CN104988093B - 一种获得干酪发酵剂的菌株的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种获得干酪发酵剂的菌株的方法。其包括以下步骤：将乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)接种于含有氯化钠、pH4～5的脱脂乳培养基培养；将菌株接种于分别在脱脂乳培养基中不同的培养条件下培养，选择满足一定活菌总数数目的菌株即乳酸乳球菌菌株类Ⅰ；将乳酸乳球菌菌株类Ⅰ培养至凝乳，选择凝乳状态正常且OD660≥0.7的乳酸乳球菌菌株A；将肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)接种于脱脂乳培养基中培养，选择凝乳状态正常且香味浓郁的肠膜明串珠菌菌株B；将菌株A和菌株B共同培养即可。所述方法重复性高，实用价值高，有很大的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及乳制品领域，具体涉及一种获得干酪发酵剂的菌株的方法。
背景技术
干酪，又名奶酪，有各式各样的味道、口感和形式。干酪以奶类为原料，含有丰富的蛋白质和脂质，具有很高的营养价值。随着我国人民生活水平的提高，对干酪的需求量越来越多。在干酪生产和成熟过程中微生物菌群起着重要的作用，促进了产品的质构和风味的形成。干酪的干酪发酵剂对干酪质构和特征风味的形成起了极其重要的作用。干酪发酵剂在干酪生产过程中产酸，能够提高凝乳酶的活性，有助于排除乳清、抑制有害细菌生长，并产生各种酶参与干酪特征风味与质构的形成。
大多数干酪的生产需要在凝乳前添加不同种类的乳酸乳球菌(Lactic acidbacteria,LAB)，它们的主要作用是在干酪制作过程中产酸，干酪生产过程中一个关键点即为乳酸乳球菌乳糖代谢为乳酸，其酸化的速度和程度影响凝乳的效果和干酪得率并影响凝乳酶的活性。LAB有时也能够产生乙酸、乙醛和双乙酰等风味物质。发酵剂一般可以分为两类，嗜温性发酵剂(即最适温度为30℃)和嗜热性发酵剂(即最适温度为42℃)。嗜温性发酵剂中通常包含乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)和明串珠菌(Leuconostoc spp.)等，嗜热性发酵剂通常包括嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)和保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)等。现今使用的大部分发酵剂直接由凝乳再次培养而得，而这些凝乳本身是经过长期的大规模优质干酪的生产实践中挑选出来的，通常含有2～6株菌，所以在某种程度上，目前大部分的发酵剂可被称为混合发酵剂。国内在发酵剂方面的研究主要集中于适用于酸奶的嗜热性发酵剂。
目前，国内对嗜温新的发酵剂研究很少，主要热衷于酸奶发酵剂(主要是嗜热性乳酸乳球菌)的筛选及制备的研究，而对可用于干酪生产的嗜温性乳酸乳球菌的筛选研究较少，对于干酪用菌体系的筛选标准及方法更是空白。因此，利用中国丰富的菌种资源开发适用于全新的干酪发酵剂的发酵菌株具有重要意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，针对目前缺乏难以将快速产酸型干酪发酵剂和产香型干酪发酵剂有效结合以制备出应用于干酪制备的干酪发酵剂的不足，提供一种获得干酪发酵剂的菌株的方法，所述的方法简便易行的、重复性高，能够选择出合适的、能够共生的乳酸乳球菌菌株和明串珠菌，从而用于结合快速产酸和产香型的干酪发酵剂的制备中。
本发明提供一种获得干酪发酵剂的菌株的方法，其包括以下的步骤：
(1)、将活化的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)接种于含有3～5％氯化钠、pH4～5的10～12％脱脂乳培养基中，28～35℃培养12～20小时得培养液a，通过平板计数法选择活菌总数a≥106cfu/mL的菌株，所述百分比为质量百分比；
(2)、将步骤(1)获得的菌株接种于10％～12％脱脂乳培养基中，分别在13～16℃培养12～20小时，得培养液b；28～32℃培养12～20小时，得培养液c；在28～32℃培养12～16小时后39～41℃水浴2小时，得培养液d；通过平板计数法选择培养液b中活菌总数b≥105cfu/mL、培养液c中活菌总数c≥107cfu/mL；且培养液d中106cfu/mL≥活菌总数d≥104cfu/mL的菌株，即乳酸乳球菌菌株类Ⅰ，所述百分比为质量百分比；
将所述乳酸乳球菌菌株类Ⅰ在10～12％脱脂乳培养基中28～32℃培养24小时，得培养液e，选择pH值低于4.8、培养9～24小时后凝乳且光密度值OD660≥0.7的培养液e所对应的菌株为乳酸乳球菌菌株A；
(3)、将活化的肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)接种于10～12％脱脂乳培养基中，28～35℃培养24～36小时后，选择凝乳且香味浓郁的肠膜明串珠菌菌株B，所述百分比为质量百分比；
(4)、将步骤(2)所得的乳酸乳球菌菌株A和步骤(3)所得的肠膜明串珠菌菌株B共同接种于10～12％脱脂乳培养基中，28～32℃培养至凝乳得发酵液f，选择满足以下条件的所述发酵液f：所述发酵液f的pH值低于相同条件下单独培养所述乳酸乳球菌菌株A和所述肠膜明串珠菌菌株B所得的发酵液的pH值，且所述发酵液f的光密度值OD600高于相同条件下单独培养所述乳酸乳球菌菌株A和所述肠膜明串珠菌菌株B所得的发酵液的光密度值OD600，所选择的所述发酵液f所对应的菌株即为用于干酪发酵剂的菌株。
所述的乳酸乳球菌为本领域常规的乳酸乳球菌，较佳地为乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcuslactissubsp.lactis)。
步骤(1)为：将活化的乳酸乳球菌接种于含有3～5％氯化钠、pH4～5的10～12％脱脂乳培养基中，28～35℃培养12～20小时得培养液a，通过平板计数法选择活菌总数a≥106cfu/mL的菌株，所述百分比为质量百分比。其中，所述的活化为本领域常规的活化，较佳地，其包括以下的步骤：将所述的菌株接种于活化培养基28～32℃培养16～32小时即可。所述的接种的接种量为本领域常规的接种量，较佳地为1～2％，所述百分比为体积百分比。所述的活化培养基为本领域常规的培养基，能够使乳酸乳球菌活化即可，较佳地为M17肉汤培养基。所述氯化钠的含量为3～5％，较佳地为4～4.5％，所述百分比为质量百分比。所述pH为4～5，较佳地为4.5～5。所述培养的温度为28～35℃，更佳地为28～32℃。所述培养的时间为12～20小时，更佳地为12～16小时。所述脱脂乳培养基由脱脂乳粉溶解于水中混合得到，所述百分比为所述脱脂乳粉占所述脱脂乳粉和所述水总质量的质量百分比。所述平板计数的培养基为本领域常规，较佳地为平板计数琼脂培养基(PCA)，所述PCA的成分和配制方法参见GB4789.2-2010。所述平板计数中培养的温度为本领域常规的温度，较佳地为36～38℃。所述平板计数中培养的时间为本领域常规的时间，较佳地为48小时。所述平板计数的方法为本领域常规的方法，较佳地参见GB4789.2-2010。
步骤(2)为：将步骤(1)获得的菌株接种于10％～12％脱脂乳培养基中，分别在13～16℃培养12～20小时，得培养液b；28～32℃培养12～20小时，得培养液c；在28～32℃培养12～16小时后39～41℃水浴2小时，得培养液d；通过平板计数法选择培养液b中活菌总数b≥105cfu/mL、培养液c中活菌总数c≥107cfu/mL；且培养液d中106cfu/mL≥活菌总数d≥104cfu/mL的菌株，即乳酸乳球菌菌株类Ⅰ，所述百分比为质量百分比；将所述乳酸乳球菌菌株类Ⅰ在10～12％脱脂乳培养基中28～32℃培养24小时，得培养液e，选择pH值低于4.8、培养9～24小时后凝乳且光密度值OD660≥0.7的培养液e所对应的菌株为乳酸乳球菌菌株A。
其中，所述的接种的接种量为本领域常规的接种量，较佳地1～2％，所述百分比为体积百分比。所述平板计数的培养基为本领域常规，较佳地为平板计数琼脂培养基(PCA)，所述PCA的成分和配制方法参见GB4789.2-2010。所述平板计数中培养的温度为本领域常规的温度，较佳地为36～38℃。所述平板计数中培养的时间为本领域常规的时间，较佳地为48小时。所述平板计数的方法为本领域常规的方法，较佳地参见GB4789.2-2010。较佳地，选择pH值低于4.8、培养9～24小时后凝乳、具有新鲜酸味、无异味且光密度值OD660≥0.7的培养液e所对应的菌株为乳酸乳球菌菌株A。
步骤(3)为：将活化的肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)接种于10～12％脱脂乳培养基中，28～35℃培养24～36小时后，选择凝乳且香味浓郁的肠膜明串珠菌菌株B，所述百分比为质量百分比。其中，所述的活化为本领域常规的活化，较佳地，其包括以下的步骤：将所述的菌株接种于活化培养基28～32℃培养16～32小时即可。所述的接种的接种量为本领域常规的接种量，较佳地为1～2％，所述百分比为体积百分比。所述的活化培养基为本领域常规的培养基，能够使乳酸乳球菌活化即可，较佳地为添加4～5％蔗糖的M17肉汤培养基，所述的百分比为质量百分比。所述培养的温度为28～35℃，较佳地为28～32℃。
步骤(4)为：将步骤(2)所得的乳酸乳球菌菌株A和步骤(3)所得的肠膜明串珠菌菌株B共同接种于10～12％脱脂乳培养基中，28～32℃培养至凝乳得发酵液f，选择满足以下条件的所述发酵液f：所述发酵液f的pH值低于相同条件下单独培养所述乳酸乳球菌菌株A和所述肠膜明串珠菌菌株B所得的发酵液的pH值，且所述发酵液f的光密度值OD600高于相同条件下单独培养所述乳酸乳球菌菌株A和所述肠膜明串珠菌菌株B所得的发酵液的光密度值OD600，所选择的所述发酵液f对应的菌株即为用于干酪发酵剂的菌株。其中，所述的接种的接种量为本领域常规的接种量，较佳地为1～2％，所述百分比为体积百分比。
根据本发明，步骤(1)所述培养液a中的菌株在平板计数琼脂培养基上的菌落形态为：菌落呈乳白色，菌落较小，圆形凸起，有光泽，菌体卵圆形。之后迅速生长，2天后菌落大而紧密，呈乳白色略带黄色。说明其能够在干酪成熟环境下生长良好。而满足步骤(2)所述的活菌总数条件则能够证明乳酸乳球菌菌株在制备过程中各个步骤的不同温度要求下均满足生长良好的要求，从而发挥干酪发酵剂的作用。
根据本发明，步骤(2)乳酸乳球菌菌株A和步骤(3)所得的肠膜明串珠菌菌株B均非某一种特定的菌株，并且乳酸乳球菌菌株A和肠膜明串珠菌菌株B能够通过培养基的配制和发酵获得，重复性好，具有很高的实用性。
根据本发明，步骤(4)的生长良好的乳酸乳球菌菌株和肠膜明串珠菌菌株，能够在干酪成熟环境下良好生长，其中乳酸乳球菌菌株有优良的产酸能力和产黏能力，而肠膜明串珠菌菌株有优异的产香能力，两者的组合中菌株之间具有良好的互生作用，能够比单独生长时产酸速度更快、菌株生长量更高，因此可以用于干酪发酵剂的生产，尤其是干酪发酵剂的生产。
本发明所述的方法可操作性强，重复性好。利用本发明所述的方法将保存的41株乳酸乳球菌和47株肠膜明串珠菌进行了检测，获得了适合制备干酪用干酪发酵剂的5株乳酸乳球菌和3株肠膜明串珠菌，说明所述的方法能够重复性地、多次地根据不同的样品和待测菌株选择得到干酪发酵剂的合适菌株。
本发明提供一种获得干酪发酵剂的乳酸乳球菌菌株的方法，其包括以下的步骤：
(1)、将活化的乳酸乳球菌接种于含有3～5％氯化钠、pH4～5的10～12％脱脂乳培养基中，28～35℃培养12～20小时得培养液a，通过平板计数法选择活菌总数a≥106cfu/mL的菌株，所述百分比为质量百分比；
(2)、将步骤(1)获得的菌株接种于10％～12％脱脂乳培养基中，分别在13～16℃培养12～20小时，得培养液b；28～32℃培养12～20小时，得培养液c；在28～32℃培养12～16小时后39～41℃水浴2小时，得培养液d；通过平板计数法选择培养液b中活菌总数b≥105cfu/mL、培养液c中活菌总数c≥107cfu/mL；且培养液d中106cfu/mL≥活菌总数d≥104cfu/mL的菌株，即乳酸乳球菌菌株类Ⅰ，所述百分比为质量百分比；
将所述乳酸乳球菌菌株类Ⅰ在10～12％脱脂乳培养基中28～32℃培养24小时，得培养液e，选择pH值低于4.8、培养9～24小时后凝乳且光密度值OD660≥0.7的培养液e所对应的菌株生产干酪发酵剂的乳酸乳球菌菌株。
本发明所述方法的选择合适的乳酸乳球菌产酸速度快，18小时内，所选择的乳酸乳球菌可在28～35℃的脱脂乳中发酵产酸至pH4.7；凝乳速度快，最快9小时即可凝乳。
本发明提供一种获得干酪发酵剂的肠膜明串珠菌菌株的方法，其包括以下的步骤：将活化的肠膜明串珠菌接种于10％脱脂乳培养基中，28～35℃培养24～36小时后，选择凝乳状态正常，香味浓郁的肠膜明串珠菌菌株B，所述百分比为质量百分比。
所述方法获得的明串珠菌产香优良，香味浓郁、凝乳状态正常，并且可以与乳酸乳球菌在脱脂乳培养基中发酵共生。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：本发明所述的方法能够简便快捷、重复性高地获得能够在干酪成熟环境下良好生长的乳酸乳球菌菌株和肠膜明串珠菌菌株，利用本发明所述方法所选择的乳酸乳球菌菌株有优良的产酸能力或产黏能力，肠膜明串珠菌菌株有优异的产香能力，两者的组合中菌株之间具有良好的互生作用，因此可以用于干酪发酵剂的生产，尤其是干酪用干酪发酵剂的生产。同时，所述的方法通过配制培养基、设定一些发酵条件的参数就能达到选择合适菌株的目的，重复性高，具有较高的实用价值。由此可见，所述的方法在工业化制备发酵剂，尤其是干酪发酵剂，有很大的应用价值。
生物材料保藏信息
本发明的乳酸乳球菌乳酸亚种BD164，已于2015年4月27日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏编号为：CGMCC No.10751，培养物名称是BD164，分类命名是乳酸乳球菌乳酸亚种Lactococcus lactis subsp.lactis。
本发明的乳酸乳球菌乳酸亚种BD401，已于2015年4月27日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏编号为：CGMCC No.10752，培养物名称是BD401，分类命名是乳酸乳球菌乳酸亚种Lactococcus lactis subsp.lactis。
本发明的乳酸乳球菌乳酸亚种BD2263，已于2015年4月27保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏编号为：CGMCC No.10749，培养物名称是BD2263，分类命名是乳酸乳球菌乳酸亚种Lactococcus lactis subsp.lactis。
本发明的乳酸乳球菌乳酸亚种BD3170，已于2015年4月27保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏编号为：CGMCC No.10748，培养物名称是BD3170，分类命名是乳酸乳球菌乳酸亚种Lactococcus lactis subsp.lactis。
本发明的肠膜明串珠菌LM79，已于2015年4月27日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏编号为：CGMCC No.10750，培养物名称是LM79，分类命名是肠膜明串珠菌Leuconostoc mesenteroides。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
从各地收集牛乳、乳制品和牧区健康儿童粪便等样品，以无菌方式取1mL，用无菌生理盐水系列稀释，通过涂布的方式将稀释液均匀涂布于固体TYC培养基上，30℃培养48小时。选取乳白色、菌落较小、圆形凸起、有光泽，菌体呈卵圆的单菌落多个，分别转接到新的固体TYC培养基上，得到纯化的乳酸乳球菌菌落，保存在冻存管中，共41株。
从各地收集牛乳、乳制品和牧区健康儿童粪便等样品，以无菌方式取1mL，用无菌生理盐水系列稀释，通过涂布的方式将稀释液均匀涂布于固体TYC培养基上，30℃培养48小时。选取菌落初呈透明状，菌落较小，2d后菌落大呈透明状且具有流动性的单菌落多个，分别转接到新的固体TYC培养基上，得到纯化的肠膜明串珠菌菌落，保存在冻存管中，共47株。
实施例1乳酸乳球菌菌株的获得(BD3170)
(1)、活化：将保存的41株乳酸乳球菌从冻存管中取出，以2％(v/v)的接种量接种于经过了121℃、15分钟灭菌的M17肉汤培养基中(购自英国OXOID公司)30℃培养30小时，连续培养三代，获得活化的菌种。
(2)、模拟干酪成熟环境选择：将步骤(1)所得的活化的菌种以2％(v/v)的接种量接种于含有4％氯化钠、pH5的10％脱脂乳培养基(脱脂乳粉购自新西兰Westland合作乳业有限公司，将脱脂乳粉溶解于水中混合即得脱脂乳培养基，所述百分比为所述脱脂乳粉占所述脱脂乳粉和所述水总质量的质量百分比)中，所述百分比为质量百分比；30℃培养16小时得培养液。将培养液按照GB4789.2-2010所述的步骤方法处理后，37℃培养48小时。
48小时后，通过平板计数法测定，活菌总数106≥cfu/mL
(3)、不同温度环境的选择：
b)将步骤(2)所得的生长良好的菌株以2％(v/v)的接种量接种于未添加氯化钠、未调节pH的10％脱脂乳培养基的三角瓶中，15℃培养16小时，得培养液b，所述百分比为质量百分比；
c)将步骤(2)所得的生长良好的菌株以2％(v/v)的接种量接种于未添加氯化钠、未调节pH的10％脱脂乳培养基的三角瓶中，30℃培养16小时，得培养液c，所述百分比为质量百分比；
d)将步骤(2)所得的生长良好的菌株以2％(v/v)的接种量接种于未添加氯化钠、未调节pH的10％脱脂乳培养基的三角瓶中，30℃培养14小时后，于40℃水浴2小时，得培养液d，所述百分比为质量百分比。
将培养液b、培养液c和培养液d将培养液按照GB4789.2-2010所述的步骤方法处理后，37℃培养48小时。
48小时后，通过平板计数法测定b)、c)和d)处理后菌株的生长状况。选择满足b)中活菌总数达到≥105cfu/mL、c)中活菌总数达到≥107cfu/mL且106cfu/mL≥d)中活菌总数达到≥104cfu/mL条件的菌株。
(4)、将满足上述条件的菌株，进行如下的实验：
(一)、按2％(v/v)的接种量接种于装有灭菌的10％脱脂乳培养基的三角瓶中，置于30℃恒温培养箱培养得发酵液，每3小时取出一支三角瓶，24小时后测发酵液的pH值，所述百分比为质量百分比。
(二)、按2％(v/v)的接种量接种于装有灭菌的10％脱脂乳培养基的三角瓶中，置于30℃恒温培养箱培养，直至其凝乳，4℃环境下保持24小时。凝乳后用旋转黏度计(购自德国proRheo公司)分别测定各发酵酸乳的黏度(m·Pa/s)。测定时选用2号转子，速度为64r/s。测定时每15s取值一次，测定持续时间为3min，所述百分比为质量百分比。
(三)、按2％(v/v)的接种量接种于装有灭菌的10％脱脂乳培养基的三角瓶中，置于30℃恒温培养箱培养24小时后的悬浮液作为样品。取1mL样品溶液，加入2.5mL 0.28MNaOH溶液，混匀，于25℃左右放置10min。再加入0.75mL福林酚试剂(购自国药试剂)，立即摇匀，于35℃左右反应15min，在660nm下使用紫外分光光度计(购自上海天美科学仪器有限公司)测定样品吸光值OD660，所述百分比为质量百分比。
检测发现，一菌株发酵液的pH仅为4.25，凝乳时间为9小时，样品吸光值OD660为0.9，由此可见，该菌株产酸速度快、凝乳状态正常，蛋白质水解能力强，因此适于发酵制备干酪。将该菌株命名为BD3170，其原始来源为西藏自治区的健康儿童粪便。
将乳酸乳球菌乳酸亚种BD3170于2015年4月27日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，获得保藏编号为：CGMCCNo.10748，培养物名称是乳酸乳球菌乳酸亚种，分类命名是Lactococcuslactissubsp.lactis。
实施例2乳酸乳球菌菌株的获得(BD2263)
(1)、活化：将保存的41株乳酸乳球菌从冻存管中取出，以1％(v/v)的接种量接种于经过了121℃、15分钟灭菌的M17肉汤培养基中(购自英国OXOID公司)28℃培养32小时，连续培养三代，获得活化的菌种。
(2)、模拟干酪成熟环境选择：将步骤(1)所得的活化的菌种以1％(v/v)的接种量接种于含有4.5％氯化钠、pH4.5的12％脱脂乳培养基(脱脂乳粉购自新西兰Westland合作乳业有限公司，将脱脂乳粉溶解于水中混合即得脱脂乳培养基，所述百分比为所述脱脂乳粉占所述脱脂乳粉和所述水总质量的质量百分比)中，所述百分比为质量百分比；28℃培养20小时得培养液。将培养液按照GB4789.2-2010所述的步骤方法处理后，36℃培养48小时。
48小时后，通过平板计数法测定，活菌总数106≥cfu/mL
(3)、不同温度环境的选择：
b)将步骤(2)所得的生长良好的菌株以1％(v/v)的接种量接种于未添加氯化钠、未调节pH的10％脱脂乳培养基的三角瓶中，13℃培养20小时，得培养液b，所述百分比为质量百分比；
c)将步骤(2)所得的生长良好的菌株以1％(v/v)的接种量接种于未添加氯化钠、未调节pH的10％脱脂乳培养基的三角瓶中，28℃培养20小时，得培养液c，所述百分比为质量百分比；
d)将步骤(2)所得的生长良好的菌株以1％(v/v)的接种量接种于未添加氯化钠、未调节pH的10％脱脂乳培养基的三角瓶中，28℃培养16小时后，于41℃水浴2小时，得培养液d，所述百分比为质量百分比。
将培养液b、培养液c和培养液d将培养液按照GB4789.2-2010所述的步骤方法处理后，36℃培养48小时。
48小时后，通过平板计数法测定b)、c)和d)处理后菌株的生长状况。选择满足b)中活菌总数达到≥105cfu/mL、c)中活菌总数达到≥107cfu/mL且106cfu/mL≥d)中活菌总数达到≥104cfu/mL条件的菌株。
(4)、将满足上述条件的菌株，进行如下的实验：
(一)、按1％(v/v)的接种量接种于装有灭菌的12％脱脂乳培养基的三角瓶中，置于28℃恒温培养箱培养得发酵液，每3小时取出一支三角瓶，24小时后测发酵液pH值，所述百分比为质量百分比。
(二)、按1％(v/v)的接种量接种于装有灭菌的12％脱脂乳培养基的三角瓶中，置于28℃恒温培养箱培养，直至其凝乳，4℃环境下保持24小时。凝乳后用旋转黏度计(购自德国proRheo公司)分别测定各发酵酸乳的黏度(m·Pa/s)。测定时选用2号转子，速度为64r/s。测定时每15s取值一次，测定持续时间为3min，所述百分比为质量百分比。
(三)、按1％(v/v)的接种量接种于装有灭菌的10％脱脂乳培养基的三角瓶中，置于28℃恒温培养箱培养24小时后的悬浮液作为样品。取1mL样品溶液，加入2.5mL 0.28MNaOH溶液，混匀，于25℃左右放置10min。再加入0.75mL福林酚试剂(购自国药试剂)，立即摇匀，于35℃左右反应15min，在660nm下使用紫外分光光度计(购自上海天美科学仪器有限公司)测定样品吸光值OD660，所述百分比为质量百分比。
检测发现，一菌株发酵液的pH仅为4.3，凝乳时间为10小时，样品吸光值OD660为0.93，由此可见，该菌株产酸速度快、凝乳状态正常，蛋白质水解能力强。同时对发酵液进行感官评价，该发酵液有酸味且无异味。因此该菌株适于发酵制备干酪，将该菌株命名为BD2263，其原始来源为西藏自治区的生牛乳。
将乳酸乳球菌乳酸亚种BD2263于2015年4月27日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，获得保藏编号为：CGMCCNo.10749，培养物名称是乳酸乳球菌乳酸亚种，分类命名是Lactococcuslactissubsp.lactis。
实施例3乳酸乳球菌菌株的获得(BD164)
(1)、活化：将保存的41株乳酸乳球菌从冻存管中取出，以1％(v/v)的接种量接种于经过了121℃、15分钟灭菌的M17肉汤培养基中(购自英国OXOID公司)32℃培养16小时，连续培养三代，获得活化的菌种。
(2)、模拟干酪成熟环境选择：将步骤(1)所得的活化的菌种以2％(v/v)的接种量接种于含有3％氯化钠、pH4的10％脱脂乳培养基(脱脂乳粉购自新西兰Westland合作乳业有限公司，将脱脂乳粉溶解于水中混合即得脱脂乳培养基，所述百分比为所述脱脂乳粉占所述脱脂乳粉和所述水总质量的质量百分比)中，所述百分比为质量百分比；32℃培养12小时得培养液。将培养液按照GB4789.2-2010所述的步骤方法处理后，38℃培养48小时。
48小时后，通过平板计数法测定，活菌总数106≥cfu/mL
(3)、不同温度环境的选择：
b)将步骤(2)所得的生长良好的菌株以2％(v/v)的接种量接种于未添加氯化钠、未调节pH的10％脱脂乳培养基的三角瓶中，16℃培养12小时，得培养液b，所述百分比为质量百分比；
c)将步骤(2)所得的生长良好的菌株以2％(v/v)的接种量接种于未添加氯化钠、未调节pH的10％脱脂乳培养基的三角瓶中，32℃培养16小时，得培养液c，所述百分比为质量百分比；
d)将步骤(2)所得的生长良好的菌株以2％(v/v)的接种量接种于未添加氯化钠、未调节pH的10％脱脂乳培养基的三角瓶中，32℃培养12小时后，于39℃水浴2小时，得培养液d，所述百分比为质量百分比。
将培养液b、培养液c和培养液d将培养液按照GB4789.2-2010所述的步骤方法处理后，37℃培养48小时。
48小时后，通过平板计数法测定b)、c)和d)处理后菌株的生长状况。选择满足b)中活菌总数达到≥105cfu/mL、c)中活菌总数达到≥107cfu/mL且106cfu/mL≥d)中活菌总数达到≥104cfu/mL条件的菌株。
(4)、将满足上述条件的菌株，进行如下的实验：
(一)、按1％(v/v)的接种量接种于装有灭菌的10％脱脂乳培养基的三角瓶中，置于32℃恒温培养箱培养的发酵液，每3小时取出一支三角瓶，24小时后测发酵液pH值，所述百分比为质量百分比。
(二)、按1％(v/v)的接种量接种于装有灭菌的10％脱脂乳培养基的三角瓶中，置于32℃恒温培养箱培养，直至其凝乳，4℃环境下保持24小时。凝乳后用旋转黏度计(购自德国proRheo公司)分别测定各发酵酸乳的黏度(m·Pa/s)。测定时选用2号转子，速度为64r/s。测定时每15s取值一次，测定持续时间为3min，所述百分比为质量百分比。
(三)、按1％(v/v)的接种量接种于装有灭菌的10％脱脂乳培养基的三角瓶中，置于32℃恒温培养箱培养24小时后的悬浮液作为样品。取1mL样品溶液，加入2.5mL 0.28MNaOH溶液，混匀，于25℃左右放置10min。再加入0.75mL福林酚试剂(购自国药试剂)，立即摇匀，于35℃左右反应15min，在660nm下使用紫外分光光度计(购自上海天美科学仪器有限公司)测定样品吸光值OD660，所述百分比为质量百分比。
检测发现，一菌株发酵液的pH为4.68，凝乳时间为15小时，样品吸光值OD660为0.82，由此可见，该菌株产酸速度较快、凝乳状态正常，蛋白质水解能力强。同时对发酵液进行感官评价，该发酵液有酸味且无异味。因此该菌株适于发酵制备干酪，将该菌株命名为BD164，其原始来源为西藏自治区的奶疙瘩。
将乳酸乳球菌乳酸亚种BD164于2015年4月27日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，获得保藏编号为：CGMCCNo.10751，培养物名称是乳酸乳球菌乳酸亚种，分类命名是Lactococcuslactissubsp.lactis。
实施例4乳酸乳球菌菌株的获得(BD401)
(1)、活化：将保存的41株乳酸乳球菌从冻存管中取出，以2％(v/v)的接种量接种于经过了121℃、15分钟灭菌的M17肉汤培养基中(购自英国OXOID公司)30℃培养25小时，连续培养三代，获得活化的菌种。
(2)、模拟干酪成熟环境选择：将步骤(1)所得的活化的菌种以2％(v/v)的接种量接种于含有5％氯化钠、pH5的10％脱脂乳培养基(脱脂乳粉购自新西兰Westland合作乳业有限公司，将脱脂乳粉溶解于水中混合即得脱脂乳培养基，所述百分比为所述脱脂乳粉占所述脱脂乳粉和所述水总质量的质量百分比)中，所述百分比为质量百分比；32℃培养14小时得培养液。将培养液按照GB4789.2-2010所述的步骤方法处理后，37℃培养48小时。
(3)、不同温度环境的选择：
b)将步骤(2)所得的生长良好的菌株以2％(v/v)的接种量接种于未添加氯化钠、未调节pH的12％脱脂乳培养基的三角瓶中，15℃培养16小时，得培养液b，所述百分比为质量百分比；
c)将步骤(2)所得的生长良好的菌株以2％(v/v)的接种量接种于未添加氯化钠、未调节pH的12％脱脂乳培养基的三角瓶中，30℃培养15小时，得培养液c，所述百分比为质量百分比；
d)将步骤(2)所得的生长良好的菌株以2％(v/v)的接种量接种于未添加氯化钠、未调节pH的12％脱脂乳培养基的三角瓶中，30℃培养15小时后，于40℃水浴2小时，得培养液d，所述百分比为质量百分比。
将培养液b、培养液c和培养液d将培养液按照GB4789.2-2010所述的步骤方法处理后，37℃培养48小时。
48小时后，通过平板计数法测定b)、c)和d)处理后菌株的生长状况。选择满足b)中活菌总数达到≥105cfu/mL、c)中活菌总数达到≥107cfu/mL且106cfu/mL≥d)中活菌总数达到≥104cfu/mL条件的菌株。
(4)、将满足上述条件的菌株，进行如下的实验：
(一)、按1％(v/v)的接种量接种于装有灭菌的10％脱脂乳培养基的三角瓶中，置于30℃恒温培养箱培养得发酵液，每3小时取出一支三角瓶，24小时后测发酵液pH值，所述百分比为质量百分比。
(二)、按1％(v/v)的接种量接种于装有灭菌的10％脱脂乳培养基的三角瓶中，置于30℃恒温培养箱培养，直至其凝乳，4℃环境下保持24小时。凝乳后用旋转黏度计(购自德国proRheo公司)分别测定各发酵酸乳的黏度(m·Pa/s)。测定时选用2号转子，速度为64r/s。测定时每15s取值一次，测定持续时间为3min，所述百分比为质量百分比。
(三)、按1％(v/v)的接种量接种于装有灭菌的10％脱脂乳培养基的三角瓶中，置于30℃恒温培养箱培养24小时后的悬浮液作为样品。取1mL样品溶液，加入2.5mL 0.28MNaOH溶液，混匀，于25℃左右放置10min。再加入0.75mL福林酚试剂(购自国药试剂)，立即摇匀，于35℃左右反应15min，在660nm下使用紫外分光光度计(购自上海天美科学仪器有限公司)测定样品吸光值OD660，所述百分比为质量百分比。
检测发现，一菌株发酵液的pH为4.73，凝乳时间为18小时，样品吸光值OD660为0.8，由此可见，该菌株产酸速度较快、凝乳状态正常，蛋白质水解能力强。同时对发酵液进行感官评价，该发酵液有酸味且无异味。因此该菌株适于发酵制备干酪，将该菌株命名为BD401，其原始来源为上海的生牛乳。
将乳酸乳球菌乳酸亚种BD401于2015年4月27日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，获得保藏编号为：CGMCCNo.10752，培养物名称是乳酸乳球菌乳酸亚种，分类命名是Lactococcuslactissubsp.lactis。
实施例5肠膜明串珠菌菌株的获得(LM79)
(1)、活化：将保存的47株肠膜明串珠菌从冻存管中取出，以2％(v/v)的接种量接种于经过了121℃、15分钟灭菌的含有5％蔗糖的M17肉汤培养基中(购自英国OXOID公司)30℃培养25小时，连续培养三代，获得活化的菌种，所述百分比为质量百分比。
(2)、将步骤(1)所得的活化的菌种以2％(v/v)的接种量接种于10％脱脂乳培养基中，32℃培养30小时后，选择香味浓郁的菌株，即可。
选择符合以上条件的菌株，命名为LM79，该菌株的原始来源为西藏自治区的牛乳。
肠膜明串珠菌LM79于2015年4月27日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，获得保藏编号为：CGMCC No.10750，培养物名称是肠膜明串珠菌，分类命名是Leuconostoc mesenteroides。
实施例6肠膜明串珠菌菌株的获得(BD1710)
(1)、活化：将保存的47株肠膜明串珠菌从冻存管中取出，以1％(v/v)的接种量接种于经过了121℃、15分钟灭菌的含有4％蔗糖的M17肉汤培养基中(购自英国OXOID公司)28℃培养32小时，连续培养三代，获得活化的菌种，所述百分比为质量百分比。
(2)、将步骤(1)所得的活化的菌种以2％(v/v)的接种量接种于12％脱脂乳培养基中，35℃培养24小时后，选择香味浓郁的菌株，即可。
选择符合以上条件的菌株，命名为BD1710，该菌株的原始来源为安徽省的农家开菲尔。
实施例7肠膜明串珠菌菌株的获得(BD1707)
(1)、活化：将保存的47株肠膜明串珠菌从冻存管中取出，以1％(v/v)的接种量接种于经过了121℃、15分钟灭菌的含有5％蔗糖的M17肉汤培养基中(购自英国OXOID公司)32℃培养16小时，连续培养三代，获得活化的菌种，所述百分比为质量百分比。
(2)、将步骤(1)所得的活化的菌种以2％(v/v)的接种量接种于12％脱脂乳培养基中，28℃培养36小时后，选择香味浓郁的菌株，即可。
选择符合以上条件的菌株，命名为BD1707，该菌株的原始来源为安徽省的农家开菲尔。
由于单一菌株不具备所有的优良特性，为了实现性能互补，将不同特性的菌株组合在一起，使其能够满足各种优良特性。通过在产酸和蛋白质水解能力为主，以产黏为辅对筛选出的乳酸乳球菌菌株进行分组，并分别与产香型的明串珠菌进行结合，进而得到不同组合的菌株，得到在产酸能力无明显差异而不同蛋白水解能力的菌株组合，以达到干酪发酵剂快速产酸和产香功能特性结合的目的。
实施例8
将实施例1～2、4～5所选择的菌株BD3170、BD2263、BD401和LM79以1％(v/v)接种量分别接种到121℃灭菌15min的M17培养基中，再将各菌株以1:1:1:1的活菌数比例，按1％(v/v)总的添加量接种到M17培养基中，30℃培养，每2h测其600nm下的吸光度。
将各菌株以1:1:1:1的活菌数比例，按1％(v/v)总的添加量接种到10％脱脂乳培养基中，记录组合菌株的光密度值OD600及其pH值，参见表1。
结果发现，菌株BD3170、BD2263、BD401在6小时进入对数期，16小时进入稳定期。菌株LM79在4小时进入对数期，15小时进入稳定期。上述菌株BD3170、BD2263、BD401和LM79在16小时均进入稳定期，OD600同时达到最大；同时，菌株BD3170、BD2263、BD401和LM79共同作用时凝乳时间为10小时pH下降至4.27，说明产酸能力非常强。因此四者可以同时共生。
表1 OD600及pH值检测结果
实施例9
将实施例2～5所选择的菌株BD401、BD2263、BD164和LM79以1％(v/v)接种量分别接种到121℃灭菌15min的M17培养基中，再将各菌株以1:1:1:1的活菌数比例，按1％(v/v)总的添加量接种到M17培养基中，30℃培养，每2h测其600nm下的吸光度。
将各菌株以1:1:1:1的活菌数比例，按1％(v/v)总的添加量接种到10％脱脂乳培养基中，记录组合菌株的光密度值OD600及其pH值，参见表2。
结果发现，菌株BD401、BD2263、BD164在6小时进入对数期，16小时进入稳定期。菌株LM79在4小时进入对数期，15小时进入稳定期。上述菌株BD401、BD2263、BD164和LM79在16小时均进入稳定期，OD600同时达到最大；同时，菌株BD401、BD2263、BD164和LM79共同作用时凝乳时间为7小时pH下降至4.26，说明产酸能力非常强。因此四者可以同时共生。
表2 OD600及pH值检测结果
实施例10干酪发酵剂的获得
(1)将乳酸乳球菌乳酸亚种BD164、乳酸乳球菌乳酸亚种BD2263、乳酸乳球菌乳酸亚种BD3170和肠膜明串珠菌LM79按2％(v/v)的接种量接种于10％(w/v)灭菌的脱脂乳培养基(购自新西兰Westland合作乳业有限公司)中，置于30℃恒温培养箱培养24小时，活化2代，得活化的菌株。将活化的菌株按2％(v/v)的接种量接种于10％(w/v)灭菌的脱脂乳培养基中，置于30℃恒温培养箱培养24小时进行扩大培养，重复3次，获得培养物。
(2)将步骤(1)所得的培养物获得乳酸乳球菌乳酸亚种BD164、乳酸乳球菌乳酸亚种BD2263、乳酸乳球菌乳酸亚种BD3170和肠膜明串珠菌LM79，然后按照所述乳酸乳球菌乳酸亚种BD401、所述乳酸乳球菌乳酸亚种BD2263、所述乳酸乳球菌乳酸亚种BD3170和所述肠膜明串珠菌LM79的活菌数为1:1:1:1的比例混合，得干酪发酵剂。
效果实施例1干酪发酵剂生产高达干酪
1)100kg鲜牛乳(购自金山牧场)经过滤，添加0.01％氯化钙，搅拌均匀，在72℃，15s巴氏杀菌后冷却至30℃，所述百分比为质量百分比。将实施例10制得的干酪发酵剂倒入巴氏杀菌后的鲜牛乳中，使鲜牛乳中的干酪发酵剂的总活菌数达到107cfu/mL，缓慢搅拌15min。静置32℃发酵至pH降低0.2之后加入20mg/100L凝乳酶(购自丹尼斯克公司)(其中，凝乳酶在使用前用10倍质量的无菌水溶解，搅拌2min使其溶解均匀)，30min后得凝乳。
2)将步骤1)制得的凝乳切割成边长5mm的立方体的凝块，缓慢搅拌后15min后排出总体积35％的乳清；分2次加入50℃、体积为鲜牛乳总体积25％的水，搅拌20min至凝块温度达到35℃。继续搅拌至排出的乳清pH为6.1，排掉全部乳清。之后将凝块入模、压榨成形、脱模取出。使用浓度为20％的盐水12℃盐渍20h，所述百分比为质量百分比。之后真空包装，10℃、湿度90％RH，成熟5周，即得年轻高达干酪。
效果实施例2干酪的感官评价
本次感官评定人员包括12名从事食品研究的人员，均熟悉感官评定注意事项和评分标准。总分为50分，分数评定遵照表3。各评定员独立进行评定，每次更换样品时使用清水漱口，结果如表4所示。其中，对照组为使用直投式干酪发酵剂CHOOZIT RM 32(购自丹尼克斯(中国)有限公司)，按照效果实施例1的步骤所制得的干酪。
表3 干酪感官评定方法
表4 干酪感官评定结果
表4的结果说明，商业干酪发酵剂制作的高达干酪(对照组)在质地方面与效果实施例1所得的干酪之间的差异并不显著；在滋气味评分中，效果实施例1所得的干酪在干酪特征滋气味和苦味方面的评分以及总分都高于对照组。因此，效果实施例1所得的干酪具有良好的质地以及更好的滋气味。
效果实施例3乳酸乳球菌乳酸亚种的生理生化特征
a)、产酸性能
将乳酸乳球菌乳酸亚种BD164、BD401、BD2263和BD3170按1％(v/v)的接种量接种于装有灭菌的脱脂乳培养基的三角瓶中，置于30℃恒温培养箱培养的培养液，每3小时取出一支三角瓶，测pH值，结果如表5所示，表5中数据为不同时间点的培养液的pH值。
表5 乳酸乳球菌乳酸亚种的产酸速率
由表5可知，乳酸乳球菌乳酸亚种产酸速度较快，产酸力较强，可以用于原料奶的预酸化速度，而酸的形成有利于强化凝乳酶的功能作用和乳中钙的溶解，便于凝乳块的形成。
b)、在脱脂乳中的凝乳时间和凝乳黏度测定
将乳酸乳球菌乳酸亚种BD164、BD401、BD2263和BD3170按1％(v/v)的接种量接种于装有灭菌的脱脂乳培养基的三角瓶中，置于30℃恒温培养箱培养，直至其凝乳，4℃环境下保持24小时。凝乳后用旋转黏度计(购自德国proRheo公司)分别测定各发酵酸乳的黏度(m·Pa/s)。测定时选用2号转子，速度为64r/s。测定时每15s取值一次，测定时间为3min，结果如表6所示。由表6可知，乳酸乳球菌乳酸亚种凝乳速度快，凝乳黏度较高。
表6 乳酸乳球菌乳酸亚种的凝乳时间和凝乳黏度
| 菌株名称 | 凝乳时间/h | 黏度m·Pa/s |
| BD164 | 9 | 195 |
| BD401 | 18 | 185 |
| BD2263 | 10 | 213 |
| BD3170 | 9 | 195 |
c)、发酵特性测试
将乳酸乳球菌乳酸亚种BD164、BD401、BD2263和BD3170按1％(v/v)的接种量接种于装有灭菌的脱脂乳培养基的三角瓶中，置于30℃恒温培养箱培养，直至其凝乳，考察其凝乳风味、乳清析出状况和凝块的质地，结果如表7所示。
表7 乳酸乳球菌乳酸亚种的发酵特性
| 菌株名称 | 凝乳情况 | 品评 |
| BD164 | 乳清析出：一般，组织状态:很好 | 香气非常浓 |
| BD401 | 乳清析出：较多，组织状态:很好 | 一般香 |
| BD2263 | 乳清析出：很多，组织状态:偏硬 | 香气非常浓 |
| BD3170 | 乳清析出：一般，组织状态:很好 | 香气非常浓 |
d)、蛋白水解能力测试
福林(Folin)-酚试剂法测定菌株的蛋白水解能力：取1mL样品溶液，加入2.5mL0.28M NaOH溶液，混匀，于25℃左右放置10min。再加入0.75mL福林酚试剂(购自国药试剂)，立即摇匀，于35℃左右反应15min，在660nm下使用紫外分光光度计(购自上海天美科学仪器有限公司)测定其吸光值。所述的样品溶液为：将乳酸乳球菌乳酸亚种BD164、BD401、BD2263和BD3170按1％(v/v)的接种量接种于装有灭菌的脱脂乳培养基的三角瓶中，置于30℃恒温培养箱培养24小时后的悬浮液。结果发现，乳酸乳球菌乳酸亚种蛋白水解能力较强，而在干酪成熟过程中，干酪发酵剂菌株能够将蛋白质分解为多肽、氨基酸或其它无机、有机小分子物质，对干酪风味的形成起着重要作用。
e)、噬菌体抗性
将发酵异常(干酪用菌不产酸或产酸极为缓慢且凝乳异常即为发酵异常。)的干酪用原料乳(从光明乳业研究院中试车间处获得)作为样品，将乳酸乳球菌乳酸亚种BD164、BD401、BD2263和BD3170按2％(v/v)的接种量接种于装有样品的三角瓶中，置于30℃恒温培养箱发酵培养12小时。测定发酵培养的发酵液的pH值，发现ΔpH≥0.5，说明乳酸乳球菌乳酸亚种具有噬菌体抗性。
效果实施例4肠膜明串珠菌的生理生化特征
a)、发酵特性测试
将肠膜明串珠菌CGMCC No.10750按1％(v/v)的接种量接种于装有灭菌的10％脱脂乳培养基的三角瓶中，置于30℃恒温培养箱培养，直至其凝乳，考察其凝乳风味、乳清析出状况和凝块的质地，结果如表8所示。
表8 肠膜明串珠菌CGMCC No.10750的发酵特性
| 菌株 | 凝乳情况 | 品评 |
| 肠膜明串珠菌CGMCC No.10750. | 乳清析出少，组织状态很好 | 香气浓 |
b)、蛋白水解能力测试
福林(Folin)-酚试剂法测定菌株的蛋白水解能力：取1mL样品溶液，加入2.5mL0.28M NaOH溶液，混匀，于25℃左右放置10min。再加入0.75mL福林酚试剂(购自国药试剂)，立即摇匀，于35℃左右反应15min，在660nm下使用紫外分光光度计(购自上海天美科学仪器有限公司)测定其吸光值。所述的样品溶液为：将肠膜明串珠菌CGMCC No.10750按1％(v/v)的接种量接种于装有灭菌的脱脂乳培养基的三角瓶中，置于30℃恒温培养箱培养24小时后的悬浮液。结果发现，肠膜明串珠菌CGMCC No.10750的OD660为0.82。说明肠膜明串珠菌CGMCC No.10750蛋白水解能力较强，而在干酪成熟过程中，发酵剂菌株能够将蛋白质分解为多肽、氨基酸或其它无机、有机小分子物质，对干酪风味的形成起着重要作用。
c)、噬菌体抗性
将含肠膜明串珠菌的干酪发酵剂发酵异常(干酪用菌不产酸或产酸极为缓慢且凝乳异常即为发酵异常)的干酪用原料乳(从光明乳业研究院中试车间处获得)作为样品，将肠膜明串珠菌CGMCC No.10750按2％(v/v)的接种量接种于装有样品的三角瓶中，置于30℃恒温培养箱发酵培养12小时。测定发酵培养的发酵液的pH值，发现ΔpH≥0.3，说明肠膜明串珠菌CGMCC No.10750具有噬菌体抗性。
应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (7)
1.一种获得高达干酪发酵剂的菌株的方法，其包括以下的步骤：
（1） 将活化的乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）接种于含有3~5%氯化钠、pH4~5的10~12%脱脂乳培养基中，28~35℃培养12~20小时得培养液a，通过平板计数法选择活菌总数a≥106cfu/mL的菌株，所述百分比为质量百分比；
（2） 将步骤（1）获得的菌株接种于10%~12%脱脂乳培养基中，分别在13~16℃培养12~20小时，得培养液b；28~32℃培养12~20小时，得培养液c；在28~32℃培养12~16小时后39~41℃水浴2小时，得培养液d；通过平板计数法选择培养液b中活菌总数b≥105cfu/mL、培养液c中活菌总数c≥107cfu/mL；且培养液d中106 cfu/mL≥活菌总数d≥104cfu/mL的菌株，即乳酸乳球菌菌株类Ⅰ，所述百分比为质量百分比；
将所述乳酸乳球菌菌株类Ⅰ在10~12%脱脂乳培养基中28~32℃培养24小时，得培养液e，选择pH值低于4.8、培养9~24小时后凝乳且光密度值OD660≥0.7的培养液e所对应的菌株为乳酸乳球菌菌株A；
（3） 将活化的肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）接种于10~12%脱脂乳培养基中，28~35℃培养24~36小时后，选择凝乳且香味浓郁的肠膜明串珠菌菌株B，所述百分比为质量百分比；
（4） 将步骤（2）所得的乳酸乳球菌菌株A和步骤（3）所得的肠膜明串珠菌菌株B共同接种于10~12%脱脂乳培养基中，28~32℃培养至凝乳得发酵液f，选择满足以下条件的所述发酵液f：所述发酵液f的pH值低于相同条件下单独培养所述乳酸乳球菌菌株A和所述肠膜明串珠菌菌株B所得的发酵液的pH值，且所述发酵液f的光密度值OD600高于相同条件下单独培养所述乳酸乳球菌菌株A和所述肠膜明串珠菌菌株B所得的发酵液的光密度值OD600，所选择的所述发酵液f对应的菌株即为用于干酪发酵剂的菌株。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述的活化包括以下的步骤：将所述的菌株接种于活化培养基28~32℃培养16~32小时即可；和/或，所述的活化培养基为M17肉汤培养基。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述氯化钠的含量为4~4.5%，所述百分比为质量百分比；所述pH为4.5~5；所述培养的温度为28~32℃；所述培养的时间为12~16小时。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）所述的接种的接种量为1~2%，所述百分比为体积百分比。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）所述的活化包括以下的步骤：将所述的菌株接种于活化培养基28~32℃培养16~32小时；和/或，所述的活化培养基为添加4~5%蔗糖的M17肉汤培养基，所述的百分比为质量百分比。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）所述培养的温度为28~32℃。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（4）所述的接种的接种量为1~2%，所述百分比为体积百分比。
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