSP" de Giardia, VSP e proteínas similares a VSP encontradas em outros organismos, assim como fragmentos, variantes e derivadas das mesmas.

[0060] O termo "homólogo", usado em relação a uma proteína VSP ou Gene que codifica VSP de uma primeira família ou espécie, se refere a uma proteína VSP distinta ou genes que codificam VSP de uma segunda família ou espécie que são determinadas por análises funcionais, estruturais ou genômicas para serem uma proteína VSP ou gene que codifica VSP da segunda família ou espécie que corresponde à proteína VSP original ou gene que codifica VSP da primeira família ou espécie. Conforme usado no presente documento, o termo "homólogo" se refere a qualquer proteína VSP ou gene que codifica VSP que é relacionado a uma proteína VSP de referência ou gene que codifica VSP pela origem de uma sequência de DNA de um ancestral comum. O termo homólogo inclui ambos os ortólogos e os parálogos.

[0061] O termo "ortólogo" se refere a homólogos de VSP em diferentes espécies que evoluíram de um gene ancestral comum por especiação. Normalmente, os ortólogos retêm a mesma ou uma função similar independente das diferenças na estrutura primária dos mesmos (mutações).

[0062] O termo "parálogo" se refere aos homólogos de VSP na mesma espécie que evoluíram por duplicação genética de um gene ancestral comum. Em muitos casos, os parálogos exibem relacionados (mas nem sempre com funções idênticas). Até o ponto em que uma espécie em particular evoluiu múltiplos genes relacionados de uma sequência de DNA ancestral compartilhada com outra espécie, o termo ortólogo pode abranger o termo parálogo.

[0063] Com maior frequência, os homólogos terão similaridades funcionais, estruturais ou genômicas. São conhecidas técnicas pelas quais os homólogos de uma enzima ou gene podem ser imediatamente clonados com o uso de sondas genéticas e PCR. A identidade de sequências clonadas como homólogas podem ser confirmadas com o uso de ensaios funcionais e/ou por mapeamento genômico dos genes.

[0064] As proteínas VSP são proteínas ricas em cisteína com múltiplos motivos CXXC (onde X é qualquer aminoácido) que têm diversas características em particular que incluem em algumas VSPs a presença de motivos CXC, um motivo de dedo de zinco específico de Giardia, emotivos GGCY (Nash, Mol. Microbiol. 45:585 a 590 (2002); Adam et al., BMC Genomics 10:424 (2010)). Mais precisamente, as proteínas VSP são proteínas de membrana integradas do tipo 1 que variam em tamanho de 20 a 200 kDa; possuem uma região rica em cisteína variável de amino-terminal (domínio extracelular que representa a interface hospedeiro/parasita e confere à proteína resistência à digestão proteolítica e ao baixo pH) e uma região de carboxi-terminal conservada que inclui uma região transmembrana hidrofóbica e uma cauda citossólica curta que compreende somente 5 aminoácidos (CRGKA) que não são detectados pelo sistema imune. Somente uma proteína VSP é expressa em qualquer dado momento na superfície de cada parasita (Nash. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 352:1369 a 1375 (1997)).

[0065] Dentro do contexto da presente invenção, os termos "proteína de superfície variável", "proteína VSP" ou "VSP" incluem qualquer proteína de superfície variável do repertório completo de proteínas VSP de Giardia, notavelmente Giaadialamblia. Na verdade, parasitas Giardia codificam um repertóriode cerca de 200 genes que codificam VSPs para montagem A de VSP (consulte, poMexempio, Morrison etale Science 317:1921 a 1926 (2010); Adam efa/., BMC Genomics 10:424 (2010)) e dois relatos do grupo do Svard que descrevem o repertóriode VSP de isolados derivados de montagens B e E de VSP (Jerlstrom- Hultqvist et al BMC Genomics 11:543 (2010); Franzen et al. PLoS Pathog. 5(8):c1000560 (2009)). O domínio extra celular de uma VSP permite ao parasita sobreviver ao ambiente hostil do intestino delgado superior. As VSPs são muito resistentes a pHs variáveis (a reatividade a um epítopo conformacional por um anticorpo monoclonal orientado para uma VSP em particular permanece inalterada entre pH 2 e 12) e a digestão por tripsina e diversas outras proteases. Além disso, as VSPs permanecem fixadas à mucosa entérica (Rivero et a/., Nat. Med. 16(5):551 a 7 (2010)). Uma lista compreensiva de proteínas VSP pode ser encontrada em www.ebi.ac.uk/interpro/IEntry?ac=IPR005127.

[0066] Deve ser observado adicionalmente que os polipeptídeos que compreendem pelo menos um motivo CXXC em que C representa um resíduo de cisteína e X qualquer resíduo de aminoácido como VSPs de £/M&ou proteínas similares a VSPde outros microrganismos também podem ser gerados in vitro por manipulação genética e produzidos em sistemas heterólogos. Dessa forma, polipeptídeos produzidos quimicamente ou por célula, incluindo aqueles com variações de aminoácido não encontradas nos parasitas do tipo selvagem (por exemplo,variantes de VSPs de Giardia} são abrangidos. As VSPs podem, assim, serem preparadas por qualquer procedimento conhecido na técnica como síntese por fase sólida, síntese por fase líquida ou engenharia genética.

[0067] As VSPs usadas nas composições terapêuticas da invenção podem passar por modificações químicas. As modificações químicas podem ser alvejadas para obter VSPs com proteção aumentada contra a degradação enzimática //7 vivo, e/ou maior capacidade para atravessar barreiras de membrana, o que aumenta assim a meia-vida das mesmas e mantém ou melhora a atividade biológica das mesmas. Qualquer modificação química conhecida na técnica pode ser empregada de acordo com apresente invenção para modificar uma VSP. Tais modificações químicas incluem, mas não se limitam a: (a) modificações às extremidades N-terminal e/ou C-terminal das proteínas VSP como, por exemalo, acilação de N-terminal (preferencialmente acetilação) ou desaminação ou modificação do grupo carboxila do C-terminal em um grupo amida ou álcool; (b) modificações na ligação amida entre dois aminoácidos: a cilação (preferencialmente acetilação) ou alquilação (preferencialmente metilação) no átomo de nitrogênio ou no carbono alfa da ligação amida que liga dois aminoácidos; (c) modificações no carbono alfa da ligação amida que liga dois aminoácidos como, por exemplo, acilação (preferencialmente acetilação) ou alquilação (preferencialmente metilação) no carbono alfa da ligação amida que liga dois aminoácidos. (d) alterações de quiralidade como, porexe/np/o, substituições de um ou mais aminoácidos de ocorrência natural (L-enantiômero) com os D-enantiômeros correspondentes; (e) retroinversões nas quais um ou mais aminoácidos de ocorrência natural (L-enantiômero) são substituídos pelos D-enantiômeros correspondentes, junto com uma inversão da cadeia de aminoácidos (da extremidade de C-terminal para a extremidade de N-terminal); e/ou (f) azapeptídeos em que um ou mais carbonos alfa são substituídos por átomo de nitrogênios.

[0068] Os termos "proteína" e "polipeptídeo”, (por exemplo, uma proteína VSP) são usados de forma intercambiável para se referir a uma molécula composta de monômeros (aminoácidos) ligada linearmente por ligações amida (também conhecidas como ligações de peptídeo). Peptídeos, dipeptídeos, tripeptídeos ou oligopeptídeos são incluídos dentro da definição de "polipeptídeo”, e o termo "polipeptídeo" pode ser usado em vez de ou de forma intercambiável com qualquer um desses termos. O termo "polipeptídeo" também é destinado para se referir aos produtos de modificações pós-expressão do polipeptídeo, incluindo sem limitação, glicosilação, acetilação, fosforilação, amidação, derivatização por grupos conhecidos de proteção/bloqueio, clivagem proteolítica ou modificação por aminoácidos de ocorrência não natural. Um polipeptídeo pode ser isolado de uma fonte biológica natural ou produzido por tecnologia recombinante, mas não é necessariamente traduzido a partir de uma sequência de ácido nucleicos designada. Um polipeptídeo pode ser gerado de qualquer maneira, incluindo por síntese química.

[0069] Os termos "proteína" ou "polipeptídeo" (por exemplo, uma proteína VSP) também incluem variantes que abrangeriam qualquer polipeptídeo que compreende qualquer polipeptídeo natural ou geneticamente modificado que tem pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95% ou pelo menos 99% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência do polipeptídeo. Polipeptídeos variantes podem ser gerados com o uso de modificado genético, por exemplo, por inserção, substituição, deleção ou uma combinação dos mesmos. Substituições em uma proteína sequência da invenção podem ser conservativas ou não conservativas.

[0070] Quando o termo "variante de uma proteína" se aplica, de acordo com a presente invenção, à VSP de Giardia ou proteína similar à VSP de outros micro-organismos, tal variante deve poder reter a capacidade de se fixar às células, particularmente às células mucosas, mais particularmente às células epiteliais do GIT e que funcionam como um carreador de agente terapêutico. Variantes podem ser de ocorrência natural ou não natural. Variantes de ocorrência não natural podem ser produzidos com o uso de conjunto de procedimentos de mutagênese conhecido na técnica. Polipeptídeos variantes podem compreender substituições, deleções ou adições de aminoácido conservativo ou não conservativo.

[0071] Conforme usado aqui, quando o termo "fragmento" se aplica a uma VSP ou proteína similar à VSP de outro micro-organismo (por exemplo, nas frases "um fragmento de uma VSP" ou uma "VSP ou um fragmento da mesma") tal fragmento deve abranger qualquer polipeptídeo que compreende pelo menos cerca de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 400 ou 500 aminoácidos contíguos ou descontínuos da proteína ou polipeptídeo conforme definido no presente documento, assim como qualquer polipeptídeo. Tal fragmento deve poder reter a capacidade de se fixar às células, particularmente à célula mucosa, mais particularmente às células epiteliais do GIT e que funciona como um carreador de agente terapêutico.

[0072] "Derivados" de polipeptídeos ou proteínas da invenção são polipeptídeos ou proteínas que foram alterados a fim de exibir recursos adicionais não constatados no polipeptídeo ou proteína nativa, mas ainda mostrar as propriedades benéficas do polipeptídeo ou proteína parental (por exemplo, resistência à degradação de enzima proteolítica ou ligação a células epiteliais gastrointestinais).

[0073] O local das sequências de sinal das sequências de proteína VSP reveladas no presente documento pode ser prontamente identificado por uma pessoa versada na técnica. Adicionalmente, uma pessoa versada entenderia que as sequências de sinal nas sequências de proteína VSP reveladas no presente documento podem ser trocadas por outras sequências de sinal conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, sequências de sinal adicionais conhecidas na técnica podem ser adicionadas à sequência de proteína VSP revelada no presente documento.

[0074] Uma pessoa de habilidade comum na técnica, com o uso dos métodos revelados no presente pedido e/ou métodos conhecidos na técnica, seria capaz de gerar variantes, fragmentos, e derivados das sequências de proteína VSP revelados no presente documento, assim como proteínas VSP quiméricas de projeto. Ademais, uma pessoa de habilidade comum na técnica, em vista dos métodos revelados no presente documento e conhecimento geral na técnica, seria capaz de identificar o local de domínios funcionais que permitem que uma proteína funcione como um carreador de VSP nas proteínas VSP reveladas no presente documento e em seus ortólogos e parálogos. Além disso, a pessoa versada na técnica, com o uso dos métodos revelados no presente documento e conhecimento geral na técnica, teria capacidade de verificar sem experimentação indevida se as proteínas VSP, e seus fragmentos, variantes ou derivados podem funcionar como carreadores de VSP.

[0075] Um polipeptídeo, proteína "isolada" ou um fragmento, variante ou derivado dos mesmos se refere a um polipeptídeo ou proteína que não está em seu meio natural. Nenhum nível particular de purificação é exigido. Por exemplo, um polipeptídeo ou proteína isolada pode ser simplesmente removido de seu ambiente nativo o natural. Um polipeptídeo ou proteína "recombinante" se refere a um polipeptídeo ou proteína produzida por meio de tecnologia de DNA recombinante. Polipeptídeos e proteínas, produzidos de modo recombinante expressos em células hospedeiras são considerados isolados para o propósito da invenção, à medida que as mesmas são polipeptídeos nativos ou recombinantes que foram separados, fracionados ou parcial ou substancialmente purificados por qualquer técnica adequada.

[0076] Uma "proteína sequência" ou "sequência de aminoácidos" significa uma representação linear dos constituintes de aminoácido em um polipeptídeo em uma direção amino-terminal a carboxil-terminal na qual resíduos que fazem fronteiras um com o outro na representação são contíguos na estrutura primária do polipeptídeo.

[0077]Uma "substituição de aminoácido conservativo" é aquela na qual o resíduo de aminoácido é trocado por um resíduo de aminoácido que tem uma cadeia lateral similar. Famílias de resíduos de aminoácido que tem cadeias laterais similares foram definidas na técnica, incluindo cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares descarregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais beta-ramificados (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Desse modo, se um aminoácido em um polipeptídeo for trocado por outro aminoácido da mesma família de cadeia lateral, a substituição é considerada conservativa. Em outra modalidade, um filamento de aminoácidos pode ser trocado de modo conservativo por um filamento estruturalmente similar que difere em ordem e/ou composição de membros de família de cadeia lateral.

[0078]O termo "percentagem de identidade de sequência" entre duas sequências de polinucleotídeo ou polipeptídeo se refere ao número de posições correspondentes idênticas compartilhadas pelas sequências em uma janela de comparação, levando em consideração adições ou deleções (isto é, lacunas) que precisam ser introduzidas para alinhamento ideal das duas sequências. Uma posição correspondente é qualquer posição em que um nucleotídeo ou aminoácido idêntico é apresentado tanto na sequência alvo quanto na sequência de referência. Lacunas apresentadas na sequência alvo não são contabilizadas visto que as lacunas não são nucleotídeos ou aminoácidos. De forma similar, lacunas apresentadas na sequência de referência não são contabilizadas visto que os nucleotídeos de sequência alvo ou aminoácidos são contabilizados, não os nucleotídeos ou aminoácidos da sequência de referência.

[0079] A porcentagem de identidade de sequência é calculada determinando-se o número de posições nas quais o resíduo de aminoácido idêntico ou base de ácido nucleico ocorre em ambas às sequências para render o número de posições correspondentes, que divide o número de posições correspondentes pelo número total de posições na janela de comparação e multiplica o resultado por 100 para render a porcentagem de identidade de sequência. A comparação de sequências e determinação de percentagem de identidade de sequência entre duas sequências pode ser concluída com o uso de software prontamente disponível tanto para uso online quanto para transferência por download. Programas de software adequados estão disponíveis junto a várias fontes, e para alinhamento das sequências tanto de proteína quanto de nucleotídeo. Um programa adequado para determinar a percentagem de identidade de sequência é bl2seq, parte do pacote BLAST de programa disponível junto ao Centro Nacional do Governo dos E.U.A para sítio da web de BLAST de Informações de Biotecnologia (blast.ncbi.nlm.nih.gov). Bl2seq realiza uma comparação entre duas sequências com o uso tanto do algoritmo BLASTN como do algoritmo BLASTP. BLASTN é usado para comparar sequências de ácidos nucleicos, enquanto BLASTP é usado para comparar sequência de aminoácidos. Outros programas adequados são, por exemplo, Needle, Stretcher, Water ou Matcher, parte do pacote EMBOSS de programas de bioinformática e também disponíveis junto a Instituto Europeu de Bioinformática (EBI) em www.ebi.ac.uk/Tools/psa.

[0080] Regiões diferentes dentro de uma única sequência alvo de polinucleotídeo ou polipeptídeo que se alinha com uma sequência de referência de polinucleotídeo ou polipeptídeo pode ter, cada uma, sua própria percentagem de identidade de sequência. Observa-se que o valor de percentagem de identidade de sequência é arredondado ao décimo mais próximo. Por exemplo, 80,11, 80,12, 80,13, e 80.14 são arredondados para baixo para 80,1, enquanto 80,15, 80,16, 80,17, 80,18, e 80,19 são arredondados para cima para 80,2. Observa-se também que o valor de comprimento será sempre um número inteiro.

[0081] Alguém versado na técnica apreciará que a geração de um alinhamento de sequência para o cálculo de uma percentagem de identidade de sequência não é limitada a comparações de sequência a sequência binária exclusivamente acionadas por dados de sequência primária. Os alinhamentos de sequência podem ser derivados de múltiplos alinhamentos de sequência. Um programa adequado para gerar múltiplos alinhamentos de sequência é ClustalW2, disponível junto à www.clustal.org. Outro programa adequado é MUSCLE, disponível junto à www.drive5.com/muscle/. ClustalW2 e MUSCLE são alternativamente disponíveis, por exemplo, junto à EBI.

[0082] Também será apreciado que alinhamentos de sequência podem ser gerados integrando-se dados de sequência com dados de fontes heterogêneas tais como dados estruturais (por exemplo, estruturas de proteína cristalográfica), dados funcionais (por exemplo, local de mutações) ou dados filogenéticos. Um programa adequado que integra dados heterogêneos para gerar um múltiplo alinhamento de sequência é T-Coffee, disponível em www.tcoffee.org, e alternativamente disponível, por exemplo, junto à EBI. Também será apreciado que o alinhamento final usado à percentagem de identidade de sequência calculada pode ser curado tanto automática como manualmente.

[0083] Os termos "porção química heteróloga" significam que um polinucleotídeo, polipeptídeo, polímero não peptídico ou outra porção química é derivado de uma entidade distinta daquela da entidade a qual a mesma é comparada. Por exemplo, um polipeptídeo heterólogo pode ser sintético ou derivado de uma espécie diferente, tipo de célula diferente de um individual ou o mesmo tipo ou tipo diferente de célula de indivíduos distintos. Em um aspecto, uma porção química heteróloga pode ser um polipeptídeo fundido a outro polipeptídeo para produzir um polipeptídeo de fusão ou proteína. Em outro aspecto, uma porção química heteróloga pode ser um não polipeptídeo. Em algumas modalidades, o carreador de VSP compreende uma porção química heteróloga, por exemplo, uma etiqueta His6 para purificação de proteína. Em outras modalidades, agentes terapêuticos que são combinados com os carreadores de VSP fornecidos no presente documento podem ser conjugados ou fundidos (de modo recombinante ou com o uso de síntese proteica ou métodos de conjugação química) a pelo menos uma porção química heteróloga, por exemplo, polietileno glicol (PEG), para aprimorar uma propriedade farmacocinética e/ou farmacodinâmica (por exemplo, meia-vida )n vivP). Porções químicas heterólogas com capacidade de aumentar a meia-vida in vivo de agentes terapêuticos são conhecidas na técnica.

[0084] O termo "aumentado(a)" em relação a uma característica funcional de um agente terapêutico tal como resistência à degradação causada por pH alto e baixo, resistência à degradação enzimática (por exemplo, degradação proteolítica) ou ligação a células alvo (por exemplo, células epiteliais gastrointestinais) é usada para indicar que a característica funcional relevante é aumentada em relação à de uma referência (por exemplo, o agente terapêutico administrado na ausência de um carreador de VSP), conforme determinado sob condições comparáveis.

[0085] Em algumas modalidades, o aumento na característica funcional do agente terapêutico (por exemplo, resistência à degradação enzimática no GIT) é, por exemplo, pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98% ou pelo menos cerca de 99% maior em relação a uma referência (por exemplo, resistência à degradação enzimática do agente terapêutico, por exemplo, insulina, no GIT na ausência de um carreador de VSP), conforme determinado sob condições comparáveis.

[0086] Em algumas modalidades, o aumento na característica funcional do agente terapêutico (por exemplo, resistência à degradação enzimática no GIT) é, por exemplo, um pelo menos cerca de 2 vezes, pelo menos cerca de 3 vezes, pelo menos cerca de 4 vezes, pelo menos cerca de 5 vezes, pelo menos cerca de 6 vezes, pelo menos cerca de 7 vezes, pelo menos cerca de 8 vezes, pelo menos cerca de 9 vezes, pelo menos cerca de 10 vezes, pelo menos cerca de 20 vezes, pelo menos cerca de 30 vezes, pelo menos cerca de 40 vezes, pelo menos cerca de 50 vezes, pelo menos cerca de 60 vezes, pelo menos cerca de 70 vezes, pelo menos cerca de 80 vezes, pelo menos cerca de 90 vezes ou pelo menos cerca de 100 vezes de aumento em relação a uma referência (por exemplo, quando comparado à resistência à degradação enzimática do agente terapêutico, por exemplo, insulina, no GIT na ausência de um carreador de VSP), conforme determinado sob condições comparáveis.

[0087] O termo "diminuído(a)" em relação a uma característica funcional de um agente terapêutico tal como resistência à degradação causada por pH alto e baixo, resistência à degradação enzimática (por exemplo, degradação proteolítica) ou ligação a células alvo (por exemplo, células epiteliais gastrointestinais) é usada para indicar que a característica funcional relevante é diminuída em relação à de uma referência (por exemplo, o agente terapêutico administrado na ausência de um carreador de VSP), conforme determinado sob condições comparáveis.

[0088] Em algumas modalidades, a diminuição na característica funcional do agente terapêutico (por exemplo, resistência à degradação enzimática no GIT) é, por exemplo, pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98% ou pelo menos cerca de 99% menor em relação a uma referência (por exemplo, resistência à degradação enzimática do agente terapêutico, por exemplo, insulina, no GIT na presença de um carreador de VSP), conforme determinado sob condições comparáveis.

[0089] Em algumas modalidades, a diminuição na característica funcional do agente terapêutico (por exemplo, resistência à degradação enzimática no GIT) é, por exemplo, pelo menos cerca de 2 vezes, pelo menos cerca de 3 vezes, pelo menos cerca de 4 vezes, pelo menos cerca de 5 vezes, pelo menos cerca de 6 vezes, pelo menos cerca de 7 vezes, pelo menos cerca de 8 vezes, pelo menos cerca de 9 vezes, pelo menos cerca de 10 vezes, pelo menos cerca de 20 vezes, pelo menos cerca de 30 vezes, pelo menos cerca de 40 vezes, pelo menos cerca de 50 vezes, pelo menos cerca de 60 vezes, pelo menos cerca de 70 vezes, pelo menos cerca de 80 vezes, pelo menos cerca de 90 vezes ou pelo menos cerca de 100 vezes menor em relação a uma referência (por exemplo, quando comparado à resistência à degradação enzimática do agente terapêutico, por exemplo, insulina, no GIT na presença de um carreador de VSP), conforme determinado sob condições comparáveis.

[0090] O termo "polinucleotídeo" ou "nucleotídeo" é destinado a abranger um ácido nucleico singular assim como ácidos nucleicos plurais, e se refere a uma molécula ou construto de ácido nucleico isolado, por exemplo, RNA mensageiro (mRNA) ou DNA de plasmídeo (pDNA). Em determinadas modalidades, um polinucleotídeo compreende uma ligação de fosfodiéster convencional ou uma ligação não convencional (por exemplo,uma ligação de amida, tal como constatado em ácidos nucleicos de peptídeo (PNA)).

[0091] O termo "ácido nucleico" se refere a qualquer um ou mais segmentos de ácido nucleico, por exemplo, DNA ou RNA fragmentos, presente em um polinucleotídeo. Por ácido nucleico ou polinucleotídeo “isolado” é destinada uma molécula de ácido nucleico, DNA ou RNA, que foi removida de seu ambiente nativo. Por exemplo, um polinucleotídeo recombinante que codifica um polipeptídeo de VSP contido em um vetor é considerado isolado para os propósitos da presente invenção. Exemplos adicionais de um polinucleotídeo isolado incluem polinucleotídeos recombinantes mantidos em células hospedeiras heterólogas ou purificadas (parcial ou substancialmente) de outros polinucleotídeos em uma solução. Moléculas isoladas de RNA incluem transcritos de RNA //7 oiuo ou in vitro de polinucleotídeos da presente invenção. Polinucleotídeos ou ácidos nucleicos isolados de acordo com a presente invenção incluem adicionalmente tais moléculas produzidas sinteticamente. Adicionalmente, um polinucleotídeo ou um ácido nucleico pode incluir elementos reguladores tais como promotores, intensificadores, sítios de ligação de ribossomos ou sinais de terminação de transcrição.

[0092] Conforme usado no presente documento, uma "região de codificação" ou "sequência de codificação" é uma porção de polinucleotídeo que consiste em códons traduzíveis em aminoácidos. Embora um "códon de parada" (TAG, TGA ou TAA) seja tipicamente não traduzido em um aminoácido, o mesmo pode ser considerado como parte de uma região de codificação, mas quaisquer sequências de flanqueamento, por exemplo, promotores, sítios de ligação de ribossomos, terminadores transcricionais, íntrons, e similares, não são parte de uma região de codificação. As fronteiras de uma região de codificação são tipicamente determinadas por um códon de partida na terminação 5, que codifica a terminação amino do polipeptídeo resultante, e um códon de parada de tradução na terminação 3, que codifica a terminação carboxila do polipeptídeo resultante. Duas ou mais regiões de codificação da presente invenção podem estar presentes em um único construto de polinucleotídeo, por exemplo, em um único vetor ou em construtos de polinucleotídeo separados, por exemplo, em vetores separados (diferentes). Segue-se, então, que um único vetor pode conter somente uma única região de codificação ou compreender duas ou mais regiões de codificação, por exemplo, um único vetor pode codificar separadamente um domínio A de ligação e um domínio B de ligação conforme descrito abaixo. Adicionalmente, um vetor, polinucleotídeo ou ácido nucleico da invenção pode codificar regiões de codificação heterólogas, tanto fundidas como não fundidas a um ácido nucleico que codifica um domínio de ligação da invenção. Regiões de codificação heterólogas incluem, sem limitação, elementos ou motivos especializados, tal como um peptídeo de sinal secretor ou uma porção química heteróloga (por exemplo, uma etiqueta His6).

[0093] Determinadas proteínas secretadas por células eucarióticas são associadas a um peptídeo de sinal secretor que é clivado da proteína madura visto que a exportação da cadeia de proteína de crescimento através do retículo endoplasmático rugoso foi iniciada. Aqueles de habilidade comum na técnica são cientes de que peptídeos de sinal são geralmente fundidos ao N-terminação do polipeptídeo, e são clivados do polipeptídeo completo ou de "comprimento total" para produzir uma forma secretada ou "madura" do polipeptídeo. Em determinadas modalidades, um peptídeo de sinal maduro é usado ou um derivado funcional daquela sequência que retém a capacidade de direcionar a secreção do polipeptídeo que é operativamente associada ao mesmo. Alternativamente, um peptídeo de sinal heterólogo, por exemplo, um ativador de plasmogênio de tecido humano (TPA) ou peptídeo de sinal de β-glucuronidase de camundongo ou um derivado funcional dos mesmos, pode ser usado.

[0094] Conforme usado no presente documento, o termo "célula hospedeira" se refere a uma célula ou uma população de células que abrigam ou têm capacidade de abrigar um ácido nucleico recombinante. Células hospedeiras podem ser células procarióticas (por exemplo, ). Co//) ou alternativamente, as células hospedeiras podem ser eucarióticas, por exemplo, células fúngicas (por exemplo, células de levedura tal como Saccharomyces cerevesiae, Pichia pastoris ou Schizosaccharomyces po/nZ/o), e várias células de animais, tais como células de inseto (por exemplo, Sf-9) ou células de mamífero (por exemplo, HEK293F, CHO, COS- 7, NIH-3T3).

[0095] O termo "agente terapêutico" se refere a qualquer substância terapeuticamente ativa que é entregue a um indivíduo, por exemplo, oralmente, para produzir um efeito benéfico desejado tal como evitar, inibir ou reter os sintomas e/ou progressão de uma doença ou afecção. Em algumas modalidades, um agente terapêutico pode ser pré-formulado, por exemplo, como uma microcápsula, microesfera, microbolha, lipossoma, nissoma, emulsão, dispersão, etc., antes de o mesmo ser combinado com o carreador de VSP. Também incluídos na definição de agente terapêutico são agentes diagnosticamente ativos e agentes de imageamento tal como corantes ou marcadores fluorescentes.

[0096] Conforme usado no presente documento, o termo "farmaceuticamente aceitável" significa aprovado por uma agencia de regulamentação do governo dos E.U.A ou U.E ou outro governo ou listado na Farmacopeia dos E.U.A ou outra farmacopeia geralmente reconhecida para uso em humanos. Portanto, o termo "farmaceuticamente aceitável" se refere àquelas propriedades e/ou substâncias que são aceitáveis a um paciente (por exemplo, um paciente humano) de um ponto de vista toxicológico e/ou de segurança.

[0097] Os termos "excipiente farmaceuticamente aceitável" e “carreador farmaceuticamente aceitável” se referem a excipientes e carreadores usados nas composições farmacêuticas que não têm um impacto prejudicial significativo no hospedeiro tratado e que retêm as propriedades terapêuticas do agente terapêutico com o qual as mesmas são administradas. Um carreador fisiologicamente aceitável exemplificador é a solução salina fisiológica. Outros carreadores fisiologicamente aceitáveis e suas formulações são conhecidos a alguém versado na técnica e são descritos, por exemplo, em Remington's FarmaceuÇical SeiencesG (18° edição), ed. A. Gennaro, 1990, Mack Publishing Company, Easton, Pa, incorporado ao presente documento a título de referência.

[0098] A frase "quantidade eficaz" conforme usado no presente documento se refere a essa quantidade de uma composição terapêutica da invenção, que compreende uma combinação de um agente terapêutico com um carreador de VSP ou uma composição farmacêutica que compreende tal composição terapêutica que é eficaz para produzir um efeito desejado, em uma relação de benefício/risco razoável aplicável a qualquer tratamento médico. Por exemplo, uma "quantidade eficaz" é uma quantidade eficaz para reduzir ou diminuir pelo menos um sintoma da doença ou distúrbio que é tratado ou para reduzir ou atrasar o início de um ou mais marcadores clínicos ou sintomas associados à doença ou distúrbio ou modificar ou reverter o processo da doença.

[0099] Os termos "tratar" ou "tratamento" conforme usado no presente documento se refere para tanto tratamento terapêutico quanto para tratamento profilático ou medidas profiláticas, em que o objetivo é evitar ou retardar (diminuir) uma mudança fisiológica indesejada ou distúrbio em um indivíduo, tal como a progressão de uma doença ou afecção relacionada à deficiência de hormônio. Resultados clínicos benéficos ou desejados incluem, porém, sem limitação, alívio de sintomas, diminuição de extensão de doença, estado estabilizado (isto é, sem piora) de doença, atraso ou retardamento de progressão de doença, melhora ou paliação do estado da doença, e remissão (seja parcial ou total), tanto detectável como indetectável.

[00100] O termo "tratamento" também significa prolongar a sobrevivência conforme comparado à sobrevivência esperada se não houver recebimento do tratamento. Aqueles em necessidade de tratamento incluem aqueles já com a afecção ou distúrbio assim como aqueles propensos a ter a afecção ou distúrbio ou aqueles nos quais a afecção ou distúrbio devem ser prevenidos.

[00101] O termo "administrar”, conforme usado no presente documento significa dar uma composição terapêutica da invenção que compreende um agente terapêutico combinado com um carreador de VSP ou composição farmacêutica que compreende a composição terapêutica da invenção, a um indivíduo (por exemplo, indivíduo humano) em necessidade do mesmo por meio de uma rota farmaceuticamente aceitável de administração. Em algumas modalidades, a rota de administração é oral ou por mucosa. Em outras modalidades, a rota de administração é selecionada a partir de administração subcutânea, intramuscular, nasal, intravenosa, e pulmonar. Um carreador de VSP pode ser administrado como parte de uma composição farmacêutica que compreende pelo menos um agente terapêutico e pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[00102] Os termos "indivíduo" e "paciente" são usados de forma intercambiável e se referem a qualquer individual, paciente ou animal, particularmente em um indivíduo mamífero, cujo diagnóstico, prognóstico ou terapia é desejado. Indivíduos mamíferos incluem humanos, animais domésticos, animais de fazenda, e zoológico, esportivos ou animais de estimação tal como cães, gatos, porquinhos da índia, coelhos, ratos, camundongos, cavalos, gado, vacas, etc.

Introdução

[00103] Esta revelação fornece composições terapêuticas que compreendem um carreador de VSP e um agente terapêutico. Os carreadores de VSP são polipeptídeos tais como proteínas de superfície específicas de variante (VSPs) do parasita intestinal Giardialamblia e proteínas similares à VSP de outros organismos que podem se ligar a agentes terapêuticos, por exemplo, peptídeos bioativos, e entregar de forma eficaz tais agentes terapêuticos pela rota oral ou por mucosa. Para determinar se VSPs, devido a sua resistência à degradação por pH ácido, resistência à degradação proteolítica, e aderência à mucosa intestinal, podem ser combinados de modo eficaz com agentes terapêuticos (por exemplo, peptídeo bioativo) e ser usados como carreadores para transportar agentes terapêuticos através do trato gastrointestinal (GIT), foram usados três peptídeos bioativos, insulina, glucagon, e hormônio de crescimento humano, como agentes terapêuticos de protótipo a ser entregue pela rota oral.

[00104] Os resultados revelados no presente documento na seção de Exemplos indicam que carreadores de VSP podem ser usados para entregar de forma eficaz, agentes terapêuticos oralmente ou por outras rotas de entrega (por exemplo, administração por mucosa) em que a degradação proteolítica e/ou exposição a baixo pH poderia afetar a integridade do agente terapêutico.

[00105] O termo "carreador de VSP" conforme usado no presente documento se refere a uma proteína VSP (por exemplo, uma VSP de Giardia, uma proteína similar à VSP, uma VSP ou fragmento de proteína similar à VSP, uma VSP ou variante de proteína similar à VSP, uma VSP ou derivado de proteína similar à VSP ou uma combinação de dois ou mais dos ditos polipeptídeos de VSP) que podem se ligar a pelo menos um agente terapêutico. Em determinadas modalidades, o pelo menos um agente terapêutico não é um imunógeno de vacina.

[00106] Em algumas modalidades, o carreador de VSP é uma "VSP quimérica". Conforme usado no presente documento, o termo "VSP quimérica" se refere a uma proteína VSP modificada que compreende subsequências de proteína derivadas de proteínas VSP diferentes. Em algumas modalidades, as subsequências são obtidas de proteínas VSP da mesma espécie. Em outras modalidades, as subsequências são obtidas de proteínas VSP de espécie diferente. Em algumas modalidades, a proteína VSP quimérica compreende elementos que não são de VSP, por exemplo, etiquetas de purificação (por exemplo, um His6 ou outra etiqueta de purificação conhecida na técnica), etiquetas detectáveis (por exemplo, etiquetas fluorescentes ou radioativas conhecidas na técnica), etc. Por exemplo, uma proteína VSP quimérica pode conter uma subsequência que compreende um domínio de VSP de uma primeira proteína VSP (por exemplo, uma proteína VSP de Giardia) e a sequência de sinal de uma proteína diferente (por exemplo, uma segunda proteína VSP de 6fc/tfâ). Em outras modalidades, uma proteína VSP quimérica pode conter uma subsequência que compreende um domínio de VSP de uma primeira proteína VSP de uma primeira espécie (por exemplo, uma proteína VSP de Tetrahymena thermophiia) e a sequência de sinal de uma proteína VSP diferente de uma segunda espécie (por exemplo, um peptídeo de sinal de GiaEdia). Em algumas modalidades, uma VSP quimérica pode compreender mais do que um domínio de VSP. Em algumas modalidades, uma VSP quimérica pode compreender um domínio de VSP que compreende subdomínios (por exemplo, um ou mais domínios ricos em cisteína similares a furina ou um ou mais domínios similares a fator de crescimento epidérmico) de proteínas VSP diferentes, que podem ser da mesma espécie ou de espécies diferentes.

[00107] O local de domínios de VSP em uma proteína VSP pode ser prontamente identificado com o uso de ferramentas computacionais conhecidas na técnica. Por exemplo, uma proteína sequência pode ser varrida para identificar subsequências que contém modelo de domínio de PFAM PFAM03302 (proteína de superfície específicas de variante de Giardia). O programa InterproScan também pode ser usado para realizar varredura de uma proteína candidata para corresponder com a coleta INTERPRO de bancos de dados de assinatura de proteína, em particular, para a presença de modelo IPR005127 (proteína de superfície específicas de variante de Giardia). Uma pessoa versada entenderia que as fronteiras de subsequências de domínio de VSP selecionados para serem incluídos em uma VSP quimérica não precisam corresponder exatamente com as fronteiras relatadas por ferramentas computacionais tal como InterproScan. Consequentemente, uma pessoa versada na técnica, com o uso dos métodos revelados no presente documento e conhecimento geral na técnica seria capaz de modificar as fronteiras de um domínio de VSP identificado de modo computacional e verificar sem experimentação indevida se o fragmento de domínio de VSP resultante pode de fato funcionar como um carreador de VSP. Também, uma pessoa versada na técnica seria capaz de identificar o local de sequências de sinal de peptídeo para uso como componentes VSPs quiméricas com o uso de ferramentas publicamente disponíveis, por exemplo, o programa SignalP disponível em www.cbs.dtu.dk/services/SignalP. Por exemplo, o programa SignalP pode ser usado para identificar o local de peptídeos de sinal na VSP e proteínas similares à VSP incluídas na Tabela 1 ou em outras proteínas identificadas como contendo um domínio de VSP com base na presença de modelos PFAM03302 e/ou IPR005125 suas sequências de aminoácido. [1] Em alguns casos, uma VSP natural pode ser muito grande para expressão recombinante bem sucedida, seu nível de expressão em culturas celulares pode ser muito baixo ou o grande tamanho pode prejudicar a purificação ou a produção de formulações estáveis. Consequentemente, a presente revelação fornece um método para gerar um carreador de VSP que compreende excisar um domínio de VSP de uma grande proteína VSP candidata. Em algumas modalidades, os aminoácidos são adicionados e/ou removidos das terminações carbóxi e/ou amino do domínio de VSP excisado de modo a otimizar propriedades desejáveis, por exemplo, nível de expressão, rendimento de expressão, rendimento de purificação, estabilidade em solução, estabilidade de formulação, resistência às proteases, estabilidade de pH, estabilidade térmica, capacidade de fixação às membranas de GIT, capacidade de se ligarem a agentes terapêuticos, etc.

[00108] Os carreadores de VSP da invenção não são ligados de modo covalente aos agentes terapêuticos por meio de ligações peptídicas. Desse modo, o termo "ligação" e seus variantes gramaticais (por exemplo, "ligam”, "liga”, "ligar”, etc.) quando aplicados à interação entre um carreador de VSP e um agente terapêutico se refere a (i) ligação não peptídica covalente (por exemplo, ligação por meio de uma ligação de dissulfeto) ou (ii) ligação não covalente, mas não à formação de ligação peptídica entre o carreador de VSP e um agente terapêutico.

[00109] Exemplos não limitativos de ligação não covalente entre um carreador de VSP e um agente terapêutico incluem uma ligação iônica (por exemplo, ligação de cátion-pi ou ligação de sal), uma ligação de metal, uma ligação de hidrogênio (por exemplo, ligação de diidrogênio, complexo de diidrogênio, ligação de hidrogênio de baixa barreira ou ligação de hidrogênio simétrica), força de van der Waals, força de dispersão London, uma ligação mecânica, uma ligação de halogênio, aurofilicidade, intercalação, empilhamento, força entrópica ou polaridade química.

[00110] O termo "ligação" também se refere a encerrar ou encerrar parcialmente um agente terapêutico (por exemplo, um peptídeo bioativo tal como insulina) por uma estrutura molecular que compreende um carreador de VSP. Em algumas modalidades, o termo "ligação" se refere à interação (covalente ou não covalente) de um carreador de VSP com uma estrutura macromolecular na qual um agente terapêutico é encerrado. A esse respeito, o agente terapêutico pode ser encerado ou empacotado, por exemplo, em uma bicamada de lipídio, lipossoma, nanopartícula, nanotubo, nanobolha, micela, nanoesfera, nanocarcaça, nanohaste, gaiola química, nanochifre, ponto quântico, nanocluster, microbolha, dendrímero, “aquasome”, lipopoliplex, nanoemulsão ou uma combinação dos mesmos. O termo "ligação" também inclui ligação de um carreador de VSP a uma bicamada de lipídio ou inserção de um carreador de VSP em uma bicamada de lipídio que tanto compreende o agente terapêutico (por exemplo, um fármaco lipossolúvel inserido no núcleo hidrofóbico da bicamada) ou encerra o agente terapêutico (por exemplo, a bicamada de lipídio é parte de um lipossoma na qual o agente terapêutico é empacotado).

[00111] Em algumas modalidades, o carreador VSP compreende uma porção química heteróloga geneticamente fundida a um peptídeo hidrofóbico que ancora o carreador VSP à bicamada. Em outras modalidades, uma porção química heteróloga que ancora o carreador VSP à bicamada (por exemplo, um peptídeo hidrofóbico ou uma âncora de lipídio) pode ser quimicamente conjugada ao carreador VSP. Em algumas modalidades, o carreador VSP pode ser geneticamente fundido ou conjugado a uma porção química heteróloga por um ligante. O termo "ligante" se refere a uma entidade molecular que liga, de modo covalente, um carreador VSP e uma porção química heteróloga. O ligante pode compreender, por exemplo, um grupo tiol, um grupo alquila, um grupo glicol ou um grupo peptídeo. Os ligantes incluem moléculas de cruzamento. Veja, por exemplo, a Publicação de Patente Internacional no WO 2004/009116, a qual está incorporada ao presente documento a título de referência em sua totalidade.

[00112] Em algumas modalidades, o carreador VSP é ligado ao agente terapêutico formando-se uma "partícula similar a vírus" (VLP) que compreende o agente terapêutico (tanto na superfície da VLP ou encapsulado na VLP). Conforme usado no presente documento, o termo "partícula similar a vírus" ou "VLP" se refere a uma estrutura que se assemelha uma partícula de vírus que exibe uma VSP de Giárdia ou um fragmento da mesma na superfície da mesma. Uma partícula similar a vírus, de acordo com a presente invenção, não é replicativa, já que a mesma carece de todo ou parte de um genoma viral, típica e preferencialmente carecendo todo ou parte dos componentes replicativos e infecciosos de um genoma viral. O termo "não replicativo" conforme usado no presente documento se refere a não ter a capacidade de replicar o genoma compreendido ou não na VLP.

[00113] Conforme usado no presente documento, o termo "combina" (e variantes gramaticais tais como "combinado" ou "que combina") se refere ao processo de misturar por adição dois ou mais componentes (por exemplo, um carreador VSP e um agente terapêutico) de modo que o contato entre os componentes ocorre e tal contato permite a ligação dos dois ou mais componentes.

[00114] Em algumas modalidades específicas, um agente terapêutico (por exemplo, um peptídeo bioativo tal como IL-2) pode ser geneticamente fundido a uma proteína VSP (veja, por exemplo, experimentos preliminares revelados no primeiro parágrafo do Exemplo 9). Em modalidades específicas, o agente terapêutico é um peptídeo bioativo (por exemplo, insulina, glucagon, hormônio de crescimento) em uma forma de nanopartícula que é quimicamente conjugada a uma VSP. Em algumas modalidades, um agente terapêutico (por exemplo, um peptídeo bioativo) é quimicamente conjugado a uma VSP sem nenhum ligante interposto entre o agente terapêutico e o ligante. Em algumas modalidades, um agente terapêutico (por exemplo, um peptídeo bioativo) é quimicamente conjugado a uma VSP com pelo menos um ligante interposto entre o agente terapêutico e a VSP.

[00115] Em algumas modalidades, um carreador VSP pode ser quimicamente conjugado com mais que um agente terapêutico (por exemplo, mais que um peptídeo bioativo). Em algumas modalidades, dois ou mais carreadores VSP podem ser quimicamente conjugados com um agente terapêutico (por exemplo, um peptídeo bioativo). Em outras modalidades, dois ou mais que dois carreadores VSP podem ser quimicamente conjugados com mais que um agente terapêutico (por exemplo, mais que um peptídeo bioativo). Em algumas modalidades, um agente terapêutico é biologicamente ativo enquanto é geneticamente fundido ou quimicamente conjugado a um carreador VSP. Em outras modalidades, o agente terapêutico (por exemplo, um peptídeo bioativo) é inativo ou somente parcialmente ativo enquanto é geneticamente fundido ou quimicamente conjugado a um carreador VSP, em cujo caso, clivagem química e/ou enzimática pode ser exigida para liberar a forma ativa (ou uma mais ativa) do agente terapêutico. De modo contrário, em algumas modalidades, o agente terapêutico (por exemplo, um peptídeo bioativo) é ativo enquanto geneticamente fundido ou quimicamente conjugado a um carreador VSP, e clivagem química e/ou enzimática pode ser usada para liberar a forma ativa do agente terapêutico a partir do carreador VSP a fim de inativar o agente terapêutico. Desse modo, um agente terapêutico (por exemplo, um peptídeo bioativo) pode ser protegido pelo carreador VSP enquanto em uma parte do GIT (por exemplo, o estômago), e degradado ou inativado após passagem para uma parte diferente do GIT pelas condições diferentes prevalecentes naquela porção do GIT (por exemplo, pH diferente ou enzimas específicas).

[00116] Em algumas modalidades, um agente terapêutico (por exemplo, um peptídeo bioativo) e um carreador VSP podem ser geneticamente fundidos ou quimicamente conjugados por um ligante de peptídeo ou outro tipo de ligante que pode ser clivado (por exemplo, quimicamente ou por uma protease) tal como a forma ativa do peptídeo terapêutico é liberada a partir do carreador VSP. Em algumas modalidades, um agente terapêutico (por exemplo, um peptídeo bioativo) e um carreador VSP podem ser geneticamente fundidos ou quimicamente conjugados por um ligante de peptídeo ou outro tipo de ligante que pode ser clivado (por exemplo, quimicamente ou por uma protease) tal como a forma inativa do agente terapêutico é liberada a partir do carreador VSP.

[00117] Em algumas modalidades, um agente terapêutico (por exemplo, um peptídeo bioativo) e um carreador VSP (ligado, geneticamente fundido ou quimicamente conjugado) podem ser ligados, geneticamente fundidos ou quimicamente conjugados com outra molécula para formar uma molécula bivalente (por exemplo, tanto o carreador VSP como o agente terapêutico sendo geneticamente fundidos à terminação carboxi da cadeia beta de proteína de ligação de C4b (C4PB)).

Carreadores de VSP de VSPs de Giardia

[00118] Em algumas modalidades, o carreador VSP compreende uma sequência de VSP escolhida entre o repertório completo de VSPs que é codificada no nível de DNA no genoma do parasita Giardia. Esse repertório é composto de cerca de 200 genes que codificam VSP homólogos (vsps), que varia em diferentes isolados de Giardia (veja, Adam et al., BMC Genomics 11:424 (2010)). Deve-se observar, adicionalmente, que variantes das VSPs de Giardia, fragmentos e derivados também podem ser usados como carreadores VSP de acordo com a invenção. Uma lista representativa, não limitante, de proteínas que podem ser usadas como carreadores VSP é apresentada na TABELA 1. TABELA 1: Lista exemplificativa de VSP e proteínas similares a VSP que podem ser usadas como carreadores VSP.

[00119] A TABELA 1 inclui as sequências de 585 VSP e proteínas similares à VSP que compreendem motivo de proteína de superfície de variante específica Interpro Giardia IPR005127 (lista de sequência publicada online em embl- ebi.org/interpro/IEntry?ac=IPR005127 e publicamente disponível em 12 de junho de 2012). Outra VSP e proteínas similares à VSP que podem ser usadas como carreadores VSP, de acordo com a presente revelação, são as 1,079 sequências de proteína que compreendem o motivo de proteína de superfície de variante específica de Giardia PF03302 disponível em Versão 26.0 do banco de dados Pfam (lista de sequência publicada online em pfam.sanger.ac.uk/family/PF03302 e publicamente disponível em 12 de junho 2012). As listas de sequências de proteína publicadas nos bancos de dados citados acima e publicamente disponíveis nas datas reveladas acima estão incorporadas ao presente documento a título de referência em sua totalidade.

[00120] Conforme mencionado acima, as VSPs de Giardia e, mais particularmente o domínio extracelular das VSPs de G/ã/zZ/á compreendem múltiplos motivos CXXC, preferencialmente múltiplos motivos CXXC separados por diversos aminoácidos, de 3 a 20 aminoácidos e, mais particularmente, de 5 a 8 aminoácidos (conforme observado por múltiplos alinhamentos de sequência). Desse modo, em algumas modalidades, o carreador VSP é um fragmento, análogo ou derivado de uma VSP ou proteína similar à VSP de Giardia, em que o carreador VSP compreende 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ou 40 motivos CXXC. Em algumas modalidades, o carreador VSP compreende pelo menos cerca de 40, pelo menos cerca de 50, pelo menos cerca de 60, pelo menos cerca de 70, pelo menos 80, cerca de 90 ou pelo menos cerca de 100 motivos CXXC de uma VSP de Giardia.

[00121] Em uma modalidade particular, o parasita de G/a/tf/a é Giardia Em uma modalidade, a VSP de Giardia pode ser sem limitação VSP9B10 (Uniprot:Q9GS24), VSP1267 (Uniprot:Q07317), VSPA6 (Uniprot:Q24970), VSPSl (Uniprot:Q8I0P4), VSPS2 (Uniprot:Q8I8W6), VSPS3 (Uniprot:Q8I0M3), VSPS4 (Uniprot: E2RTM9), VSPS5 (Uniprot:Q8I8W4), VSPS6 (Uniprot:Q8I8W3), VSPS7 (Uniprot:Q8I8W2), VSPS8 (Uniprot:E2RTU6), VSPAS1 (Uniprot:Q8I0M3), VSPAS2 (Uniprot:8I8W0), VSPAS3 (Uniprot:Q8I8V9), VSPAS4 (Uniprot:Q8I0P4), VSPAS5 (Uniprot:Q8I8V8), VSPAS6 (Uniprot:Q8I8V7), VSPAS7 (Uniprot:Q8I8V6), VSPAS8 (Uniprot:Q8I8V5), VSPAS9 (Uniprot:Q8I8V4), VSPAS10 (Uniprot:Q8I8V3), VSPAS11 (Uniprot:Q8I8V2), VSPAS12 (Uniprot:E2RU01) ou VSPH7 (Uniprot: Q24992) de GiardiaiambHa, va fragmentos, variantes ou derivados dos mesmos.

[00122] Em uma modalidade, um carreador VSP compreende o domínio extracelular de uma VSP de Giardia, ou um fragmento, variante ou derivado do mesmo (já que o dito domínio extracelular é a região rica em cisteína de amino-terminal que compreende múltiplos motivos CXXC da proteína VSP de Giardia}.

[00123] O domínio extracelular de uma VSP de éiardia é o domínio resistente a pH, temperatura e digestão proteolítica. Assim, em outra modalidade, o carreador VSP, de acordo com a invenção compreende somente o domínio extracelular de uma VSP de Giardia, ou um fragmento, variante ou derivado do mesmo. Em uma modalidade particular, o carreador VSP compreende a sequência extracelular de VSP1267 (SEQ ID NO:2), que compreende o peptídeo de sinal N-terminal. A região de transmembrana e a cauda citoplásmica de uma VSP Gá/tf/a são, desse modo, eliminadas. Deve-se observar que o sinal de peptídeo também pode ser removido do domínio extracelular de VSP.

[00124] Uma lista de VSP e proteínas similares à VSP adequadas para gerar carreadores VSP, incluindo as sequências das mesmas, Números de Acesso Uniprot, e Nomes de Entrada Uniprot está incluída ao final deste relatório descritivo. A correspondência entre nosde Acesso Uniprot e Nomes de Entrada e número de proteína VSP pode ser determinada a partir da entrada Uniprot em www.uniprot.org. Por exemplo, no de Acesso Uniprot Q07317 e o Nome de Entrada do mesmo Q07317_GIAIN irá corresponder a VSP1267.

[00125] O termo "carreador VSP1267" se refere a um fragmento produzido de modo recombinante da proteína de VSP de GMá VSP1267 sem o domínio de transmembrana e cauda citosólica, mas com o peptídeo de sinal intacto e que compreende, adicionalmente, uma etiqueta His6 de C-terminal (SEQ ID NO:1, mostrado na Figura 5A). Em algumas modalidades, um carreador VSP é um fragmento, variante ou derivado do domínio extracelular de VSP1267 (sequência de proteína é SEQ ID NO:2; sequência de codificação de DNA é SEQ ID NO: 4). Em outras modalidades, um carreador VSP é um fragmento, variante ou VSP9B10 (sequência de proteína é SEQ ID NO:3; sequência de codificação de DNA é SEQ ID NO: 5). Veja TABELA 2. TABELA 2: Sequências de Proteína e DNA de carreadores VSP exemplificativos.

Carreadores VSP de domínios similares à VSP

[00126] Em algumas modalidades, um carreador VSP compreende uma sequência VSP escolhida a partir de entre domínios similares à VSP, fragmentos, variantes ou derivados dos mesmos a partir de micro-organismos diferentes de Giardia. Essas proteínas similares à VSP compartilham propriedades bioquímicas e homologia de sequência com VSPs de Giamia. Em algumas modalidades, sequências similares à VSP selecionadas para serem usadas como carreadores VSP compreendem múltiplos motivos CXXC. Em algumas modalidades, tais múltiplos motivos CXXC são separados por 5 a 8 aminoácidos.

[00127] O alinhamento da sequência do domínio extracelular da G/s/zZ/s VSP1267, usado no presente documento como um carreador VSP exemplificativo, com outras sequências de moléculas similares à VSP levou a observar a presença de múltiplos motivos CXXC, notavelmente separados por 5 a 8 aminoácidos, em proteínas que pertencem a espécies Paramecium, Tetrahymena e Entamoeba. Desse modo, os fragmentos representativos de sequências primárias de quinases de superfície de Entamoeba sp., e proteínas de superfície de Paramecium sp. e Tetrahymena sp. preveem um domínio conservado contendo motivos CXXC em uma arquitetura similar à VSP (comparada com Giardia67P 1267, 9B10 (SEQ ID NO:3) e H7 como responsável por resistência a pH, temperatura e digestão proteolítica).

[00128] Em uma modalidade, o micro-organismo Tetrahymena é Tetrahymena thermophiia. Em outra modalidade, o micro-organismo Entamoebas Entamoeba histolytica. Em outra modalidade, o micro-organismo Paramecium é Paramecium tetraureiia.

[00129] Em uma modalidade, o carreador VSP compreende o domínio extracelular de uma proteína similar à VSP, ou um fragmento, variante ou derivado do mesmo (já que o dito domínio extracelular é a região rica em cisteína de amino-terminal compreende múltiplos motivos CXXC da proteína VSP de Giardia). Em outra modalidade, o carreador VSP compreende somente o domínio extracelular de uma proteína similar à VSP, ou fragmento, variante ou derivado do mesmo.

[00130] Desse modo, em algumas modalidades, o carreador VSP é um fragmento, análogo ou derivado de uma proteína similar à VSP que compreende 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ou 40 motivos CXXC. Em algumas modalidades, o carreador VSP compreende pelo menos cerca de 40, pelo menos cerca de 50, pelo menos cerca de 60, pelo menos cerca de 70, pelo menos 80, cerca de 90 ou pelo menos cerca de 100 motivos CXXC de uma proteína similar à VSP. VSPs como carreadores de agente terapêutico

[00131] Os carreadores VSP podem ser usados para entregar agentes terapêuticos para um indivíduo que necessita dos mesmos. Desse modo, em algumas modalidades, a presente revelação fornece uma composição terapêutica que compreende um carreador VSP e um agente terapêutico. Essa composição terapêutica pode ser formulada, por exemplo, para administração oral. Em algumas modalidades, a composição terapêutica é formulada para administração por mucosa. Conforme revelado acima, o carreador VSP pode compreender sem limitação uma VSP, uma proteína similar à VSP, uma VSP ou fragmento de proteína similar à VSP, uma VSP ou derivado de proteína similar à VSP, ou uma combinação de dois ou mais dos ditos carreadores VSP. Em modalidades específicas, o carreador VSP compreende uma VSP de Giardia (por exemplo, VSP1267) ou um fragmento da mesma, por eemplo, um domínio extracelular de VSP ou um fragmento de tal domínio extracelular.

[00132] Em algumas modalidades, o carreador VSP compreende uma sequência de proteína VSP e compreende, adicionalmente, uma porção química heteróloga, por exemplo, uma etiqueta de purificação tal como uma etiqueta His6. Em outras modalidades, a porção química heteróloga pode ser uma proteína, peptídeo, polímero, etc. que pode aperfeiçoar uma propriedade farmacodinâmica ou farmocinética ou tal como meia vida. Em uma modalidade específica, o carreador VSP é SEQ ID NO:1, isto é, o domínio extracelular de ViarliaWSPlZUld incluindo o peptídeo de sinal N-terminal e uma etiqueta His6 C-terminal.

[00133] Agentes terapêuticos que podem ser entregues por um carreador VSP incluem agentes biológicos. O termo "agente biológico" inclui tanto agente terapêuticos de não proteína como proteínas. Agentes terapêuticos de não proteína exemplificativos incluem polissacarídeos, lipídeos, fármacos (por exemplo, fármacos de molécula pequena), ácidos nucleicos (por exemplo, oligonucleotídeos), lipopolissacarídeos, ribozimas, materiais genéticos, príons, vírus, etc.

[00134] Em algumas modalidades da presente invenção, o agente terapêutico é um polipeptídeo farmacologicamente ativo. Em algumas modalidades, o polipeptídeo é um peptídeo bioativo, por exemplo, uma citocina, uma interleucina (por exemplo, IL-2 ou IL- 10), um hormônio (por exemplo, paratormônio), um fator de crescimento ou um receptor. Em modalidades específicas, os peptídeos bioativos podem ser, sem limitação, insulina, hormônio de crescimento humano, glucagon, paratormônio, IL-2, IL-10, bem como fragmentos, análogos, derivados ou variantes dos mesmos, ou combinações de dois ou mais desses peptídeos bioativos. Os exemplos fornecidos acima não são limitantes, e contempla- se que um carreador VSP pode ser usado para entregar outros peptídeos bioativos e proteínas. Por exemplo, carreadores VSP podem ser usados para entrega oral ou por mucosa de proteínas que compreendem domínios de ligação de antígeno tais anticorpos e fragmentos dos mesmos (por exemplo, scFv’s ou moléculas que compreendem scFv).

[00135] Em algumas modalidades específicas, o peptídeo bioativo é insulina, por exemplo, uma insulina natural, uma insulina recombinante, ou um análogo de insulina. Em algumas modalidades, o análogo de insulina é uma insulina de rápida atuação (por exemplo, insulina Aspart), uma insulina de longa duração (por exemplo, insulina Glargina) ou uma combinação das mesmas. Numerosos análogos de insulina são conhecidos na técnica.

[00136] Agentes terapêuticos também podem incluir agentes terapêuticos de peso molecular baixo clássicos comumente denominados fármacos, incluindo, mas sem limitação, antineoplástico, imunossupressantes, antioproliferativos, antitrombinas, antiplaqueta, antilipídeo, anti-inflamatório, angiogênico, antiangiogênico, vitaminas, inibidores de ACE, substâncias vasoativas, antimitóticas, inibidores de metaloproteinase, doadores de NO, estradiois ou agentes antiesclerose, sozinhos ou em combinação. Em algumas modalidades, o fármaco é um fármaco fracamente solúvel sob condições aquosas, por exemplo, um antibiótico.

[00137] O agente terapêutico também pode ser um composto que precisa ser ativado a fim de ser terapeuticamente ativo, por exemplo, um pró-fármaco ou um zimogênio. Em tais modalidades, o agente terapêutico é metabolizado no fármaco desejado ou agente biológico após ter sido administrado em um indivíduo em combinação com um carreador VSP.

[00138] Em algumas modalidades, o carreador VSP é ligado diretamente ao agente terapêutico. Em outros aspectos, o carreador VSP é ligado a uma partícula de vetor que contém o agente terapêutico. Assim, a partícula de vetor pode ser uma partícula viral, uma partícula similar a vírus (VLP), uma nanopartícula, ou um lipossomo. Em um aspecto particular, a partícula de vetor é uma partícula viral que exibe na superfície da mesma o agente terapêutico. Em outro aspecto, a partícula de vetor é um vírus que não exibe o agente terapêutico na superfície do mesmo. Em um aspecto particular, a partícula de vetor é uma VLP que exibe na superfície da mesma o agente terapêutico. Em outro aspecto, a partícula de vetor é uma VLP que encapsula o agente terapêutico. Em um aspecto particular, a partícula de vetor é uma nanopartícula que exibe na superfície da mesma o agente terapêutico. Em outro aspecto, a partícula de vetor é uma nanopartícula que encapsula o agente terapêutico. Em um aspecto particular, a partícula de vetor é um lipossomo que exibe na superfície do mesmo o agente terapêutico. Em outro aspecto, a partícula de vetor é um lipossomo que encapsula o agente terapêutico. Em outro aspecto particular, o agente terapêutico está contido dentro da superfície da partícula de vetor, por exemplo, dentro de uma bicamada de lipídeo em um lipossoma.

[00139] Em uma modalidade particular, a partícula de vetor é uma partícula similar a vírus (VLP). Quando partículas similares a vírus estão sendo usadas, as mesmas podem ser preparadas de acordo com procedimentos conhecidos na técnica e, por exemplo, conforme descrito na Publicação de Pedido de Patente Internacional no WO 2002/34893, a qual está incorporada no presente documento a título de referência em sua totalidade. Em algumas modalidades, a VLP exibe na superfície um carreador VSP e um agente terapêutico. Desse modo, em algumas modalidades, um carreador VSP pode ser ligado a um agente terapêutico exposto na superfície da VLP.

[00140] O carreador VSP, de acordo com a invenção, pode formar uma superfície de proteção (conforme ocorre naturalmente no parasita tropozoítas) que permite a entrega correta do agente terapêutico na mucosa (por exemplo, mucosa intestinal), sem sofrer degradação no trato digestivo.

[00141] Em determinadas modalidades, os carreadores VSL fornecidos no presente documento não são fixados de modo covalente aos agentes terapêuticos através de ligações peptídicas. Desse modo, antes de administração, um carreador VSP é "combinado" com pelo menos um agente terapêutico. Conforme revelado acima, o termo "combina" se refere ao processo de misturar por adição dois ou mais componentes (por exemplo, um carreador VSP e um agente terapêutico) de modo que o contato entre os componentes ocorre e tal contato permite a ligação dos dois ou mais componentes.

[00142] Em algumas modalidades, um carreador VSP pode ser combinado com um agente terapêutico. Em outras modalidades, um carreador VSP pode ser combinado com mais que um agente terapêutico. Em algumas modalidades quando um carreador VSP é combinado com mais que um agente terapêutico, o carreador VSP pode se ligar a somente um dos agentes terapêuticos. Em outras modalidades, o carreador VSP pode se ligar a mais que um dos agentes terapêuticos.

[00143] Em algumas modalidades, dois ou mais carreadores VSP podem ser combinados com um agente terapêutico. Em outras modalidades, dois ou mais que dois carreadores VSP podem ser combinados com mais que um agente terapêutico. Em algumas modalidades, quando dois ou mais de dois carreadores VSP são combinados com mais de um agente terapêutico, cada carreador VSP pode se ligar a apenas um dos agentes terapêuticos. Em outras modalidades, cada carreador VSP pode se ligar a mais que um agente terapêutico.

[00144] Em algumas modalidades, a razão de molécula para molécula de carreador VSP para agente terapêutico (carreador VSP:agente terapêutico) varia de cerca de 10:1 a cerca de 1:10. Em outras modalidades, a razão de molécula para molécula de carreador VSP para agente terapêutico (carreador VSP:agente terapêutico) varia de cerca de 3:1 a cerca de 1:3. Em algumas modalidades, a razão de molécula para molécula de carreador VSP para agente terapêutico (carreador VSP:agente terapêutico) é 3:1. Em outras modalidades, a razão de molécula para molécula de carreador VSP para agente terapêutico (carreador VSP:agente terapêutico) é 1:1.

[00145] Em algumas modalidades, a razão de molécula para molécula de carreador VSP para agente terapêutico (carreador VSP:agente terapêutico) é cerca de 1:1, cerca de 2:1, cerca de 3:1, cerca de 4:1, cerca de 5:1, cerca de 6:1, cerca de 7:1, cerca de 8:1, cerca de 9:1, ou cerca de 10:1. Em algumas modalidades, a razão de molécula para molécula de carreador VSP para agente terapêutico (VSP:agente terapêutico) é maior que 10:1. Em algumas modalidades, a razão de molécula para molécula de carreador VSP para agente terapêutico (carreador VSP:agente terapêutico) é cerca de 1:2, cerca de 1:3, cerca de 1:4, cerca de 1:5, cerca de 1:6, cerca de 1:7, cerca de 1:8, cerca de 1:9, ou cerca de 1:10. Em algumas modalidades a razão de molécula para molécula de carreador VSP para agente terapêutico (VSP:agente terapêutico) é menos que 1:10.

[00146] Em alguns aspectos, o carreador VSP e o agente terapêutico são coadministrados, isto é, os mesmos são administrados simultaneamente ao indivíduo, então os mesmos combinam no momento de administração. Em alguns aspectos, o carreador VSP e o agente terapêutico são combinados antes da administração. Em alguns aspectos, a combinação de carreador VSP e agente terapêutico pode ocorrer pelo menos cerca de 1 minuto, pelo menos cerca de 2 minutos, pelo menos cerca de 3 minutos, pelo menos 4 minutos, pelo menos cerca de 5 minutos, pelo menos cerca de 10 minutos, pelo menos cerca de 15 minutos, pelo menos cerca de 20 minutos, pelo menos cerca de 25 minutos, pelo menos cerca de 30 minutos, pelo menos cerca de 45 minutos, pelo menos cerca de 1 hora, pelo menos cerca de 2 horas, pelo menos 3 horas, pelo menos cerca de 4, ou pelo menos 6 horas antes da administração. Em algumas modalidades, o carreador VSP e o agente terapêutico são combinados pelo menos 1 dia, pelo menos 2 dias, pelo menos 3 dias, pelo menos 4 dias, pelo menos 5 dias, pelo menos 6 dias, ou pelo menos 7 dias antes da administração. Em algumas modalidades, um carreador VSP e um agente terapêutico são combinados em uma forma estável que pode ser usada dias, semanas ou meses após combinar o carreador VSP e o agente terapêutico.

VSP como um carreador de insulina

[00147] Em certos aspectos, um carreador de VSP pode ser combinado com uma insulina para administração mucosa ou oral em um indivíduo.

[00148] Conforme usado no presente documento, o termo "insulina" compreende análogos de insulina, insulina natural extraída de mamíferos (^orexemplo, insulina humana), insulina de mamífero produzida de modo recombinante (por exemplo, insulina humana), insulina extraída de fontes suínas e/ou bovinas, insulina bovina e suína produzida de modo recombinante, insulina produzida em animais transgênicos e misturas de qualquer um desses produtos de insulina. O termo se destina a abranger um polipeptídio normalmente usado no tratamento de diabéticos em uma forma substancialmente purificada, mas abrange o uso do termo em sua forma farmacêutica comercialmente disponível, que inclui excipientes adicionais. A insulina usada para combinar com um carreador de VSP pode ser produzida de modo recombinante e pode ser desidratada (completamente seca) ou em solução.

[00149] O termo "análogo de insulina" se refere a qualquer forma de "insulina", conforme definido acima, em que um ou mais dentre os aminoácidos dentro da cadeia de polipeptídeos foi substituído com um aminoácido alternativo e/ou em que ou mais dos aminoácidos foram deletados ou em que um ou mais aminoácidos adicionais foram adicionados à cadeia de polipeptídeos ou sequências de aminoácidos que atuam como insulina na diminuição dos níveis de glicose no sangue. Em geral, o termo "análogos de insulina" inclui, por exe/77/Vo, análogos de "Lispro de insulina", conforme revelado, por exNmplo, Na Patente no U.S. 5.547.929, incorporada ao presente documento em sua totalidade a título de referência; análogos de insulina que incluem insulina LysPro e insulina Humalog e outros análogos de "super insulina", em que a habilidade de o análogo de insulina afetar níveis de glicose sérica é substancialmente otimizada conforme comparado com insulina convencional bem como análogos de insulina hepatoseletivos que são mais ativos no fígado do que no tecido adiposo. O termo "análogos de insulina" também inclui insulinas modificadas enzimaticamente ou de modo químico (por exemplo, insulinas de mamífero convertidas quimicamente em insulina humana), insulina NPH (por exemplo, uma insulina isofano de ação intermediária), insulina asparta, insulina glulisina, insulina glargina, insulina detemir, insulina degludec, etc.

[00150] Em algumas modalidades, os análogos de insulina são análogos de insulina monoméricos, que são compostos similares a insulina usados para a mesma finalidade geral que a da insulina, como insulina lispro, poq exe/np/o, quaisquer compostos que são administrados para reduzir níveis de glicose no sangue.

[00151] Os "análogos de insulina" são compostos bem conhecidos. Os análogos de insulina são conhecidos por serem divididos em duas categorias: análogos de insulina animal e análogos de insulina modificados (páginas 716 a 20, capítulo 41, Nolte M. S, e Karam, J. H., "Pancreatic Hormones & Antidiabetic Drugs" In Basic & Clinical Pharmacology, Katzung, B. G., Ed., Lange Medical Books, Nova Iorque, 2001). Historicamente, os análogos de insulina animal incluem insulina suína (que tem um aminoácido diferente da insulina humana) e insulina bovina (que tem três aminoácidos diferentes da insulina humana), que foram amplamente usadas para tratamento de diabetes. Desde o desenvolvimento de tecnologia de engenharia genética são feitas modificações para criar análogos de insulina modificados, incluindo análogos de insulina de ação rápida ou análogos de insulina de ação prolongada. Diversas moléculas de análogo de insulina têm sido comercializadas antes de data de depósito do pedido da matéria. Por exemplo, Eli Lilly comercializa um análogo de insulina de ação rápida denominada "Lispro" sob o nome comercial HUMALOG® e Novo Nordisk vende outro análogo de insulina de ação rápida, denominado "Aspart" sob o nome comercial NOVOLOG®. Além disso, Aventis comercializa um análogo de insulina de ação prolongada denominado "Glargine" sob o nome comercial LANTUS® e Novo Nordisk comercializa outro análogo de insulina de ação prolongada denominado "Detemir" sob o nome comercial LEVEMIR®. A referência de Tabela 41 a 4 de Nolte e Karam (2001) citada acima fornece uma lista não limitante da ampla faixa de tipos de moléculas geralmente referidas como insulina.

[00152] O termo insulina também abrange a insulina, conforme definido acima, acoplada de modo covalente a um ou mais porções químicas heterólogas que podem aprimorar as propriedades farmacocinéticas e/ou farmacodinâmicas sobre insulinas nativas, por exemplo, insulinas peguiladas (consulte, por exemplo, a Patente no U.S. 6.890.518). Consulte, também, a Patente no U.S. 7.049.286, 7.470.663; 6.890.518; e Publicação de Pedido nos U.S. US2008/0139784; US2011/0281791; US2009/0036353; US20110020871; US2009/0239785.

[00153] Em algumas modalidades, um carreador de VSP pode ser combinado com um peptídeo de não insulina com atividade insulinotrófica. Em algumas modalidades, o peptídeo de não insulina com atividade insulinotrófica é uma incretina. Em algumas modalidades, a incretina é um agonista de receptor de peptídeo-1 similar a glucagon (GLP1). Em algumas modalidades, um carreador de VSP pode ser combinado com GLP1 ou um análogo, variante, fragmento ou derivados dos mesmos. Em algumas modalidades, o análogo GLP1 é liraglutídeo (comercializado como VICTOZA™). Em outras modalidades, o análogo GLP1 é albiglutídeo. Em ainda outras modalidades, o análogo GLP1 é taspoglutídeo.

[00154] Em outras modalidades, um carreador de VSP pode ser combinado com exendina- 4, ou um análogo, variante, fragmento, ou derivados dos mesmos. Em algumas modalidades, um carreador de VSP pode ser combinado com exenatida (comercializado como BYETTA®, e BYDUREON®). Em outras modalidades, um carreador de VSP pode ser combinado com lisexenatida.

[00155] Em ainda outras modalidades, um carreador de VSP pode ser combinado com um inibidor DPP-4 (gliptina). Em algumas modalidades, o inibidor DPP-4 é alogliptina. Em outras modalidades, o DPP-4 é, por exemplo, sitagliptina (comercializado como JANUVIA®), vildagliptina (comercializado como GALVUS®), saxagliptina (comercializado como ONGLYZA®), linagliptina (comercializado como TRADJENTA®), dutogliptina, gemigliptina, berberina ou lupeol.

VSP como um carreador de glucagon

[00156] Em certos aspectos, um carreador de VSP pode ser combinado com glucagon para administração mucosa ou oral a um indivíduo.

[00157] Conforme usado no presente documento, o termo "glucagon" compreende análogos de glucagon, glucagon natural extraído de mamífero (por exemplo, glucagon humano), glucagon de mamífero produzido de modo recombinante (por exemplo, glucagon humano), glucagon extraído de fontes suínas e/ou bovinas, glucagon produzido de modo recombinante, glucagon produzida em animais transgênicos e misturas de qualquer um desses produtos de glucagon. O termo se destina a abranger o polipeptídeo normalmente usado no tratamento de hipoglicemia em uma forma substancialmente purificada, mas abrange o uso do termo em sua forma farmacêutica comercialmente disponível, que inclui excipientes adicionais. O glucagon usado para combinar com um carreador de VSP pode ser produzido de modo recombinante. Em algumas modalidades, o glucagon pode ser desidratado (completamente seco) ou em solução.

VSP como um carreador de hormônio do crescimento

[00158] Em certos aspectos, um carreador de VSP pode ser combinado com um hormônio do crescimento, poh exemmlô, hormônio do crescimento humano, para administração mucosa ou oral a um indivíduo.

[00159] Os termos "hormônio do crescimento e "hGH” se referem, em geral, a hormônios do crescimento secretados pela glândula pituitária em mamíferos. Embora não seja uma lista completa, os exemplos de mamíferos incluem humanos, chipanzé, macaco, rato, porco, cachorro, coelho, gato, vaca, cavalo, camundongo e cabra. Em algumas modalidades da presente invenção, o mamífero é um humano.

[00160] Os termos "hormônio do crescimento humano" e "hGH" são usados de forma intercambiável e se referem a uma proteína que tem uma sequência de aminoácido, estrutura e característica de função de hormônio do crescimento humano natural. Conforme usado no presente documento, hGH também inclui qualquer isoforma de hormônio do crescimento humano nativo, incluindo, mas não limitado a, isoformas com massas moleculares de 5, 17, 20, 22, 24, 36 e 45 kDa (consulte, poH exemplo, Haro et al., J. Chromatography B, 720, 39-47 (1998)). Então, o termo hGH inclui a sequência de 191 aminoácidos de hGH natural, somatotropina e a sequência de 192 aminoácidos que contém um metionina N-terminal (Met-hGH) e somatrem (consulte, porexemplo, Patente no U.S. 4.342.832 e 5.633.352). hGH pode ser obtido por isolação e purificação de uma fonte biológica ou por meio de métodos de DNA recombinante. Met-hGH é tipicamente preparado por metodologia de DNA recombinante.

[00161] O termo "hormônio do crescimento humano" também abrange derivados de hormônio do crescimento humano. O termo "derivado hormônio do crescimento humano" se refere a uma proteína que se difere em pelo menos cerca de 1%, mas não mais do que 20% da sequência de aminoácidos da sequência de 191 aminoácidos de hGH ou da sequência de 192 aminoácidos Met-hGH. Por exemplo, o derivado pode se diferenciar cerca de 1% a cerca de 20%, cerca de 2% a cerca de 15%, ou cerca de 5% a cerca de 10% da sequência de 191 aminoácidos de hGH ou da sequência de 192 aminoácidos Met-hGH, a proteína pode se diferenciar cerca de 1%, cerca de 2%, cerca de 3%, cerca de 4%, cerca de 51%, cerca de 6%, cerca de 7%, cerca de 8%, cerca de 9%, cerca de 10%, cerca de 11%, cerca de 12%, cerca de 13%, cerca de 14%, ou cerca de 15% da sequência de 191 aminoácidos de hGH ou de sequência Met-hGH com 192 aminoácidos. As diferenças entre o derivado e os 191 aminoácidos hGH ou a sequência de aminoácido Met-hGH com 192 aminoácidos pode ser uma ou mais substituições (por exemplo, substituições não conservadoras ou conservadoras), supressões, adições (por exemplo, inserções ou adições carboxi-terminal ou amino-terminal)), modificações, ou combinações dos mesmos.

[00162] Em algumas modalidades, um derivado de hGH mantém uma atividade biológica e/ou uma propriedade química e/ou física dos 191 aminoácidos hGH ou a sequência de aminoácido Met-hGH com 192 aminoácidos. Igualmente, em algumas modalidades, a formulação que contém um derivado (por exemplo, uma formulação de derivado de hGH cristalino complexado de poli-Arg) possui uma propriedade física e/ou química de uma formulação similarmente preparada que contém os 191 aminoácidos hGH ou a sequência de aminoácidos Met-hGH com 192 aminoácidos (porexemplo, uma formulação de composto de hGH cristalino com poli-Arg).

[00163] Em várias modalidades da presente revelação, os derivados de hormônio do crescimento humano compreendem cátions orgânicos de hGH ou Met-hGH, variantes de substituição, supressão e inserção de hGH biologicamente sintetizado ou proteínas Met- hGH, hGH modificadas de forma pós-traslacional e hGH e proteínas Met-hGH, que incluem -sem limitação- desamidação, fosforilação, glicosilação, acetilação, agregação e reações de clivagem enzimática (consulte, por exemplo, Haro efa/., J. Chromatography B, 720, 39-47 (1998)), hGH modificado quimicamente ou proteínas Met derivadas de fontes biológicas, análogos de polipeptídeo e peptídeos sintetizados quimicamente que contêm sequências de aminoácidos análogas àquelas de hGH ou Met-hGH. Os métodos usados para preparar hGH ou Met-hGH incluem isolamento de uma fonte biológica, metodologia de DNA recombinante, vias químicas sintéticas ou combinações dos mesmos. Os genes que codificam diferentes sequências de DNA de hGH incluem hGH-N e hGH-V (consulte, porrxemplo, Haro etal, J. Chomatography B, 720, 39-47 (1998); Bennani-Baiti et al., Genomics, 29, 647-652 (1995)). hGH é comercialmente disponível em forma liofilizada e é tipicamente produzido por métodos de DNA recombinante.

Produção de carreadores VSP

[00164] A expressão recombinante dos carreadores de VSP pode ser alcançada através da construção de um vetor de expressão que contém um polinucleotídeo que codifica um carreador de VSP. Uma vez que um polinucleotídeo que codifica um carreador de VSP tiver sido obtido, o vetor para a produção do carreador de VSP pode ser produzido pela tecnologia de DNA recombinante com uso de técnicas conhecidas na técnica.

[00165] Os métodos para preparar uma proteína expressando-se um polinucleotídeo que contém uma sequência de nucleotídeo que codifica o carreador de VSP são conhecidos na técnica. Os métodos que são conhecidos por aquelas pessoas versadas na técnica podem ser usados para construir os vetores de expressão que contêm sequências de codificação de carreador de VSP e sinais de controle translacionais transcripcionais apropriados. Esses métodos incluem, por exemplo, técnicas de DNA recombinante //7 iz/fro, técnicas sintéticas, erecombinação genética //7 vitro. A revelação, então, fornece vetores reproduzíveis que compreendem uma sequência de nucleotídeo que codifica um carreador de VSP ligado de forma operacional a um promotor.

[00166] Um vetor de expressão pode ser transferido para uma célula hospedeira por técnicas convencionais e as células transfectadas podem, então, ser cultivadas por técnicas convencionais para produzir um carreador de VSP. Assim, a invenção inclui células hospedeiras que contêm um polinucleotídeo que codifica um carreador de VSP, associado, de forma operacional, com um promotor. As células hospedeiras adequadas incluem, mas não são limitadas a, microrganismos como bactéria (^or exemplo, E. coU e B. subtilis), células fúngicas, células mamíferas ou células de inseto.

[00167] Uma variedade de sistemas de vetor de expressão de hospedeiro pode ser utilizada para expressar o carreador de VSP da presente revelação. Tais sistemas de expressão de hospedeiro representam veículos pelos quais as sequências de codificação de interesse podem ser produzidas e subsequentemente purificadas, mas também representam células que podem, quando transformadas ou transfectadas com as sequências de codificação de nucleotídeo apropriado, expressar um carreador de VSP //7 .ilu. Isso inclui, mas não são limitados aos microrganismos como bactéria (por exemplo, E. co/i e B. subtHis} transformadas com DNA bacteriófago recombinante, DNA de plasmídeo ou vetores de expressão de DNA de cosmídeo que contém sequências de codificação de carreador de VSP, sistema de célula fúngica (por exemplo, Saccharomyces ou Pichia}, sistema de célula de mamífero (por exemplo, células COS, CHO, BHK, 293, NOS e 3T3), ou sistemas de célula de inseto (Sf9, Hi5). Uma vez que um carreador de VSP foi produzido por meio da expressão recombinante, pode ser purificado por qualquer método conhecido na técnica para purificação de uma proteína.

[00168] Em algumas modalidades, um DNA que codifica um carreador de VSP é de códon otimizado para expressão em um sistema de expressão de proteína de inseto, por exemplo, o sistema de expressão de baculovírus. Em algumas modalidades, um carreador de VSP é expressado em um sistema de expressão de proteína de inseto, por exemplo, um sistema de expressão de baculovírus em células de inseto Sf9 ou Hi5.

Composições farmacêuticas

[00169] Em outro aspecto, a presente revelação fornece uma composição terapêutica que inclui, mas não é limitada a, uma composição farmacêutica, que contém um ou mais do que um do carreador de VSP combinado com um ou mais do que um dos agentes terapêuticos, formulados com um excipiente farmaceuticamente aceitável. Tais composições podem incluir uma ou uma combinação de dois ou mais carreadores de VSP diferentes. Por exemplo, uma composição farmacêutica pode compreender uma combinação de carreadores de VSP que se ligam ao mesmo agente terapêutico ou a mais do que um agente terapêutico. Esses agentes terapêuticos podem ter atividades complementárias. Em um aspecto específico, uma composição farmacêutica compreende um único carreador de VSP. Em uma modalidade específica, uma composição farmacêutica compreende mais do que um dos carreadores de VSP.

[00170] As composições farmacêuticas que compreendem um ou mais carreadores de VSP também podem ser administradas na terapia de combinação. Por exemplo, a terapia de combinação pode incluir uma composição farmacêutica que compreende pelo menos um carreador de VSP combinado com pelo menos um agente terapêutico, combinado com pelo menos uma outra terapia em que a terapia pode ser imunoterapia, quimioterapia, tratamento de radiação, ou terapia de fármaco. As composições farmacêuticas da invenção podem incluir um ou mais sais farmacêuticos aceitáveis.

[00171] Os exemplos de carreadores aquosos e não aquosos adequados que podem ser empregados em composições farmacêuticas consideradas da invenção incluem água, etanol, polióis (como glicerol, propilenoglicol, polietilenoglicol, e similares), e misturas adequadas dos mesmos, óleos vegetais, como óleo de oliva e ésteres orgânicos injetáveis, como oleato de etila. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de materiais de revestimento, como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula exigido no caso de dispersões, e pelo uso de tensoativos.

[00172] Em outro aspecto, as composições farmacêuticas que compreendem um carreador de VSP também podem conter agentes como conservantes, agentes de umidificação, agentes de emulsificação agentes de dispersão. A prevenção da presença de microrganismos pode ser garantida tanto por procedimentos de esterilização quanto pela inclusão de vários agentes antifúngicos e antibactericidas, por exemplo, parabeno, clorobutanol, fenol ácido ascórbico e similares. Também pode-se desejar incluir agentes isotônicos, como açúcar, cloreto de sódio e similares nas composições. Além disso, a absorção prolongada pode ser conseguida pela inclusão de agentes que prolongam a absorção, como monoestearato de alumínio e gelatina.

[00173] Os carreadores farmaceuticamente aceitáveis incluem soluções ou dispersões aquosas estéreis e pós estéreis para a preparação extemporânea de dispersão ou soluções injetáveis estéreis. O uso de tais meios e agentes para substâncias farmaceuticamente ativas é conhecido na técnica. Exceto na medida em que qualquer meio ou agente convencional é incompatível com o composto ativo, o uso do mesmo nas composições farmacêuticas da invenção é contemplada. Os compostos ativos suplementares também podem ser incorporados nas composições farmacêuticas da invenção.

[00174] Os níveis de dosagem atuais dos ingredientes ativos em composições farmacêuticas que compreendem um carreador de VSP podem ser variados de modo a obter uma quantidade do ingrediente ativo que seja eficaz para alcançar a resposta terapêutica desejada para um paciente, composição e modo de administração determinados, sem ser tóxico para o paciente. O nível de dosagem selecionado dependerá de uma variedade de fatores farmacocinéticos que incluem a atividade das composições específicas empregadas, ou o éster, sal ou amida dos mesmos, a via de administração, o tempo de administração, a taxa de excreção do composto particular que está sendo empregado, a duração do tratamento, outros fármacos, compostos e/ou materiais usados em combinação com as composições específicas empregadas, a idade, sexo, peso, condição, saúde geral e histórico médico anterior do paciente que é tratado, e fatores similares conhecidos nas técnicas médicas.

[00175] Uma dosagem terapeuticamente efetiva da composição farmacêutica que compreende um carreador de VSP pode ser indicada por meio da diminuição na gravidade de sintomas de doença, um aumento na frequência e duração de períodos livres de sintomas de doença, ou uma prevenção de piora ou incapacidade devido ao padecimento físico causado pela doença. Uma dose terapeuticamente efetiva também pode impedir ou retardar o início da doença. Por conseguinte, qualquer ensaio de monitoramento bioquímico ou clínico pode ser usado para determinar se um tratamento particular é uma dose terapeuticamente efetiva. Uma pessoa de habilidade comum na técnica pode ter capacidade para determinar tais quantidades com base em fatores tais como o tamanho da pessoa, a gravidade dos sintomas da pessoa e a composição específica ou via de administração selecionada.

[00176] As composições terapêuticas que compreendem um carreador de VSP são particularmente adequadas para a administração oral. Alternativamente, as composições terapêuticas que compreendem um VSP podem ser administradas através de uma via não parenteral, como uma via mucosa, epidérmica ou tópica de administração, por exemplo, de modo intranasal, bucal, vaginal, retal, sublingual ou via tópica. Certamente, as composições terapêuticas que compreendem um carreador de VSP podem ser administradas através de uma ou mais vias alternativas de administração com uso de um ou mais dentre uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Conforme será verificado por uma pessoa versada, a via e/ou modo de administração irá variar, dependendo dos resultados desejados.

[00177] Em certas modalidades, as composições terapêuticas que compreendem carreadores de VSP são formuladas para uma administração oral ou uma administração mucosa. As doses usadas para a administração oral ou uma administração mucosa podem ser adaptadas como uma função de vários parâmetros, e em particular como uma função do modo da patologia relevante, ou, alternativamente, da duração desejada de tratamento.

[00178] Mediante a formulação, as composições farmacêuticas que compreendem os carreadores de VSP podem ser administradas em uma maneira compatível com a formulação de dosagem e em tal quantidade tal que seja terapeuticamente eficaz. As formulações são facilmente administradas em uma variedade de formas de dosagem, como o tipo de, por exemplo, comprimidos ou outros sólidos para uma administração oral ou uma administração mucosa; cápsulas de liberação prolongada; e qualquer outra forma atualmente usada. Por conseguinte, a composição farmacêutica pode ser em forma de um spray, um aerossol, uma mistura, uma suspensão, uma dispersão, uma emulsão, um gel, uma pasta, um xarope, um creme, uma pomada, inserções (orelha, olho, pele, nariz, reto e vagina), preparações intramamárias, comprimidos vaginais, supositórios ou comprimidos uterinos). Em certas modalidades, o uso de lipossomas é considera. A formação e uso de lipossomas são conhecidas por pessoas versadas na técnica.

[00179] Mais particularmente, a composição farmacêutica é formulada de modo que o agente terapêutico na composição terapêutica da invenção seja resistente à degradação química e enzimática do trato gastrointestinal superior, quando necessário. Ademais, em certas modalidades, um carreador de VSP deve ter capacidade para se fixar às células, mais particularmente células epiteliais do trato gastrointestinal.

Métodos

[00180] Os carreadores de VSP da presente revelação têm utilidade diagnóstica e terapêutica ín IZ/PÜ e in vivo. Por exemplo, os carreadores de VSP podem ser usados para administrar agentes terapêuticos ou reagentes diagnósticos para as células em cultura, por exemplo, in vitro ou ex vivo, ou em um indivíduo, por exe/np/o, in vivo, para tratar, evitar ou diagnosticar uma variedade de distúrbios. Uma doença, um distúrbio ou condições fisiológicas consideradas na invenção podem ser, mas não são limitadas a, deficiências hormonais, cânceres, doenças imunológicas, doenças autoimunes, rejeições de aloenxertos, doenças virais, como influenza ou AIDS, doenças parasitárias, infecções bacterianas ou alergias.

[00181] A presente revelação fornece um método que libera um agente terapêutico a uma localização-alvo em um sujeito que compreende a administração de uma composição terapêutica que compreende um carreador de VSP e um agente terapêutico. Em algumas modalidades específicas do método revelado de entrega, o carreador de VSP é o carreador VSP1267 e o agente terapêutico é um peptídeo bioativo como insulina, glucagon ou hGH.

[00182] Também é fornecido um método de tratamento de uma doença ou afecção em um indivíduo que compreende administrar ao dito indivíduo uma quantidade efetiva de uma composição terapêutica que compreende um carreador de VSP e um agente terapêutico. Em algumas modalidades, a doença ou afecção é uma deficiência hormonal. Em modalidades específicas, a deficiência hormonal é uma deficiência de insulina. Em algumas modalidades, a deficiência de insulina édiabetes tipo 1. Em algumas modalidades específicas, o método de tratamento da deficiência hormonal compreende administrar o carreador VSP1267 e um peptídeo bioativo como insulina, glucagon ou hGH.

[00183] A presente revelação também fornece um método de tratamento de uma doença ou uma afecção em um indivíduo que compreende combinar um carreador de VSP e um agente terapêutico, em que o carreador de VSP pode se ligar ao agente terapêutico, e administrar uma quantidade efetiva da combinação de carreador de VSP e agente terapêutico ao sujeito. Em algumas modalidades específicas, o carreador de VSP é o carreador VSP1267 e é combinado com um agente terapêutico, que é um peptídeo bioativo como insulina, glucagon ou hGH.

[00184] A presente revelação também fornece um método de produzir uma composição entregue por via oral ou via mucosa, que compreende combinar um carreador de VSP e um agente terapêutico, em que o carreador de VSP pode se ligar ao agente terapêutico. Em algumas modalidades específicas, a composição entregue por via oral ou via mucosa compreende o carreador VSP1267 combinado com um agente terapêutico, que é um peptídeo bioativo como insulina, glucagon ou hGH.

[00185] Também revelado no presente documento está um método de produzir uma composição injetável adequada para administração mucosa ou oral que compreende combinar um carreador de VSP e um agente terapêutico, em que o carreador de VSP pode se ligar ao agente terapêutico. Em algumas modalidades específicas, a composição injetável entregue por via oral ou via mucosa compreende o carreador VSP1267 combinado com a agente terapêutico, que é um peptídeo bioativo como insulina, glucagon ou hGH.

[00186] Também é fornecido na presente revelação um método de aumentar a resistência de um agente terapêutico para a degradação enzimática que compreende combinar um carreador de VSP e um agente terapêutico, em que o carreador de VSP pode se ligar ao agente terapêutico, e em que a combinação do carreador de VSP com o agente terapêutico resulta na resistência aprimorada do agente terapêutico para degradação enzimática. Em algumas modalidades específicas, o carreador de VSP é o VSP1267 e o agente terapêutico é um peptídeo bioativo como insulina, glucagon ou hGH.

[00187] A presente revelação também fornece um método de aumento da resistência de um agente terapêutico para desnaturação de pH que compreende combinar o agente terapêutico com um carreador de VSP, em que o carreador de VSP pode se ligar ao agente terapêutico, e em que combinar o carreador de VSP com o agente terapêutico resulta em uma resistência aprimorada do agente terapêutico para desnaturação de pH. Em algumas modalidades específicas, o carreador de VSP é o VSP1267 e o agente terapêutico é um peptídeo bioativo como insulina, glucagon ou hGH.

[00188] A presente revelação também fornece um método de aumento simultâneo da resistência de um agente terapêutico para a degradação enzimática e sua resistência para desnaturação de pH que compreende combinar o agente terapêutico com um carreador de VSP, em que o carreador de VSP pode se ligar ao agente terapêutico, e em que a combinação do carreador de VSP com o agente terapêutico resulta em uma resistência aumentada de um agente terapêutico para a degradação enzimática e resistência aumentada para a desnaturação de pH. Em algumas modalidades, a combinação do carreador de VSP com o agente terapêutico aumenta a resistência do agente terapêutico para a degradação mediada de pH quando exposto a um pH que varia entre cerca de 1 e cerca de 2, ou entre cerca de 2 e cerca de 3, ou entre cerca de 3 e cerca de 4, ou entre 4 e cerca de 5, ou entre cerca de 5 e cerca de 6, ou entre cerca de 6 e 7, ou entre cerca de 7 e cerca de 8, ou entre cerca de 8 e cerca de 9, ou entre cerca de 9 e cerca de 10, ou entre cerca de 10 e cerca de 11, over entre cerca de 11 e cerca de 12, ou entre cerca de 12 e cerca de 13, ou entre cerca de 13 e cerca de 14. Em algumas modalidades específicas, o carreador de VSP é o VSP1267 e o agente terapêutico é um peptídeo bioativo como insulina, glucagon ou hGH.

[00189] Também é fornecido um método de aprimoramento da capacidade de fixação de um agente terapêutico às células epiteliais mucosas que compreende combinar um agente terapêutico com um carreador de VSP, em que o carreador de VSP pode se ligar ao agente terapêutico, e em que a combinação do carreador de VSP com o agente terapêutico resulta em uma fixibilidade aprimorada do terapêutico para as células epiteliais mucosas. Em algumas modalidades específicas, o carreador de VSP é o VSP1267 e o agente terapêutico é um peptídeo bioativo como insulina, glucagon ou hGH. Em algumas modalidades, as células epiteliais mucosas são células epiteliais intestinais. Em outras modalidades, as células epiteliais mucosas são células epiteliais gástricas. Em outras modalidades, as células epiteliais mucosas são células epiteliais por via oral. A entrega por via mucosa, isto e, entrega de um agente terapêutico ao tecido mucoso por meio de um carreador de VSP se refere a, porexemplo, entrega aos brônquios e outros tecidos mucosos de trato respiratório, gengival, lingual, nasal, oral, gastrointestinal e tecidos mucosos de trato geniturinário.

[00190] A invenção também fornece métodos para usar carreadores de VSP no diagnóstico. Em algumas modalidades, um carreador de VSP pode ser combinado com um ou mais do que um reagente de diagnóstico. A invenção também fornece métodos para imagear alvos específicos com o uso de carreadores de VSP. Em uma modalidade, um carreador de VSP é combinado imageando agentes tais como proteínas fluorescentes verdes, outras etiquetas fluorescentes (Cy3, Cy5, Rodamina e outras), biotina ou radionuclídeos a serem usados em métodos para imagear a presença, localização ou progressão de um alvo específico. Em alguns aspectos, o método para imagear um alvo que compreende um carreador de VSP é realizado por MRI, varredura PET, raio X, detecção por fluorescência ou por outros métodos de detecção conhecidos na técnica.

[00191] As terapias que compreendem o uso de carreadores de VSP podem ser combinadas com terapias convencionais adequadas para a prevenção, tratamento, redução ou melhora da doença ou sintomas da mesma. As terapias convencionais exemplificativas podem ser encontradas no Physician’s Desk Reference (56a edição, 2002 e 57a edição, 2003). Em algumas modalidades, as terapias que usam carreadores de VSP podem ser combinadas com quimioterapia, cirurgia, imunoterapia com um produto biológico (por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação por antígeno do mesmo ou um peptídeo, por exemplo, um peptídeo bioativo), moléculas pequenas ou outra terapia conhecida na técnica. Em algumas modalidades, a terapia combinatória é administrada juntamente com a terapia que compreende o uso dos carreadores de VSP. Em outras modalidades, a terapia combinatória é administrada separadamente da terapia que compreende o uso de carreadores de VSP.

[00192] A presente revelação também fornece métodos para monitorar a progressão, reincidência, tratamento ou melhora da doença com o uso dos carreadores de VSP. Em uma modalidade, os métodos para monitorar a progressão, reincidência, tratamento ou melhora da doença é realizado pelos métodos de imagear, diagnosticar ou contatar um composto/alvo com um carreador de VSP conforme apresentado no presente documento.

[00193] A presente revelação também fornece um método para aumentar a solubilidade de um fármaco pouco solúvel (por exemplo, um fármaco de molécula pequena) combinando o mesmo com um carreador de VSP, em que a ligação do fármaco pouco solúvel ao carreador de VSP aumenta a solubilidade do fármaco. Em algumas modalidades, o fármaco pouco solúvel é um fármaco de molécula pequena usado para tratar um desequilíbrio hormonal (por exemplo, um fármaco de molécula pequena antidiabético). Em outras modalidades, o fármaco pouco solúvel é um antibiótico. Em algumas modalidades, o antibiótico é um antibiótico de aminoglicosídeo, por exemplo, amicacina. Em outras modalidades, o antibiótico é um antibiótico de glicopeptídeo, por exemplo, vancomicina.

Kits

[00194] Também é fornecido um pacote ou kit farmacêutico que compreende um ou mais recipientes preenchidos com uma ou mais das composições farmacêuticas reveladas no presente documento. Pode estar opcionalmente associado a tal(is) recipiente(s) um aviso na forma prescrita por uma agência governamental que regula a fabricação, uso ou venda dos produtos farmacêuticos ou biológicos, tal aviso reflete a aprovação pela agência da fabricação, uso ou venda para administração humana. A presente revelação fornece kits que podem ser usados nos métodos acima de tratamento e administração. Em um aspecto, um kit compreende um carreador de VSP, de preferência, em uma forma purificada, em um ou mais recipientes. Em algumas modalidades, o kit compreende um carreador de VSP combinado com um produto terapêutico em um recipiente. Em outras modalidades, o kit compreende um carreador de VSP e um agente terapêutico em diferentes recipientes.

Equivalentes

[00195] Aqueles versados na técnica reconhecerão ou poderão certificar, com o uso de não mais do que a experimentação de rotina, muitos equivalentes às modalidades específicas da invenção descrita no presente documento. Tais equivalentes destinam-se a ser abrangidos pelas reivindicações a seguir.

[00196] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente referidos no presente documento são expressamente incorporados a título de referência em suas totalidades. Exemplos

Exemplo 1 Resistência de VSP ao pH variável e à digestão por proteases intestinais.

[00197] As VSPs são proteínas de membrana integrais de parasitas de protozoário, por exemplo, Giardialaablidi com uma região extracelular variável rica em motivos CXXC, uma eão hdofóbica de transmembrana única e uma cauda citoplásmica curta com 5 aminoácidos de comprimento (Figura 1A) (Lujan, £ssays Biochem. 51:177 a 191 (2011); Prucca etal.6 Annu. Rev. Microbiol 65:611 a 630 (2011). Cada trofozoíto (o estável móvel e ativo do parasita G/a/tf/aque coloniza o intestino delgado superior de diversos vertebrados e a causa dos sintomas da doença) expressa uma única VSP em sua superfície, conforme mostrado nas Figuras 1B e 1C. A Figura 1B mostra ensaios de contraste de fase (painel esquerdo) e imunofluorescência (painel direito) que mostram que dentre um grupo de trofozoítos Giardiasomente um expressa na superfície do mesmo a VSP VSP9B10, conforme demonstrado pela identificação de superfície com um anticorpo monoclonal específico a anti-VSP9B10, enquanto que outras células expressam diferentes proteínas de superfície (Prucca & Lujan, Cell. Micmbiol. 11:1706 a 1715 (2011). A Figura 1C mostra uma microscopia imunoeletrônica de um trofozoíto Giardia com o uso de um anticorpo monoclonal específico a anti-VSP. Pode-se observar que a superfície inteira do parasita é identificada, incluindo o disco ventral disk e a flagela, gerando um revestimento de superfície espesso composto por VSPs que protege o parasita dentro do ambiente altamente hidrolítico do intestino delgado superior (Pimenta etai., Irrfect. Immun. 59: 3.989 3.996 (1991).

[00198] As VSPs purificadas não são tóxicas para células quando adicionadas a culturas e as mesmas não são toxicas para animais quando administradas por via oral. Os animais não perdem peso e não têm diarreia, que são comumente associados a infecções por Giardia (consulte Rivero et ai., Nat. Med. 16(5):551 a 557 (2010)). Apesar de sua falta de toxicidade, para serem úteis como carreadores de agente terapêutico, as VSPs devem ter a capacidade de sobreviver às condições adversas do GIT.

[00199] Para determinar se as VSPs são resistentes ao pH variável e à digestão proteolítica, dois diferentes isolados de Giapdia (populações de trofozoíto clonal) foram tratados com tripsina e com pH variável e o efeito daquelas condições na VSP expressas por cada isolado foi monitorado com o uso de ensaios de imunofluorescência.

[00200] Para o ensaio de resistência de tripsina, os parasitas Gfc/tf/d foram ressuspensos em PBS a pH 7,4 e tratados por 90 minutos com concentrações variáveis de tripsina similares àquelas encontradas no intestino delgado superior. Posteriormente, os parasitas foram lavados e incubados com dois anticorpos monoclonais, sendo que cada um reconhece a VSP particular expressa por cada um dentre os dois isolados testados: o isolado GS/M e o isolado WB. O anticorpo monoclonal G10/4 reconheceu um epítopo conformacional em VSPH7 do isolado GS/M. O anticorpo monoclonal 9B10 detectou um epítopo não conformacional em VSP9B10 do isolado WB. Os anticorpos aglutinaram os trofozoítos e identificaram a superfície dos parasitas (Rivero et al., /Vai, Afed 16:551 557 (2010).

[00201] Observou-se que, após a incubação com 100 μg/ml ou 200 μg/ml de tripsina, a presença de ambas as proteínas VSP ainda era detectável pelos anticorpos monoclonais, indicando que ambas as VSPs sobreviveram à tripsinização (Figura 2A).

[00202] Para o ensaio de resistência a pH, os parasitas G/a/tf/aforam ressuspensos no meio de cultura celular RPMI a pHs variáveis, de pH 1 a pH 10, em aumentos de 1 unidade de pH (somente os pH 1, 3, 5 e 10 são mostrados na Figura 2B). Os parasitas Giardia foram mantidos nos diferentes pHs por 90 minutos, lavados e, então, incubados com o anticorpo monoclonal correspondente. Em todos os casos, os epítopos de VSP em VSPH7 e VSP9B10 permaneceram intactos conforme determinado pela microscopia de imunofluorescência, indicando que ambas as VSPs sobreviveram à exposição ao pH variável sem passar pela degradação química (Figura 2B) (Rivero et al., Nit. M16. 16:551 a 557 (2010).

[00203] A resistência à digestão proteolítica também foi demonstrada com o uso da análise de Western Blot de VSPs após tratar os trofozoítos com tripsina (Figura 3). Os clones de parasita Giardia WB-9B10, WB-1267 e GS-H7 (que expressam, respectivamente, as VSPs VSP9B10, VSP1267 e VSPH7) foram ressuspensos em PBS a pH 7,4 e tratados por 90 min a 37 °C com concentrações variáveis de tripsina (200 μg/ml e 2 mg/ml). Então, os parasitas foram lisados e as quantidades de proteína equivalentes foram aplicadas a cada faixa nos géis SDS-PAGE. A Figura 3 mostra que três VSPs testadas tiveram a capacidade de sobreviver à exposição à tripsina.

[00204] Esses resultados demonstraram que as VSPs são resistentes à degradação proteolítica e podem sobreviver a condições ambientais similares àquelas encontradas nas porções superiores do GIT.

Exemplo 2 Fixação de VSP à mucosa entérica após a administração oral

[00205] Para determinar se as VSPs tiveram a capacidade de se fixar à mucosa entérica após a administração oral, ensaios //7 wto foram conduzidos em gerbilos. Um grupo de gerbilos foi infectado com trofozoítos WB-9B10 de clone de parasita C/a/rZ/a (Figura 4, painel A), um segundo grupo não foi infectado (Figura 4, painel B) e um terceiro grupo de gerbilos foi imunizado com o repertório inteiro de VSPs purificadas de trofozoítos transgênicos (Figura 4, painel C). As seções de tecido de cada grupo foram incubadas com o anticorpo monoclonal anti-VSP9B10, detectado com imunoglobulinas anticamundongo identificadas com peroxidase de raiz-forte, desenvolvidas com 3,3’ diaminobenzidina e contrastadas com hematoxilina/eosina.

[00206] Uma diferença grande no nível de manchamento da superfície das células epiteliais do intestino entre infectadas ou imunizadas (painéis A e C) em comparação ao animal não infectado (painel B) foi observada, indicando que as VSPs permaneceram fixadas à mucosa entérica após a administração oral.

[00207] Esses resultados, juntamente com os resultados do Exemplo 1 indicaram que as VSPs sobreviveram ao pH e a condições enzimáticas no GIT e se fixaram de modo bem sucedido às células epiteliais do intestino. Essas propriedades físico-químicas podem permitir que as VSPs transportem fármacos através do GIT e a permanência prolongada no GIT deve permitir a passagem de fármacos carregados pelas VSPs do GIT para a corrente sanguínea.

Exemplo 3 Produção recombinante do carreador de VSPVSP1267

[00208] Para obter o carreador de VSP a ser usado para experimentos de administração oral, uma proteína VSP modificada foi designada e produzida de modo recombinante. A VSP de comprimento completo contém um peptídeo de sinal, uma região extracelular rica em cisteína que contém vários motivos CXXC, uma região de transmembrana e cauda citoplásmica curta (Figura1A). Um construto de DNA foi gerado no qual a região de transmembrana e os 5 resíduos citoplásmicos do VSP1267 foram eliminados e uma etiqueta de purificação de proteína His6 foi adicionada no terminal carbóxi (Figura 5A) (SEQ ID NO:1). A sequência de sinal está sublinhada na Figura 5A. Os aminoácidos na etiqueta de purificação de proteína His6 são mostrados em uma caixa na Figura 5A.

[00209] Inicialmente, o carreador de VSP foi expresso de modo recombinante na E. coli BL21 com o uso do vetor de expressão pET28 (Novagen). A produção de proteína foi subsequentemente melhorada pela otimização de códon da sequência de DNA recombinante para a expressão no baculovírus. A produção de VSP heteróloga foi realizada clonando-se o fragmento de DNA de VSP que codifica a variante VSP1267 (Figura 5A) (SEQ ID NO:1), após a otimização de códon da sequência de DNA recombinante para a expressão nas células de inseto Sf9 com o uso do sistema de baculovírus. A proteína foi expressa a partir do sobrenadante de cultura celular e purificada por uma purificação de afinidade em etapa em uma coluna Nickel Sepharose com o uso da etiqueta His6 presente na porção de terminal carbóxi da proteína (Figura 5B). Os resultados mostraram que a VSP eluída é altamente purificada.

Exemplo 4 Sensibilidade de insulinas comercial à tripsina

[00210] Para testar in aitco a capacidade de carreadores de VSP de proteger peptídeos bioativos da degradação, a capacidade do VSP1267 recombinante de proteger a insulina de condições similares àquelas presentes no GIT foi avaliada. A insulina natural é um peptídeo bioativo com uma massa molecular de 5,8 a 6 kDa. Antes de avaliar a capacidade da VSP de proteger a insulina da degradação in VÍVOGQ GIT, a sensibilidade de duas insulinas comerciais à proteólise pela tripsina (uma protease pancreática altamente purificada) e pancreatina (uma mistura comercial das enzimas pancreáticas hidrolíticas) foi testada in vitro.

[00211] Dois tipos de insulina comercial foram testados: • LANTUS®: Insulina glargina (Sanofi-Aventis). Difere-se da insulina humana natural em que o aminoácido asparagina na posição A21 é substituído por glicina e duas argininas são adicionadas à C-terminação da cadeia B, MW: 6.063 kDa). A mesma é uma insulina de ação prolongada. • NOVORAPID®: Insulina asparte (Novo/Nordisk). Difere-se da insulina humana em que o aminoácido, B28, que é normalmente prolina, é substituído por um resíduo de ácido aspártico). A mesma é uma insulina de ação rápida.

[00212] Os perfis proteolíticos de NOVORAPID® e LANTUS® após a pré-incubação das insulinas com tripsina a 100, 150, 200, 500 e 1.000 μg/ml e pancreatina nas razões de enzima:substrato de 1:1 e 1:2 são mostrados na Figura 6. As insulinas e seus produtos de degradação foram visualizados com o uso do manchamento prateado. A insulina LANTUS® não foi facilmente degradada nas condições experimentais avaliadas. Entretanto, para NOVORAPID®, um aumento dependente de dose de tripsina na degradação proteolítica foi observado.

Exemplo 5 Capacidade d ///ode VSPs de proteger a insulina da degradação

[00213] A combinação de insulina com o carreador de VSP VSP1267 foi avaliada para determinar se a VSP pode (i) proteger a insulina da degradação quando administrada oralmente e (ii) promover sua ação biológica sistêmica, ou seja, a regulação dos níveis de glicose no sangue. Consequentemente, uma dose oral subótima de insulina foi primeiramente determinada e, então, foi determinado se a combinação de insulina nessa dose subótima com o carreador de VSP poderia promover a ação biológica da insulina (consulte a Figura 7).

[00214] A atividade biológica da insulina foi medida testando-se sua capacidade hipoglicêmica. Consequentemente, os níveis de glicose no sangue foram quantificados em camundongos fêmeas de 7 semanas de idade Balb/c deixados sem ingestão de alimentos por 2 horas. Após o período de jejum, os camundongos receberam 1 IU, 5 IU e 50 IU doses orais de LANTUS® (Figura 7A) ou NOVORAPID® (Figura 7B). Os níveis de glicose no sangue foram determinados nos pontos de tempo indicados. Os níveis de glicose no sangue foram também quantificados após a administração subcutânea de 1 a 5 IU de insulina como um controle positivo. Esses experimentos indicaram que 1 IU de insulina foi uma dose oral subótima que poderia ser usada para os experimentos de acompanhamento que testam a administração de insulina em combinação com um carreador de VSP (consulte a Figura 8).

[00215] Os resultados mostrados na Figura 8 demonstram que a administração de insulina em combinação com um carreador de VSP promove a ação de insulina quando administrada por via oral. Nesse experimento, os camundongos fêmeas Balb/c de 7 semanas de idade foram deixados sem ingestão de alimentos por 2 horas e, então, receberam doses de insulina, LANTUS® (Figura 8A) e NOVORAPID® (Figura 8B), na dose subótima identificada na Figura 7 (1 IU) em três formulações diferentes (i) insulina administrada sozinha, (ii) insulina combinada com VSP a uma razão de 1:1 e (iii) insulina combinada com VSP uma razão de 1:3. PBS e uma administração subcutânea de insulina a 1 a 5 IU foram usados como controles. A combinação de 1 IU de insulina com VSPs aprimorou a ação biológica da insulina, a uma razão de insulina/VSP de 1:1 para LANTUS® e uma razão de insulina/VSP de 1:3 para NOVORAPID® (circulado).

Exemplo 6 Proteção in vitro do hormônio de crescimento humano (hGH) pelo carreador de VSP VSP1267

[00216] Para avaliar in aitropa capacidade de um carreador de VSP de proteger peptídeos bioativos da degradação, avaliou-se a capacidade do VSP1267 recombinante de proteger o hormônio de crescimento humano (Somatotropina, hGH) (Biosidus, Argentina), uma proteína com 191 aminoácidos de comprimento, de condições similares àquelas presentes no GIT. Similar à análise anterior realizada com as VSPs sozinhas, a capacidade da VSP de proteger o hGH da degradação causada por pHs extremos ou pela proteólise enzimática foi avaliada.

[00217] Primeiro, a especificidade do anticorpo monoclonal anti-hGH (αhGH) foi determinada por Western blotting (Figura 9). Duas diluições do anticorpo monoclonal αhGH (1/3.000 e 1/2.000), assim como um anticorpo antifosfatase alcalina de controle (oMouse- AP) foram usados para detectar hGH (hormônio de crescimento humano recombinante produzido na E. cofí). O anticorpo monoclonal αhGH reconheceu somente uma banda do peso molecular correto de hGH (22,1 KDa). Diferentes quantidades de hGH (0,25, 0,5, 1, 5 e 10 μg) foram usadas. O anticorpo monoclonal específico αhGH teve a capacidade de detectar quantidades muito baixas de hormônio a diluições muito altas. O anticorpo anticamundongo usado como controle não mostrou nenhuma reação.

[00218] O anticorpo monoclonal anti-hGH foi usado subsequentemente para determinar o grau de resistência de hGH para diferentes pHs. hGH foi incubado a diferentes pHs (1,6, 2,0, 3,8, 5,0, 5,8, 7,0, 8,0, 9,0, 10,0 e 11,0) por 90 minutos. Os resultados de Western blot mostrados no painel superior da Figura 10A assim como a detecção de manchamento prateado do hormônio mostrado no painel da Figura 10A indicaram que em pHs maiores o hGH permaneceu inalterado em comparação ao controle. O hormônio sofreu o processamento autoproteolítico a pHs levemente ácidos que não interferiu com o reconhecimento do anticorpo anti-GH (consulte, por exemplo, Such-Sanmartín etaow Growth Factors 27:255 a 264 (2009)). Entretanto, a pHs muitos baixos (similares àqueles encontrados no estômago), parte do hormônio foi levemente degradada (Figura 10A, círculos).

[00219] Quando um carreador de VSP foi adicionado ao hGH a uma razão de VSP/hGH de 3:1 e as misturas foram incubadas a diferentes pHs (1,4, 1,96, 3,8, 4,91, 5,9, 7,01, 7,95, 8,51, 9,61 e 11,17), nenhuma alteração significativa em relação aos níveis de degradação de hGH do hGH na ausência da VSP foi observada (Figura 10B).

[00220] O hGH foi também tratado por 90 min a 37 °C com diversas concentrações de tripsina (0, 100, 150, 200 e 500 μg/ml). Os resultados de Western blot mostrados no painel superior da Figura 11A assim como a detecção de manchamento prateado do hormônio mostrado no painel inferior da Figura 11A indicaram que o hormônio foi rapidamente degradado mesmo nas menores concentrações de protease. A adição de VSP a uma razão de 3:1 teve a capacidade de proteger o hGH da degradação por tripsina (Figura 11B). Esse efeito protetor foi observado até uma concentração de tripsina de 150 μg/ml.

Exemplo 7 Proteção id divo do hormônio de crescimento humano (hGH) administrado em combinação com um carreador de VSP

[00221] Os níveis séricos de hGH foram testados após a administração oral, avaliando diferentes doses e tempos de medição, para determinar a melhor dose para a combinação com o carreador de VSP VSP1267 (Figura 11A). Como nos experimentos anteriores, camundongos fêmeas Balb/c, de 7 semanas de idade, foram deixados sem ingestão de alimentos por 2 horas e, então, receberam as doses indicadas na Figura 12A (isto é, 50, 100, 200, 400 e 800 μg e hGH). Em um experimento paralelo, o hGH foi administrado por via subcutânea (Figura 11A, inserção). Observou-se que o hGH sozinho é absorvido por via oral a níveis muito menores do que a absorção por via subcutânea (Figura 11A, painel principal). Entretanto, essa absorção oral foi altamente variável em relação tanto aos tempos quanto às quantidades. Assim, uma relação direta entre a absorção e essas variáveis (tempo e concentração) não poderia ser determinada. Apesar desses resultados, usou-se uma dose de 50 μg para avaliar o efeito da combinação de hGH com o carreador de VSP.

[00222] A Figura 12 mostra um desenho de resposta de tempo que mostra os níveis séricos de hGH em camundongos fêmeas Balb/c, de 7 semanas de idade, que foram deixados sem ingestão de alimentos por 2 horas e, então, receberam uma dose de 50 μg de hGH em combinação com um carreador de VSP. A administração oral de hGH:VSP a uma razão de 1:3 (50 μg de hGH combinados com 150 μg de VSP) aprimorou a absorção de hGH em comparação à administração oral de hGH sozinho sem um carreador de VSP.

Exemplo 8 Proteção in vitro e //7 //Vo de paratormônio em combinação com um carreador de VSP

[00223] O hormônio paratireoide (PTH), paratormônio ou paratirina é secretado por células chefe das glândulas paratireoides como um polipeptídeo que contém 84 aminoácidos. O mesmo atua para aumentar a concentração de cálcio (Ca2+) no sangue, enquanto que a calcitonina (um hormônio produzido pelas células parafoliculares (células C) da glândula tireoide) atua para diminuir a concentração de cálcio. O PTH atua para aumentar a concentração de cálcio no sangue atuando mediante o receptor de hormônio paratireoide 1 (altos níveis nos ossos e rim) e o receptor de hormônio paratireoide 2 (altos níveis no sistema nervoso central, pâncreas, testículo e placenta). A meia vida de PTH é aproximadamente 4 minutos. O mesmo tem uma massa molecular de 9,4 kDa. Um nível baixo de PTH no sangue é conhecido como hipoparatireoidismo. As causas incluem acidente cirúrgico (por exemplo, remoção inadvertida durante uma cirurgia de tireoide de rotina), distúrbio autoimune e erros inatos de metabolismo. O hipoparatireoidismo pode ser tratado, por exemplo, com PTH 1-34 sintético (Tireparatídeo). O PTH pode ser medido no sangue em diversas formas diferentes: PTH intacto; PTH de N-terminal; PTH de molécula intermediária e PTH de C-terminal e testes diferentes são usados em diferentes situações clínicas.

[00224] Para avaliar ia vitro a capacidade de carreadores de VSP para proteger o paratormônio da degradação, a capacidade de um carreador de VSP (por exemplo, carreador de VSP VSP1267) de proteger o paratormônio humano de condições similares àquelas presentes no GIT será avaliada. A capacidade da VSP de proteger o paratormônio da degradação causada por pHs extremos ou pela proteólise enzimática (por exemplo, por tripsina e/ou pancreatina) será avaliada com o uso dos métodos descritos nos Exemplos acima.

[00225] O paratormônio sozinho ou misturado com o carreador de VSP será incubado a diferentes pHs ou com diferentes concentrações de enzimas proteolíticas tal como tripsina. A presença do paratormônio após os testes de enzima proteolítica e pH será detectada com o uso de um anticorpo monoclonal antiparatormônio.

[00226] Os resultados experimentais mostrarão se a combinação de um carreador de VSP com o paratormônio aumenta a resistência do paratormônio à proteólise e à degradação induzida por pH.

[00227] Os ensaios in vivo para determinar se a administração oral do paratormônio em combinação com um carreador de VSP protege o paratormônio das condições no GIT e resulta na absorção aumentada em relação ao paratormônio administrado por via oral sem um carreador de VSP serão realizados com o uso dos métodos descritos nos Exemplos anteriores. Por exemplo, os níveis séricos de paratormônio serão medidos em diferentes tempos após a administração oral do paratormônio (sozinho ou em combinação com um carreador de VSP) para camundongos em diferentes doses e razões de paratormônio/VSP. O resultado indicará se a absorção do paratormônio e níveis séricos de paratormônio são aumentados quando o paratormônio é administrado em combinação com um carreador de VSP em comparação à administração oral do paratormônio sozinho sem um carreador de VSP.

Exemplo 9 Proteção in vitro e in vivo de interleucina 2 (IL-2) em combinação com um carreador de VSP

[00228] Em experimentos preliminares, as proteínas de fusão VSP-IL-2 foram produzidas nas quais IL-2 foi geneticamente fundida a uma VSP. Uma dessas proteínas recombinantes compreendeu uma VSP C-terminalmente fundida à IL-2. Em um segundo construto recombinante, a VSP foi C-terminalmente fundida à IL-2 por meio de um ligante disposto entre a C-terminação da VSP e a N-terminação da IL-2.

[00229] A interleucina-2 (IL-2) é uma interleucina, um tipo de molécula de sinalização de citocina no sistema imunológico. A mesma é uma proteína que atrai glóbulos brancos (linfócitos de leucócito), as células que são responsáveis para a imunidade. A mesma é parte da resposta natural do corpo à infecção microbiana e na distinção entre um corpo estranho (não próprio) e o próprio corpo. A IL-2 media seus efeitos ligando-se a receptores de IL-2, que são expressos por linfócitos. A IL-2 foi testada em muitos testes clínicos como uma imunoterapia para o tratamento de canceres, infecções virais crônicas e como adjuvantes para vacinas. Uma forma recombinante de IL-2 para o uso clínico é fabricada por Prometheus Laboratories Inc com o nome comercial Proleukin. A mesma foi aprovada pela Administração de Alimento e Fármaco (FDA) para o tratamento de cânceres (melanoma maligno, câncer de célula renal) e está nos testes clínicos para o tratamento de infecções virais crônicas e como um intensificador (adjuvante) para vacinas.

[00230] Para avaliar ia aitroa capacidade de carreadores de VSP para proteger a IL-2 da degradação, a capacidade de um carreador de VSP (por exemplo, VSP1267 recombinante) de proteger a IL-2 humana de condições similares àquelas presentes no GIT foi avaliada. A capacidade da VSP de proteger a IL-2 da degradação causada por pHs extremos ou pela proteólise enzimática (por exemplo, por tripsina e/ou pancreatina) foi avaliada com o uso dos métodos descritos nos Exemplos acima.

[00231] A IL-2 sozinha ou misturada com o carreador de VSP foi incubada a diferentes pHs ou com diferentes concentrações de enzimas proteolíticas tal como tripsina. A presença de IL-2 após os testes de enzima proteolítica e pH foi detectada com o uso da mancha de Coomassie de géis SDS-PAGE. Os resultados experimentais mostraram que a combinação de um carreador de VSP com IL-2 aumente a resistência da IL-2 à proteólise e à degradação induzida por pH (Figura 15A a C).

[00232] Os ensaios in pivo para determinar se a administração oral da IL-2 em combinação com um carreador de VSP protege a IL-2 das condições no GIT e resulta na absorção aumentada em relação à IL-2 administrada por via oral sem um carreador de VSP serão realizados com o uso dos métodos descritos nos Exemplos anteriores. Por exemplo, os níveis séricos de IL-2 serão medidos em diferentes tempos após a administração oral da IL-2 (sozinha ou em combinação com um carreador de VSP) para camundongos em diferentes doses e razões de IL-2/VSP. Os efeitos biológicos da IL-2 serão avaliados pelo monitoramento em números/frequências de células T reguladoras assim como na expressão de CD25 em Treg. O resultado indicará se a absorção de IL-2 e (i) os níveis séricos de IL-2 são aumentados, (ii) e/ou números/frequências de Treg são aumentados, (iii) e/ou a expressão de molécula CD25 detectada pela intensidade fluorescente média do manchamento com o uso da citometria de fluxo é aumentada, quando a IL-2 é administrada em combinação com um carreador de VSP em comparação à administração da IL-2 sozinha sem um carreador de VSP.

Exemplo 10 Proteção de interleucina 10 (IL-10) in vitro e in vivo em combinação com um carreador de VSP

[00233] A interleucina-10 (IL-10 ou IL10), também conhecida como fator de inibição de síntese de citocina humana (CSIF), é uma citocina anti-inflamatória. Em humanos, a IL-10 é codificada pelo gene IL10. A IL-10 é capaz de inibir a síntese de citocinas pró-inflamatórias tais como IFN-y, IL-2, IL-3, TNFα e GM-CSF feitas por células tais como macrófagos e células T regulatórias. A mesma também exibe uma potente habilidade de suprimir a capacidade de apresentação de antígeno de células que apresentam antígeno. Entretanto, a mesma também é estimulante para determinadas células T e mastócitos e estimula a maturação celular B e a produção de anticorpos.

[00234] Para avaliar in V7ÉT<9 a capacidade de carreadores VSP de proteger a IL-10 de degradação, a capacidade de um carreador de VSP (porexemplo, VSP1267 recombinante) de proteger a IL-10 humana de condições similares àquelas presentes no GIT foi avaliada. A capacidade da VSP de proteger a IL-10 de degradação causada por pHs extremos ou por proteólise enzimática (por exemplo, por tripsina e/ou pancreatina) foi ensaiada com o uso dos métodos descritos nos exemplos acima.

[00235] A IL-10 sozinha ou misturada com o carreador de VSP foi incubada em diferentes pHs ou com diferentes concentrações de enzimas proteolíticas tais como tripsina. A presença de IL-10 após os testes de pH e de enzima proteolítica foi detectada com o uso de manchamento por Coomassie Blue de géis SDS-PAGE. Resultados experimentais mostraram que a combinação de um carreador de VSP com IL-10 aumentou a resistência de IL-10 à degradação por proteólise e induzida por pH (Figura 15 A C). Esses resultados mostraram que IL-10 e IL-2 (discutidos no exemplo anterior) na presença de VSP são resistentes ao baixo pH e à ação proteolítica de tripsina. Por exemplo, nenhuma das duas interleucinas testadas digeridas por tripsina, mesmo a razões de 1:10 ou degradadas após incubação a pH 2. Isso é consistente com a observação de que carreadores VSP podem proteger outros peptídeos bioativos, tais como insulina LANTUS™. Portanto, a combinação de VSPs com interleucinas, porexemplo, IL-2 ou IL-10, poderia facilitar a absorção intestinal das mesmas e os efeitos sistemáticos das mesmas.

[00236] Ensaios //7 wto para determinar se a administração oral de IL-10 em combinação com um carreador de VSP protege a IL-10 das condições no GIT e resulta em absorção aumentada em relação à IL-10 administrada oralmente sem um carreador de VSP serão realizados com o uso dos métodos descritos nos exemplos anteriores. Porexemplo, níveis séricos de IL-10 serão medidos em diferentes momentos após a administração oral de IL- 10 (sozinha ou em combinação com um carreador de VSP) a camundongos em diferentes doses e razões de IL-10/VSP. Os resultados indicarão se a absorção de IL-10 e os níveis séricos de IL-10 são aumentados quando IL-10 é administrada em combinação com um carreador de VSP em comparação à administração oral de IL-10 sozinha sem um carreador de VSP.

Exemplo 11 Proteção de glucagon in vitro e in emem combinação com um carreador de VSP

[00237] O glucagon, um hormônio peptídico secretado pelo pâncreas, aumenta os níveis de glicose sanguínea. O efeito do mesmo é oposto ao da insulina, que diminui os níveis de glicose sanguínea. O glucagon é um polipeptídeo de 29 aminoácidos. A estrutura primária do mesmo em humanos é HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT (SEQ ID NO:6). O polipeptídeo tem um peso molecular de 3,485 daltons. A administração de glucagon é um primeiro socorro vital em casos de hipoglicemia severa quando a vítima está inconsciente ou que por outras razões não possam tomar glicose oralmente. O glucagon é dado por meio de injeção intramuscular, intravenosa ou subcutânea e rapidamente aumenta os níveis de glicose sanguínea. O processo de reconstituição torna o uso de glucagon incômodo (Meeran et a/., Endocrinology 140(1):244 a 50 (1999); Longuet et al., Cell Metab. 8(5):359 a 71 (2008)).

[00238] Para avaliar in vitro a capacidade de carreadores VSP de proteger o glucagon de degradação, a capacidade de um carreador de VSP exemplo, VSP1267 recombinante) de proteger glucagon humano de condições similares àquelas presentes no GIT foi avaliada. A capacidade do VSP de proteger glucagon de degradação causada por proteólise enzimática por tripsina foi ensaiada com o uso dos métodos descritos nos exemplos acima.

[00239] O glucagon (1 μg) sozinho ou misturado com carreador de VSP foi incubado por 1 hora a 37 °C em diferentes pHs ou com diferentes concentrações de enzimas proteolíticas tais como tripsina a 37 °C (Figura 13A). A reação foi parada pela adição de um coquetel inibidor de protease sem EDTA (Diagnóstico Roche sem EDTA COMPLETE™). A presença de glucagon após testes de pH e de enzima proteolítica foi detectada com o uso de um anticorpo monoclonal anti-glucagon. Resultados experimentais mostraram que a combinação de um carreador de VSP com glucagon aumentou a resistência do glucagon à proteólise de tripsina e à degradação induzida por pH. O painel da Figura 13A mostra uma análise dot blot que demonstra a sensibilidade de glucagon à ação de tripsina. O painel inferior da Figura 13A mostra que combinar um carreador de VSP com glucagon a uma razão de 1:3 de glucagon para VSP protegeu o glucagon da degradação por tripsina em uma razão de até 1:2 (proteína:protease). O dot blot mostra pares de amostra nos quais amostras de glucagon sem um carreador de VSP ou com um carreador de VSP a uma razão de 1:3 de glucagon para carreador de VSP foram sujeitadas às mesmas concentrações de tripsina.

[00240] O glucagon usado nesses ensaios foi um hormônio de polipeptídeo recombinante (r-Glucagon, Lilly) comercializado por Eli Lilly Co. Um estudo anterior realizado com o uso do software Peptide Cutter (disponível em web.expasy.org/cgi- bin/peptide_cutter/peptidecutter.pl) indicou que o glucagon foi muito sensível à ação da tripsina de protease, conforme mostrado na Figura 13A. Experimentos preliminares também demonstraram que o anti-glucagon de anticorpo monoclonal (Sigma-Aldrich Cat. No. G2654 está apto a detectar 1 μg de glucagon por dot blot).

[00241] A Figura 13B mostra que o VSP promove a ação biológica de glucagon quando glucagon é coadministrado oralmente. O efeito da administração oral de glucagon foi avaliado em camundongos BALC/c de 7 semanas de idade, que foram deixados sem alimentação por 2 horas e, então, recebida as doses indicadas de glucagon sozinho ou combinado com VSP. Os níveis de glicose sanguínea foram determinados nos momentos indicados. A combinação de 50 μg de glucagon com VSPs (150 μg) parece aumentar a ação biológica de glucagon quando o mesmo é administrado oralmente, em relação à administração oral de glucagon sozinho. Além disso, a partir do teste in iz/i/o é perceptível que os animais que receberam uma administração oral de glucagon mais VSP os próprios níveis de glicose aumentaram mais rapidamente (15 minutos) em relação aos animais com inoculação subcutânea (S.C) (30 minutos) e o efeito do grupo glucagon-VSP oral foi mantido na maior parte do tempo em relação ao grupo s.c.

[00242] Ensaios in para determinar se a administração oral de glucagon em combinação com um carreador de VSP protege o glucagon das condições no GIT e resulta na absorção aumentada em relação ao glucagon administrado oralmente sem um carreador de VSP foram realizados com o uso dos métodos descritos nos exemplos anteriores. Os níveis séricos de glucagon foram medidos em diferentes momentos após a administração oral de glucagon (sozinho ou em combinação com um carreador de VSP) a camundongos em diferentes doses e razões de glucagon/VSP (Figura 13B).

[00243] Em particular, o efeito da administração oral de glucagon foi avaliado em camundongos BALC/c de 7 semanas de idade, que foram deixados sem alimentação por 2 horas e, então, receberam as doses indicadas de glucagon sozinho ou combinado com VSP. Os níveis de glicose sanguínea foram determinados nos momentos indicados. A combinação de 50 μg de glucagon com VSPs (150 μg) pareceram aumentar a ação biológica de glucagon quando o mesmo foi administrado oralmente, em relação à administração oral de glucagon sozinho. Além disso, a partir do teste /ft iz/Vofoi perceptível que os animais que receberam uma administração oral de glucagon mais VSP observaram os níveis de glicose dos mesmos aumentarem mais rapidamente (15 minutos) em relação aos animais que foram submetidos à inoculação subcutânea (S.C) (30 minutos). O efeito observado no grupo que recebe glucagon-VSP oralmente foi mantido por uma quantidade maior de tempo em relação ao grupo que recebe a composição de modo subcutâneo.

Exemplo 12 Entrega de fármacos em pequenas moléculas de baixa solubilidade em combinação com carreadores de VSP

[00244] Para avaliar /ft //fto a capacidade de carreadores VSP de entregar efetivamente agentes terapêuticos de baixa solubilidade (porexemplo, fármacos em pequenas moléculas de baixa solubilidade tais como glipizida, um fármaco antidiabético BCS de classe II com baixa solubilidade em água; amicacina, um antibiótico aminoglicosídeo; ou vancomicina, um antibiótico glicopeptídico), a capacidade de um carreador de VSP (por exemplo, VSP1267 recombinante) de proteger o agente terapêutico de baixa solubilidade de condições similares àquelas presentes no GIT serão avaliadas primeiro. A capacidade da VSP de proteger o agente terapêutico de baixa solubilidade da degradação causada por pHs extremos será ensaiada com o uso de métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, o agente terapêutico em combinação com um carreador de VSP será sujeitado a níveis de pH similares àqueles presentes no GIT e a degradação do fármaco será monitorada com o uso de métodos de espectrometria ou cromatografia em massa tais como HPLC. Adicionalmente, a capacidade da VSP de solubilizar o terapêutico pode ser medida por métodos conhecidos na técnica. Resultados experimentais mostrarão se a combinação de um carreador de VSP com o agente terapêutico de baixa solubilidade aumenta a solubilidade do agente terapêutico sendo que protege o mesmo da degradação por condições similares àquelas presentes no GIT.

[00245] Ensaios in vivo para determinar se a administração oral do agente terapêutico de baixa solubilidade em combinação com um carreador de VSP mantém efetivamente o agente terapêutico na solução, protege o agente terapêutico das condições no GIT e resulta na absorção aumentada em relação ao agente terapêutico administrado sem um carreador de VSP serão realizados com o uso dos métodos descritos nos exemplos anteriores e métodos conhecidos na técnica. Os resultados indicarão se a combinação do agente terapêutico com uma VSP pode manter o agente terapêutico na solução, proteger das condições no GIT e aumentar a absorção do agente terapêutico e os níveis séricos do mesmo em comparação à administração oral do agente terapêutico de baixa solubilidade sozinho sem um carreador de VSP.

Exemplo 13 Domínios similares à VSP presentes em outros organismos possuem as mesmas propriedades que as VSPs de giardia.

[00246] O alinhamento da sequência do domínio extracelular da VSP1267 de G/a/P/a, usada no presente documento como um carreador exemplificativo VSP, com outras sequências de moléculas similares a VSP levou à identificação de múltiplos motivos CXXC em proteínas pertencentes às espécies Paramecium, Tetrahymena, Entamoeba, entre outras. Assim, fragmentos representativos de sequências primárias de quinasses de superfície de Entamoeba sp, e proteínas de superfície de Paramecium sp. e Tetrahymena sp. predizem um domínio conservado que contém motivos CXXC em uma arquitetura similar à VSP como responsáveis para a resistência ao pH, à temperatura e digestão proteolítica.

[00247] Para determinar se a proteína similar à VSPs retém as propriedades de VSP de domínio extracelular G/srP/s e pode ser usada, consequentemente, como carreadores VSP ou como componentes de proteínas VSP quiméricas, um fragmento de DNA de proteína similar à VSP TeÉraPy/ne/ra thermophiia que codifica um domínio VSP (proteína hipotética TTHERM_00826790; SEQ ID NO: 590) foi modificado com o uso de técnicas padrão de biologia molecular para gerar um VSP quimérico. A proteína de VSP quimérico (SEQ ID NO: 589) composta de sequências que codificam o peptídeo de sinal (SEQ ID NO: 591) de VSP1267 eiuma ititeutiaads e uma etiqueta de purificação His6 fundida respectivamente à terminação amino e à terminação carbóxi da sequência de um domínio VSP (SEQ ID NO: 592) localizado entre posições de aminoácidos 977 e 1465 da proteína similar à VSP proveniente de Tetrahymena (SEQ ID NO: 590). A sequência do VSP quimérico resultante é mostrada na Figura 14A.

[00248] O VSP quimérico foi clonado em um bacmid para expressão em células de inseto Sf9. Uma vez expressadas e secretadas ao sobrenadante de cultura, a proteína de VSP quimérico foi purificada em uma coluna de níquel conforme descrito no Exemplo 2.

[00249] A proteína de VSP quimérico foi usada para verificar a estabilidade de hGH à sensibilidade ao pH e à tripsina. A Figura 14B mostra a atividade de concentração diferente de tripsina em hGH recombinante, conforme foi detectado por Western blotting com o uso do anticorpo monoclonal anti-hGH. Uma razão de hormônio:protease de 1:25 mostrou os melhores resultados para determinar pH e degradação proteolítica.

[00250] A Figura 14C mostra que a combinação de hGH com a proteína de VSP quimérico derivado de fragmentos de T. thermophiia e G. intestinaiisfoi capaz de proteger o hGH de degradação em pH baixo e tripsina, conforme demonstrado em um manchamento Coomassie Blue após SDS-PAGE e Western blotting com o uso de um anticorpo monoclonal anti-hGH.

[00251] Esses resultados indicaram, por exemplo, que: (a) polipeptídios que contém múltiplos motivos CXXC provenientes de espécies que não sejam Giardia possuem a capacidade de proteger peptídeos de degradação por pH baixo e/ou atividade de protease, que pode favorecer a absorção no intestino de mamíferos; (b) é possível gerar carreadores VSP pelo uso de um fragmento proveniente de ia proteína mais larga que compreende um ou vários domínios VSP; (c) é possível gerar carreadores VSP pela combinação de fragmentos provenientes de duas proteínas VSP diferentes, nesse caso, a sequência de sinal proveniente de uma proteína VSP e um domínio VSP proveniente de uma proteína similar à VSP; (d) é possível gerar carreadores VSP pela combinação de fragmentos provenientes de proteínas provenientes de dois organismos diferentes, nesse caso, uma sequência proveniente de Giardia intestinaiis e uma sequência proveniente de Tetrahymena ttiermophila-, (e) é possível gerar carreadores VSP com o uso de proteínas VSP que podem ser grandes demais para uma expressão recombinante bem sucedida (por exemplo, a proteína TTHERM_00826790 com 2,192 aminoácidos de comprimento) pela excisão de uma porção da proteína VSP mais larga que contém um domínio de VSP identificado por computador (por exemplo, o fragmento de domínio de VSP de 489 aminoácidos de comprimento usado no instante exemplo).

[00252] A presente invenção foi descrita acima com a ajuda de blocos de construção funcionais que ilustram a implantação de funções especificadas e as relações das mesmas. Os limites desses blocos de construção funcionais foram definidos arbitrariamente no presente documento para conveniência da descrição. Limites alternativos podem ser definidos contanto que as funções e relações especificadas dos mesmos sejam apropriadamente realizadas.

[00253] A descrição supracitada das modalidades específicas revelará tão completamente a natureza geral da invenção de modo que outros possam, aplicando-se o conhecimento dentro da habilidade da técnica, prontamente modificar e/ou adaptar para várias aplicações tais modalidades específicas, sem experimentação indevida, sem sair do conceito geral da presente invenção. Portanto, tais adaptações e modificações são destinadas para estarem dentro do significado e da faixa de equivalentes das modalidades reveladas, com base no ensinamento e na orientação apresentados no presente documento. Deve-se entender que a fraseologia ou terminologia no presente documento é para o propósito de descrição e não de limitação, de modo que a terminologia ou fraseologia do presente relatório descritivo deva ser interpretada pelo versado na técnica à luz dos ensinamentos e orientação.

[00254] A amplitude e o escopo da presente invenção não devem ser limitados por qualquer uma das modalidades exemplificativas descritas acima, mas devem ser definidos apenas de acordo com as reivindicações a seguir e suas equivalentes.

Claims

1. Composição terapêutica compreendendo um carreador de proteína de superfície variável (VSP) e um agente terapêutico, caracterizada por o dito agente terapêutico ser um agente biológico, em que o dito agente biológico é um peptídeo bioativo, em que o dito peptídeo bioativo é selecionado a partir do grupo que consiste em insulina, hormônio de crescimento humano, glucagon, e uma combinação de dois ou mais dos ditos peptídeos bioativos; em que que o carreador VSP de Giardia e apresenta em sua porção extracelular 2 a 40 motivos CXXC, em que C representa cisteína e X representa qualquer aminoácido, separados entre si por 3 a 20 aminoácidos, sendo que dito carreador VSP é ligado ao dito agente terapêutico através de (i) uma ligação covalente não peptídica ou (ii) uma ligação não covalente.

2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por ser formulada para administração oral ou mucosa.

3. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o carreador de VSP compreender a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

4. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o carreador de VSP consistir na sequência de SEQ ID NO: 1.

5. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o peptídeo bioativo ser selecionado a partir de insulina natural e insulina recombinante.

6. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a razão de molécula para molécula do carreador de VSP para agente terapêutico variar de 10:1 a 1:10.

7. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por ser para uso como um medicamento.

8. Composição, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada por ser para uso no tratamento de deficiência hormonal.

9. Composição, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada por dita deficiência hormonal ser uma deficiência insulínica, quando o dito agente terapêutico é insulina.

10. Composição, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada por dita deficiência insulínica ser diabetes tipo 1.