CN104975034B - 羊草几丁质酶LcChi2基因在提高植物耐冷性方面的应用 - Google Patents

Abstract

羊草几丁质酶LcChi2基因在提高植物耐冷性方面的应用，涉及植物分子生物学领域。该应用方法包括以下步骤：(1)将羊草几丁质酶LcChi2基因可操作地连于载体上的表达调控序列后，形成含SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的重组载体；(2)将步骤(1)获得的重组载体转化宿主植物细胞，经过筛选获得转化细胞；(3)将步骤(2)获得的转化细胞培育成具有耐冷性的转LcChi2基因植株及其后代。步骤(1)中，所述载体为植物表达载体pBI121或植物表达载体pCAMBIA3300。通过实验证实了转LcChi2基因烟草在冷环境下其种子萌发率有了明显提高，双子叶植物烟草和单子叶植物玉米、水稻过表达LcChi2基因都显著提高了植物苗期耐冷性，从而证明了过表达LcChi2基因显著提高了烟草、玉米、水稻等植物的耐冷能力。

Description

羊草几丁质酶LcChi2基因在提高植物耐冷性方面的应用

技术领域

本发明涉及植物分子生物学技术领域，具体涉及一种羊草几丁质酶LcChi2基因在提高植物耐冷性方面的应用。

背景技术

羊草(Leymus chinensis Trin或Aneurolepidium chinense Trin)，别名碱草，禾本科赖草属多年生草本植物。羊草叶量多、营养丰富、适口性好，各类家畜一年四季均喜食，有“牲口的细粮”之美称。羊草具有耐盐碱、耐寒、耐旱、抗真菌、抗细菌等优势，在平原、山坡、沙壤土中均能适应生长。羊草的耐盐碱性非常强，其体内含有许多抗性相关蛋白，是克隆抗逆基因的良好材料。

几丁质酶(chitinase)主要水解几丁质多聚体中的β-1,4糖苷键，产生N-乙酰氨基葡萄糖寡聚体。根据几丁质酶催化区氨基酸序列的同源性，可以把几丁质酶分为18，19，20家族。18家族的几丁质酶来源于细菌，真菌，病毒及一些植物；19家族的几丁质酶主要包括植物几丁质酶和部分链霉菌属的几丁质酶；20家族包括链霉菌属和人类的几丁质酶。多种微生物、动植物都可产生几丁质酶，高等植物本身不含有作为真菌细胞壁组分之一的几丁质，但当植物受到真菌、细菌和病毒等感染时，几丁质酶的活性迅速提高，几丁质酶在高等植物中有多个成员，功能差异显著。现已证实几丁质酶是主要的植物病程相关蛋白之一。Hong et al的研究表明，病原诱导几丁质酶表达过程中脱落酸(ABA)、NaCl和干旱等因素也有着重要的作用(HONG J K，HWANG B K。Induction by pathogen，salt and drought of abasic class Ⅱ chitinase mRNA and its in situ localization in pepper(Capsicumannuum)[J]。Physiologia Plantarum，2002，114(4):549-558)。Schneider et al的进一步研究发现，病原和水杨酸诱导的几丁质酶活性上升与植物体内的Ca²⁺密切相关(SCHNEIDERMS，KUROSAKI F，NISH IA。Role of salicylic acid and intracellular Ca² in theinduction of chitinase activity in carrot suspension culture[J]。Physiologicaland Molecular Plant Pathology，1994，45(2):101-109)。1986年Schlumbaum et al首次报道了提纯的菜豆几丁质酶具有抗真菌活性(SCHLUMBAUM A，MAUCH F。Plant chitinasesare potent inhibit ors of fungal growth[J]。Nature，1986，324(4376):365-367)。进一步研究表明，提纯的烟草、马铃薯、黄瓜等多种植物几丁质酶对立枯丝核菌等20多种病原真菌和非病原真菌的菌丝生长或孢子萌发具有抑制作用，除抗真菌外，几丁质酶对细菌、昆虫、螨等也表现出一定的抗性。

多项研究表明，植物几丁质酶的表达具有组织特异性，参与了植物的发育调控。目前，此类研究大多集中在几丁质酶与植物有性生殖过程的关系上。Robins on et al的研究表明，Ⅳ类几丁质酶和葡萄的成熟密切相关，并存在表达的组织或器官特异性(ROBINSON SP，JACOBS A K，DRYIB。A class Ⅳ chitinase is highly expressed in grape berriesduring ripening[J]。Plant Physiology，1997，114(3):771-778)；而在胡萝卜中，几丁质酶则参与了控制早期胚胎的发育(KRAGH K M，JACOBSEN S，MIKKELSEN J D。Inductionpurification and characterization of barley leaf chitinase[J]。Plant Science，1996，157(1):55-68)。此外，几丁质酶和植物营养生长也有密切的关系，导入外源几丁质酶基因的植株生长更加迅速(PATILVR，WIDHOLM J M。Possible correlation betweenincreased vigour and chitinase activity expression in tobacco[J]。CropScience，1994，34(4):1070-1073)。几丁质酶还具有其它多种生理功能，Minic et al的研究表明，几丁质酶可以降解固氮菌产生的结瘤因子，从而控制结瘤因子水平，使植物与根瘤菌达到共生平衡，参与共生固氮调控(MINIC Z，BROWN S，KOUCHKOVSKY Y et al。Purification and characterization of a novel chitinase-lysozyme，of anotherchitinase，both hydrolysing Rhizobium meliloti nod factors，and of apathogenesis-related protein from Medicago sativa roots[J]。BiochemicalJourna，1998，332(2):329-335)。Stangarlin et al的研究表明，几丁质酶广泛参与了植物光合作用等过程(STANGARLIN J R，PASCHOLATI S F。Activities of ribulose-1，5-bisphosphate carboxylase-oxygenase(rubisco)，chlorophyllase，beta-1，3 glucanaseand chitinase and chlorophyll content in bean cultivars(Phaseolus vulgaris)infected with Uromyces appendiculatus[J]。Phytopathologica，2000，26(1):34-42)。

早期的研究认为不同植物几丁质酶基因的氨基酸序列非常类似，但在细菌、植物真菌和酵母中几丁质酶基因的核苷酸序列差异较大。Levorson et al比较了在GeneBank中登录的从29种植物中克隆的86种几丁质酶基因，指出尽管在各类几丁质酶基因中存在一定的同源性，但这种同源性较低，没有相对高度保守的核苷酸序列(LEVORSON J，CHLANC A。Plant chitinase consensus sequences[J]。Plant Molecular Biology Reporter，1997，15(2):122-133)。这一结果表明，利用其它植物的几丁质酶基因的核苷酸序列作为探针和引物进行的克隆策略可能存在困难，这可能是导致目前在植物抗病基因工程中可利用的几丁质酶基因来源狭窄的原因，也进一步说明几丁质酶很可能在高等植物中多个成员间存在较大的功能差异。表1中给出了部分已经克隆的几丁质酶基因(张志忠，吴菁华，吕柳新，林义章。植物几丁质酶及其应用研究进展。福建农林大学学报(自然科学版)2005，34(4):494-499)。

表1

近年来，利用导入外源几丁质酶基因增强植物抗病性的成功案例较多，马铃薯(南相日。菜豆几丁质酶基因转化马铃薯及后代表达。中国农学通报，2006，22(2):75-77)、水稻(Nishizawa Y，Nishio Z，Nakazono K，Ksoma M，Nakajima E，UgakiM，Hibi T。Enhancedresistance to blast(Magnaporthe grisea)in transgenic japonica rice byconstitutive expression of rice chitinase。Theoretical and Applied Genetics，1999，99:383-390)、黑杨(孟亮，李红双，金德敏，崔德才，王斌。转几丁质酶基因黑杨的获得。生物技术通报，2004(3):48-51)、油菜(蓝海燕，田颖川，王长海。表达β-1,3-葡聚糖酶及几丁质酶基因的转基因导入油菜的研究初报。中国油料作物学报，2000，22(14):6-10)、西瓜(王果萍，王景雪，孙毅等。几丁质酶基因导入西瓜植株及其抗病性鉴定研究。植物遗传资源学报，2003，4(2):104-109)等多种植物已获得了转几丁质酶基因的植株，其中目的基因主要来源于植物，如水稻、烟草、菜豆等，也有来源于昆虫和微生物，转化方法以根癌农杆菌介导法为主，转化植物产生的效果各种各样，一般转植物源几丁质酶基因对某些病原的抗性均有所增强，且大多数转化植物增强的抗性与其所表达的几丁质酶量呈正相关。尽管转几丁质酶基因可以增强植物的抗病性，但这与物种、基因来源、类型、导入目标植株后在染色体上的定位及病原菌种类等均有关系。随着对几丁质酶作用机理研究的深入，通过几丁质酶基因工程手段培育出具有抗性转基因植物将成为防治植物真菌病害的有效途径。

关于几丁质酶在非生物逆境中的应用鲜有报道。研究中首次从羊草中盐碱胁迫cDNA表达文库中分离出一种新基因的全长cDNA，命名为：LcChi2，生物信息学分析表明该基因与其他几丁质酶成员显著不同，属于几丁质酶家族的远源成员；转基因烟草表明LcChi2具有几丁质酶的特性，显著提高植物抗真菌性和抗细菌性；过表达该基因的酿酒酵母InVSc1和烟草，研究发现该基因能够提高转基因酵母的耐盐性和转基因烟草的耐盐碱性(李蕊沁，冯树丹，于莹，吕召志，黎莉，徐明华，尹悦佳，郝东云。羊草几丁质酶ClassⅡ基因的克隆、生物信息学分析及原核表达。中国农业科技导报，2010年02期)。最新研究发现：过表达LcChi2基因除了表现抗真菌、抗细菌、抗盐碱的生物特性外，并不具备抗所有非生物逆境的能力，也不直接参与非生物逆境调控，具体表现为不抗旱、ABA不敏感等。

目前，关于羊草几丁质酶LcChi2基因在提高植物耐冷性发面的研究未见报道。

发明内容

为了提高植物耐冷性，本发明提供一种羊草几丁质酶LcChi2基因在提高植物耐冷性方面的应用。

本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下：

本发明提供一种羊草几丁质酶LcChi2基因在提高植物耐冷性方面的应用。

所述羊草几丁质酶LcChi2基因的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO:1所示；所述羊草几丁质酶LcChi2基因的核苷酸序列所编码的多肽的氨基酸序列如列表中的SEQ IDNO:2所示。

该应用过程包括以下步骤：

(1)将羊草几丁质酶LcChi2基因可操作地连于载体上的表达调控序列后，形成含SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的重组载体；

(2)将步骤(1)获得的重组载体转化宿主植物细胞，经过筛选获得转化细胞；

(3)将步骤(2)获得的转化细胞培育成具有耐冷性的转LcChi2基因植株及其后代。

进一步的，步骤(1)中，所述载体为植物表达载体pBI121或植物表达载体pCAMBIA3300。

进一步的，步骤(3)中，所述后代包括转LcChi2基因植株种子及转LcChi2基因植株组织。

进一步的，所述植物为：烟草、水稻或玉米。

本发明还提供一种培育具有耐冷能力植物的方法，该方法包括以下步骤：

(1)将羊草几丁质酶LcChi2基因可操作地连于载体上的表达调控序列后，形成含SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的重组载体；

(2)将步骤(1)获得的重组载体转化宿主植物细胞，经过筛选获得转化细胞；

(3)将步骤(2)获得的转化细胞培育成转LcChi2基因植株及其后代；所述转LcChi2基因植株及其后代具有耐冷性。

进一步的，步骤(1)中，所述载体为植物表达载体pBI121或植物表达载体pCAMBIA3300。

进一步的，步骤(3)中，所述后代包括转LcChi2基因植株种子及转LcChi2基因植株组织。

进一步的，所述植物为：烟草、水稻或玉米。

本发明中，在羊草几丁质酶LcChi2基因的核苷酸序列中，经过取代、缺失或添加一个或几个核苷酸衍生所得的核苷酸序列，且该衍生所得的核苷酸序列编码的多肽与羊草几丁质酶LcChi2基因的核苷酸序列编码的多肽功能相同，则该衍生所得的核苷酸序列和其编码的多肽同样具有提高植物耐冷性的功能。

本发明中所述的“可操作地连于”表示如下情况：即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。

本发明的有益效果是：

本发明通过实验证实了转LcChi2基因烟草在冷环境下其种子萌发率有了明显提高，双子叶植物烟草和单子叶植物玉米、水稻过表达LcChi2基因都显著提高了植物苗期耐冷性，从而证明了过表达LcChi2基因显著提高了烟草、玉米、水稻等植物的耐冷能力。

转基因植株在胁迫条件下的脯氨酸含量也有提高，丙二醛含量明显下降，电导率显著下降。

进一步证实LcChi2基因过表达后通过一条不依赖于ABA途径、改变细胞渗透压、减少细胞膜破损的方法有效的提高植物耐冷性。

本发明培育出耐冷植物的方法简便而有效，为提高植物耐冷提供了新的有效选择，具有好的应用前景。

附图说明

图1为羊草几丁质酶LcChi2基因与其他植物中同源基因的多序列比对分析示意图。

图2为羊草几丁质酶LcChi2基因系统进化树。

图3为羊草几丁质酶LcChi2基因在不同胁迫条件下的表达分析实验结果图，

图3A为400mM NaCl胁迫处理，图3B为100mM Na₂CO₃胁迫处理，图3C为20％PEG胁迫处理。

图4为羊草几丁质酶LcChi2基因在不同胁迫条件下的酶活性分析实验结果图。图中：a为100mM Na₂CO₃胁迫处理，b为400mM NaCl胁迫处理，c为未胁迫处理即正常生长。

图5为转LcChi2基因酵母的Northern杂交分析实验结果图。图中：1为转化pYES2空载体的转基因酵母，2为转化pYES2-LcChi2的转基因酵母(未诱导)，3为转化pYES2-LcChi2的转基因酵母(诱导)。

图6为转LcChi2基因酵母的耐盐碱性实验结果图。图6A为转LcChi2基因酵母在10mM Na₂CO₃胁迫条件下的实验结果图，图6A中，1为未胁迫处理即正常生长，2为10mMNa₂CO₃胁迫处理，a为含空载体pYES2的转化体，b为转LcChi2基因酵母。图6B为转LcChi2基因酵母分别在1.6M NaCl、1.5M Sorbitol(山梨醇)和10mM ZnSO₄胁迫条件下的实验结果图，图6B中，1为未胁迫处理即正常生长，2为1.6M NaCl胁迫处理，3为1.5M Sorbitol(山梨醇)胁迫处理，4为10mM ZnSO₄胁迫处理，a为转LcChi2基因酵母，b为含空载体pYES2的转化体。

图7为双子叶植物表达载体pBI121-35s-LcChi2的构建过程示意图。

图8为转LcChi2基因烟草的Northern杂交分析实验结果图。图中：WT为野生型烟草，C6、C10、C15均为转LcChi2基因烟草。

图9为转LcChi2基因烟草苗期抗病性实验结果图。图9A为抗真菌病实验，图9B为抗细菌病实验。图9A和图9B中，WT为野生型烟草，C6、C10、C15均为转LcChi2基因烟草。

图10为转LcChi2基因烟草萌发期耐盐碱性实验结果图。图中：1为未胁迫处理即正常生长，2为200mM NaCl胁迫处理，3为3mM Na₂CO₃胁迫处理，4为500mM Sorbitol(山梨醇)胁迫处理，WT为野生型烟草，C6、C10、C15均为转LcChi2基因烟草。

图11为转LcChi2基因烟草苗期耐盐碱性实验结果图。图中：WT为野生型烟草，C6、C10、C15均为转LcChi2基因烟草。

图12为转LcChi2基因烟草苗期耐冷性实验结果图。图中：WT为野生型烟草，C6、C10、C15均为转LcChi2基因烟草。

图13为单子叶植物表达载体pCAMBIA3300-ubi-LcChi2的构建过程示意图。

图14为转LcChi2基因玉米的PCR检测结果图。图中：M为DL2000，1～13均为转LcChi2基因玉米，14为空白对照，15为阳性对照。

图15为转LcChi2基因玉米苗期耐盐性实验结果图。图中：WT为野生型玉米，LcChi2为转LcChi2基因玉米。

图16为转LcChi2基因玉米苗期耐冷性实验结果图。图中：WT为野生型玉米，LcChi2为转LcChi2基因玉米。

图17为转LcChi2基因水稻的PCR检测结果图。图中：M为DL2000，1～10均为转LcChi2基因水稻，11为阴性对照，12为空白对照。

图18为转LcChi2基因水稻苗期耐冷性实验结果图。图中：WT为野生型水稻，LcChi2为转LcChi2基因水稻。

图19为转LcChi2基因烟草ABA敏感性分析示意图。

图20为转LcChi2基因烟草冷胁迫条件下脯氨酸含量测定结果图。图中：1为野生型烟草，2、3、4均为转LcChi2基因烟草。

图21为转LcChi2基因烟草冷胁迫条件下丙二醛含量测定结果图。图中：1为野生型烟草，2、3、4均为转LcChi2基因烟草。

图22为转LcChi2基因烟草冷胁迫条件下相对电导率测定结果图。图中：1为野生型烟草，2、3、4均为转LcChi2基因烟草。

具体实施方式

本发明的一种羊草几丁质酶LcChi2基因在提高植物耐冷性方面的应用，所说的羊草几丁质酶LcChi2基因的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO:1所示；该核苷酸序列所编码的多肽的氨基酸序列如列表中的SEQ ID NO:2所示，该应用过程包括以下步骤：

(1)将羊草几丁质酶LcChi2基因可操作地连于植物表达载体pBI121或植物表达载体pCAMBIA3300上的表达调控序列后，形成含SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的重组载体；

(2)将步骤(1)获得的重组载体转化宿主植物细胞，经过筛选获得转化细胞；

(3)将步骤(2)获得的转化细胞培育成具有耐冷性的转LcChi2基因植株及其后代，后代包括转LcChi2基因植株种子及转LcChi2基因植株组织。

本发明还提供一种培育具有耐冷能力植物的方法，该方法包括以下步骤：

(1)将羊草几丁质酶LcChi2基因可操作地连于植物表达载体pBI121或植物表达载体pCAMBIA3300上的表达调控序列后，形成含SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的重组载体；

(2)将步骤(1)获得的重组载体转化宿主植物细胞，经过筛选获得转化细胞；

(3)将步骤(2)获得的转化细胞培育成具有耐冷性的转LcChi2基因植株及其后代，后代包括转LcChi2基因植株种子及转LcChi2基因植株组织。

上述所说的植物为：烟草、水稻或玉米。

以下结合实施例和附图对本发明做进一步详细说明。

实施例1：羊草几丁质酶LcChi2基因的克隆

(1)RNA的提取：选用三叶期羊草为实验材料，经100mM Na₂CO₃处理后，取羊草叶片于研钵中，液氮研磨至粉末状；室温下，采用RNAiso提取总RNA；总RNA质量和纯度采用微量分光光度计和琼脂糖凝胶电泳进行检测。

(2)LcChi2基因3′端片段的获得：利用Clontech公司的SMARTTM RACE cDNAAmplification Kit试剂盒，得到羊草几丁质酶LcChi2基因3′端片段；根据Genbank上报道的酯酶基因EST(CD808914)序列信息设计羊草几丁质酶LcChi2基因3′-RACE引物，引物序列如下所示：

正向引物：5′-CCGACCAGTTCCAATGGGGCT-3′

5′-CCGCCGCCAACACCTTCC-3′

反向引物：5′-GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTT-3′

5′-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3′

上述的反向引物为SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit试剂盒自带。

PCR反应体系：2.5μl含MgCl₂和dNTP的10×PCR缓冲液，1μl 10μM正向引物，1μl 10μM反向引物，1μl cDNA样品，1μl Ex-Taq酶，18.5μl灭菌双蒸水；PCR反应程序：94℃预变性5min，94℃预变性30s，55℃复性40s，72℃延伸1min，30个循环后，72℃延伸10min。胶回收PCR产物并进行测序，将测序正确的PCR产物保存备用。

(3)LcChi2基因全长cDNA的获得：利用Promega公司的Reverse TranscriptionSystem试剂盒，得到羊草几丁质酶LcChi2基因全长cDNA(互补脱氧核糖核酸)；将Genbank上报道的酯酶基因EST(CD808914)序列与上述步骤(2)中得到的PCR产物拼接后设计羊草几丁质酶LcChi2基因全长cDNA引物，引物序列如下所示：

正向引物：5′-GAGTTGGCATGGCGAGGTTTG-3′

反向引物：5′-GCCGTGGGACCTGCATACTTC-3′

PCR反应体系：2.5μl含MgCl₂和dNTP的10×PCR缓冲液，1μl 10μM正向引物，1μl 10μM反向引物，1μl cDNA样品，1μl Ex-Taq酶，18.5μl灭菌双蒸水；PCR反应程序：94℃预变性5min，94℃预变性30s，55℃复性40s，72℃延伸1min，30个循环后，72℃延伸10min。胶回收PCR产物并进行测序，将测序正确的PCR产物保存备用。

(4)基因克隆：将上述步骤(3)中得到的PCR产物与pMD18-T载体连接，连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，采用蓝白斑筛选和抗性筛选结合的方法筛选阳性克隆；筛选到的阳性克隆经PCR和酶切进一步验证后测序，从而获得羊草几丁质酶LcChi2基因全长序列。羊草几丁质酶LcChi2基因的核苷酸序列如序列表中的序列1所示，其编码的氨基酸序列如序列表的序列2所示。

实施例2：羊草几丁质酶LcChi2基因的序列分析

羊草几丁质酶LcChi2基因的序列分析：将羊草几丁质酶LcChi2基因与其他植物中同源基因进行多序列比对分析，采用DNAMAN软件进行序列比对，其他植物以及其他植物中同源基因在GenBank中的登录号分别为：Hordeum vulgare(CAA55344)，Triticum aestivum(BAB82471)，Secale cereale(AAG53610)和Capsicum annuum(AAC36359)，这四个同源基因序列都是由甲硫氨酸(Met)起始的。

如图1所示，黑色框代表完全一致的序列，灰色框代表相似的序列，黑线上面的罗马数字代表可能存在的基序(DNA、蛋白质等生物大分子中的保守序列，在反式作用因子的结构中，基序一般指构成任何一种特征序列的基本结构(既指具有此功能的基本结构，也指编码此结构的蛋白质或DNA序列))，黑色圆圈代表(半胱氨酸)Cys49(甘氨酸)Gly71位置上的19家族的几丁质酶特征1(PS00773)，黑色方块代表Val(缬氨酸)161(甲硫氨酸)Met171位置上的19家族的几丁质酶特征2(PS00774)。结果显示：通过羊草几丁质酶LcChi2基因与其他植物中同源基因进行多序列比对分析证明了羊草几丁质酶LcChi2基因具有耐盐碱性生物特性，为转化提供依据和证据。

实施例3：羊草几丁质酶LcChi2基因系统进化树的构建

羊草几丁质酶LcChi2基因系统进化树的构建：采用MEGA 3.1和Clustal X程序构建系统进化树并评估系统进化树。系统进化树的构建可以预测或分析目的基因的可能功能，比如目的基因很可能会和与它关系最近的已知基因相同或相近。登录号、基因类型和物种如图2所示：

CAA55344-HvCHI-II：大麦chitinase[Hordeum vulgare subsp.vulgare]；

ACV20870-LcChi2：羊草chitinase[Leymus chinensis]；

BAB82471-TaCHI-II：小麦chitinase 1[Triticum aestivum]；

AAG53610-ScCHI-II：黑麦24.8kDa class II endochitinase-antifreezeprotein precursor[Secale cereale]；

AAC36359-CaCHI-II：辣椒chitinase class II[Capsicum annuum]；

BAD77932-CjCHI-IV：柳杉class IV chitinase[Cryptomeria japonica]；

AAQ10093-VvCHI-IV：葡萄class IV chitinase[Vitis vinifera]；

CAA74930-AtCHI-IV：拟南芥class IV chitinase[Arabidopsis thaliana]；

ACL36992-MsCHI-IV：紫花苜蓿class IV chitinase[Medicago sativa]；

AAP80801-GhCHI-VII：陆地棉class VII chitinase precursor[Gossypiumhirsutum]；

AAD04295-VvCHI-I：葡萄class I extracellular chitinase[Vitis vinifera]；

ADI56257-GhCHI-I：陆地棉class I chitinase[Gossypium hirsutum]；

AAA62421-ZmCHI-I：玉米acidic class I chitinase[Zea mays]；

AAC24807-StCHI-I：马铃薯class I chitinase[Solanum tuberosum]；

AAD05433-UdCHI-VI：荨麻；

AAN37391-CaCHI-III：辣椒class III chitinase[Capsicum annuum]；

CAA77657-NtCHI-III：烟草basic chitinase III[Nicotiana tabacum]；

CAA76203-LaCHI-III：羽扇豆class III chitinase[Lupinus albus]；

AAM08773-OsCHI-III：水稻Class III chitinase[Oryza sativa]；

AAT47713-HICHI-V：哈茨木霉菌class V chitinase[Trichoderma harzianum]；

AAM18075-McCHI-V：苦瓜class V chitinase[Momordica charantia]；

ACM45717-PpCHI-V：梨class V chitinase[Pyrus pyrifolia]；

CAA54374-NtCHI-V：烟草chitinase,class V[Nicotiana tabacum]。

如图2所示，LcChi2蛋白与小麦、大麦、黑麦和水稻等来源的几丁质酶有很近的进化关系，氨基酸序列相似性分别为96.5％、96.5％、95.2％和80.5％，但与云杉、二色补血草、橡胶树和玉米来源的几丁质酶的氨基酸序列相似性相对较低。这表明：LcChi2基因的蛋白质与其他几丁质酶执行相似的功能，即具有几丁质酶的活性。

实施例4：羊草几丁质酶LcChi2基因在胁迫条件下的表达分析

如图3所示，提取三叶期不同胁迫处理的羊草叶片的RNA，反转录成cDNA后作为RT-PCR的模板。采用引物5'ATGGCGAGGTTTGCTGCCCTCG3'和5'CTAGCTAGCGAAGTTTCGCTGGGTG3'进行PCR反应30个循环，可以得到一条771bp的条带。同时以Actin基因(GenBank登录号AB181991)作为内标基因，采用引物5'GGACCTTGCTGGTCGTGACC3'和5'CCTCAGGGCACCTGAACCTTT3'进行PCR反应28个循环，可以得到一条245bp的条带。

实施例5：羊草几丁质酶LcChi2基因在胁迫条件下的酶活性分析

以三叶期不同胁迫处理的羊草叶片为实验材料，采用N-乙酰氨基葡萄糖做标准曲线，几丁质酶为底物。结果如图4所示，未胁迫处理即正常生长的羊草叶片中几丁质酶含量明显低于经过胁迫处理后的羊草叶片。

实施例6：酵母表达载体的构建

用分别含有酶切位点Hind III和BamH I的引物

5'cccaagcttATGGCGAGGTTTGCTGCCCTCG3'和5'cgcggatccCTAGCTAGCGAAGTTTCGCTGGGTG3'扩增羊草几丁质酶LcChi2基因，胶回收后的PCR产物和酵母表达载体pYES2分别用Hind III和BamH I进行双酶切，酶切产物胶回收后，在T4连接酶的作用下连接产生重组质粒pYES2-LcChi2；将重组质粒pYES2-LcChi2转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，经PCR和酶切进一步验证后测序；将空载体pYES2和重组质粒pYES2-LcChi2分别用LiCl方法转入酿酒酵母INVSc1中，转化后的酵母经PCR和酶切进一步验证后测序确定阳性克隆，测序正确的阳性克隆即为得到的转LcChi2基因酵母。

实施例7：转LcChi2基因酵母的生物性能分析

(1)转LcChi2基因酵母的Northern杂交分析

分别提取含有空载体pYES2和重组质粒pYES2-LcChi2的转基因酵母(未诱导和诱导的)的RNA，经MOPS-甲醛变性电泳检测其完整性，再采用罗氏的杂交试剂盒进行Northern杂交分析。结果如图5所示，转LcChi2基因酵母细胞内有LcChi2基因的转录产物—特异mRNA的生成，证明了整合到酵母染色体上的LcChi2基因能够正常表达。

(2)转LcChi2基因酵母的耐盐碱性分析

将含有空载体pYES2和重组质粒pYES2-LcChi2的转基因酵母在酵母SC-U诱导培养基上培养过夜，在含有10mM Na₂CO₃的YPD培养基上进行划线实验，结果如图6A所示，当含有空载体pYES2和重组质粒pYES2-LcChi2的转基因酵母在酵母SC-U诱导培养基上划线培养时，两组生长比较无差别；当含有空载体pYES2和重组质粒pYES2-LcChi2的转基因酵母在含有10mM Na₂CO₃的YPD培养基上进行划线实验(即在胁迫培养下)时，含有重组质粒pYES2-LcChi2的转基因酵母长势明显比含有空载体pYES2的转化体生长要好。

将含有空载体pYES2和重组质粒pYES2-LcChi2的转基因酵母在酵母SC-U诱导培养基上培养过夜，在含有1.6M NaCl、1.5M Sorbitol(山梨醇)和10mM ZnSO₄的YPD培养基上进行点板实验，结果如图6B所示，当含有空载体pYES2和重组质粒pYES2-LcChi2的转基因酵母在酵母SC-U诱导培养基上进行点板试验时，两组生长比较无差别；当空载体pYES2和重组质粒pYES2-LcChi2的转基因酵母在含有1.6M NaCl、1.5M Sorbitol(山梨醇)和10mM ZnSO₄的YPD培养基上进行点板实验时，重组质粒pYES2-LcChi2的转基因酵母在浓度不断稀释下，长势明显比含有空载体pYES2的转化体生长要好，最终证明了转LcChi2基因酵母的耐盐碱性。

实施例8：双子叶植物表达载体的构建

如图7所示，将含有35S启动子、NOS终止子和LcChi2基因片段的质粒和植物表达载体pBI121分别用Hind III酶切，酶切产物胶回收后，在T4连接酶的作用下连接产生重组质粒pBI121-LcChi2；将重组质粒pBI121-LcChi2转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，经PCR和酶切进一步验证后测序；将构建好的重组质粒pBI121-LcChi2采用三亲杂交法转入农杆菌EHA105中，经PCR和酶切进一步验证后测序确定阳性克隆，测序正确的阳性克隆即为得到的双子叶植物表达载体pBI121-35s-LcChi2。

实施例9：转LcChi2基因烟草的生物性能分析

(1)烟草的遗传转化

种植烟草，取叶片消毒，进行无菌处理，切呈1cm²的小块；将上述实施例8中含有双子叶植物表达载体pBI121-35s-LcChi2的农杆菌EHA105用1/2MS重悬至OD600＝0.8中，形成农杆菌重悬液；将无菌处理后的烟草叶片浸于农杆菌重悬液中15min；将烟草叶片移入烟草共培养基暗培养3天，再移入烟草筛选培养基进行抗性筛选，筛选出的抗性苗再移入烟草生根培养基中生根；生根后从烟草生根培养基中移栽至土壤中，获得转LcChi2基因烟草。

(2)转LcChi2基因烟草的分子鉴定及Northern杂交分析

提取野生型烟草和转LcChi2基因烟草的基因组DNA进行目的基因的PCR鉴定，鉴定为阳性的烟草植株收获T1代种子；提取野生型烟草和鉴定为阳性的T1代转LcChi2基因烟草的RNA，采用罗氏的杂交试剂盒进行Northern杂交分析，结果如图8所示，转LcChi2基因烟草细胞内有LcChi2基因的转录产物—特异mRNA的生成，证明了整合到烟草染色体上的LcChi2基因能够正常表达。

(3)转LcChi2基因烟草苗期的抗病性鉴定

取野生型烟草和鉴定为阳性的T1代转LcChi2基因烟草六叶期烟草叶片，叶片背面注射细菌悬浮液，5天后观察叶片表型，结果如图9A所示：在同等浓度细菌悬浮液的伤害下，野生型烟草叶片的相对病变区显著高于转LcChi2基因烟草叶片，证明转LcChi2基因烟草对植株苗期的抗病性有显著效果；将含有真菌的PDA培养基倒置于离体的烟草叶片上，7天后观察叶片表型变化，结果如图9B所示，在含有相同真菌的PDA培养基中，野生型烟草叶片的相对病变区显著高于转LcChi2基因烟草叶片，证明转LcChi2基因烟草对植株苗期的抗病性有显著效果。

(4)转LcChi2基因烟草萌发期的耐盐碱性鉴定

将野生型烟草和鉴定为阳性的烟草植株收获的T1代种子分别置于含有200mMNaCl、3mM Na₂CO₃和500mM Sorbitol(山梨醇)的MS培养基上进行萌发期的胁迫实验，30天后观察叶片表型变化，结果如图10所示，转LcChi2基因烟草在萌发期的长势显著优于野生型烟草，证明转LcChi2基因烟草在植株萌发期表现出一定的耐盐碱性。

(5)转LcChi2基因烟草苗期的耐盐碱性鉴定

当野生型烟草和鉴定为阳性的T1代转LcChi2基因烟草六叶期时浇灌600mM NaCl，25天后观察叶片表型变化，结果如图11所示，证明转LcChi2基因烟草在植株苗期表现出一定的耐盐碱性。

实施例10：过表达LcChi2基因提高转LcChi2基因烟草苗期耐冷性

将鉴定为阳性的烟草植株收获的T1代种子置于烟草生根培养基上进行生根培养，7天后将生根后的烟草从烟草生根培养基中移栽至土壤中，待其三叶期时进行冷胁迫实验，在4℃胁迫2天后，恢复至室温2天的结果如图12所示，过表达LcChi2基因提高了转LcChi2基因烟草苗期耐冷性。

实施例11：单子叶植物表达载体的构建

如图13所示，将含有35S启动子、NOS终止子和LcChi2基因片段的质粒和植物表达载体pCAMBIA3300分别用BamHI和SpeI酶切，酶切产物胶回收后，在T4连接酶的作用下连接产生重组质粒pCAMBIA3300-LcChi2；将重组质粒pCAMBIA3300-LcChi2转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，经PCR和酶切进一步验证后测序；将构建好的重组质粒pCAMBIA3300-LcChi2采用三亲杂交法转入农杆菌EHA105中，经PCR和酶切进一步验证后测序确定阳性克隆，测序正确的阳性克隆即为得到的单子叶植物表达载体pCAMBIA3300-ubi-LcChi2。

实施例12：转LcChi2基因玉米的生物性能分析

(1)玉米的遗传转化

19℃下，将上述实施例11中含有单子叶植物表达载体pCAMBIA3300-ubi-LcChi2的农杆菌EHA105置于含有100mg/L Spe抗性和50mg/L Kan抗性的YEP培养基上生长3天；将生长3天后的菌落刮下于重悬液(重悬液：N6基础盐和维生素，0.69g/L脯氨酸，2mg/L 2，4-D，68.4g/L蔗糖，36g/L葡萄糖，pH 5.2,高温高压灭菌后加入200mol/LAS。)中，制成农杆菌重悬液调整OD₅₅₀值在0.3～0.4之间；挑选分离出的大小在1.5～2.0mm之间的幼胚100个，侵泡于农杆菌重悬液中，侵染5min；侵染后，吸干多余的农杆菌菌液，将幼胚转移至玉米共培养基中，，其中胚胎轴面与培养基接触；采用通风胶带对平板进行封口，将平板移至培养箱中，黑暗条件下20℃培养3天；将培养3天后的幼胚转移至静息培养基中，黑暗条件下28℃培养7天；再转至含有1.5mg/L双丙氨膦的玉米筛选培养基I中，28℃暗培养2周，采用通风胶带对平板进行封口；将培养2周后的幼胚转移至3mg/L双丙氨膦抗性玉米筛选培养基II上培养；采用封口膜对平板进行封口；侵染后5周左右能快速增长的II型愈伤组织即为稳定转化的愈伤组织；II型愈伤组织在黑暗条件下，在玉米暗分化培养基上分化培养，最后将分化得到的胚芽鞘转至玉米光分化培养基上培养2周。待胚芽鞘形成完整的幼苗和根，将幼苗转入培养瓶中促根壮苗。即得到再生的R0代转LcChi2基因玉米植株。

(2)转LcChi2基因玉米的分子鉴定

提取野生型玉米和转LcChi2基因玉米的基因组DNA进行目的基因的PCR鉴定，鉴定为阳性的玉米植株收获T1代种子，结果如图14所示，初步证明转LcChi2基因玉米为阳性植株，即在转LcChi2基因玉米植株中通过PCR手段检测到目的基因即LcChi2基因的存在。

(3)转LcChi2基因玉米苗期的耐盐性鉴定

将步骤(2)中鉴定为阳性的玉米植株收获的T1代种子置于玉米萌发培养基上进行培养，待其生长至三叶一心期时，浇灌600mM NaCl溶液进行苗期的胁迫实验，胁迫0天、2天、4天、6天后的结果如图15所示，在600mM NaCl胁迫下，转LcChi2基因玉米在植株苗期表现出一定的耐盐性。

实施例13：过表达LcChi2基因提高转LcChi2基因玉米苗期耐冷性

将实施例12的步骤(2)中鉴定为阳性的玉米植株收获的T1代种子置于玉米生根培养基上进行生根培养，7天后将生根后的玉米移栽至土壤中，待其生长至三叶一心期时进行冷胁迫实验，在4℃和0℃冷胁迫2天后的结果如图16所示，过表达LcChi2基因提高了转LcChi2基因玉米苗期耐冷性。

实施例14：转LcChi2基因水稻的生物性能分析

(1)水稻的遗传转化

取吉粳88成熟种子去壳后，分别以75％乙醇、25％次氯酸钠溶液表面消毒，28℃下接种于水稻诱导培养基暗培养诱导愈伤组织；愈伤继代3次后预培养4天，农杆菌EHA105(D600nm＝0.5～0.6)侵染20min后转入水稻共培养基中培养2天(28℃暗培养)；利用含潮霉素的水稻筛选培养基筛选3次(潮霉素浓度分别为30mg/L、40mg/L、50mg/L)，转入水稻分化培养基；10～15天后选取分化明显的幼苗接于水稻生根培养基中；待幼苗生长7～10天后移入温室中盆栽，2～3周后移入田间生长，获得转LcChi2基因水稻植株。

(2)转LcChi2基因水稻的分子鉴定

提取野生型水稻和转LcChi2基因水稻的基因组DNA进行目的基因的PCR鉴定，鉴定为阳性的水稻植株收获T1代种子，结果如图17所示，初步证明转LcChi2基因水稻为阳性植株，即在转LcChi2基因水稻植株中通过PCR手段检测到目的基因即LcChi2基因的存在。

实施例15：过表达LcChi2基因提高转LcChi2基因水稻苗期耐冷性

将实施例14的步骤(2)中鉴定为阳性的水稻植株收获的T1代种子置于水稻生根培养基上进行生根培养，7天后将生根后的水稻移栽至土壤中，待其生长至分蘖期时进行冷胁迫实验，在4℃胁迫1天后的结果如图18所示，过表达LcChi2基因提高了转LcChi2基因水稻苗期耐冷性。

实施例16：过表达LcChi2基因植株耐冷机理分析

(1)转LcChi2基因烟草ABA敏感性分析

将转LcChi2基因烟草T2代种子与野生型烟草种子于MS培养基中进行层积化处理，处理2天后置于光照培养箱中培养7天，然后将烟草幼苗移入含有0uM、5uM、10uM ABA浓度的MS培养基中进行垂直培养，6天后观察，结果如图19所示，检验LcChi2基因的信号传导途径为非依赖ABA信号途径。

(2)转LcChi2基因烟草冷胁迫下脯氨酸含量测定

将鉴定为阳性的烟草植株收获的T1代种子置于烟草生根培养基上进行生根培养，7天后将生根后的烟草移栽至土壤中，待其生长至六叶期时进行冷胁迫实验(温度为4℃)，分别在冷胁迫0h，6h，12h，24h四个时间点测定烟草叶片脯氨酸含量，结果如图20所示，在冷胁迫条件下，随着冷胁迫的时间延长，野生型烟草和转LcChi2基因烟草中的脯氨酸含量都成规律性比例递增，但是转LcChi2基因烟草中脯氨酸含量增长幅度明显高于野生型烟草。在逆境条件下(旱、盐碱、热、冷、冻)，植物体内脯氨酸的含量显著增加，植物体内脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，由于脯氨酸亲水性极强，能稳定原生质胶体及组织内的代谢过程，因而能降低凝固点，有防止细胞脱水的作用，在低温条件下，植物组织中脯氨酸增加，可提高植物的抗冷性，因此，亦可作为抗冷育种的生理指标。

(3)转LcChi2基因烟草冷胁迫下丙二醛含量测定

将鉴定为阳性的烟草植株收获的T1代种子置于烟草生根培养基上进行生根培养，7天后将生根后的烟草移栽至土壤中，待其生长至六叶期时进行冷胁迫实验(温度为4℃)，分别在冷胁迫0h，6h，12h，24h四个时间点测定烟草叶片丙二醛含量，结果如图21所示，在冷胁迫条件下，随着冷胁迫的时间延长，野生型烟草和转LcChi2基因烟草中的丙二醛含量都有所增加，但是在冷胁迫12h后，野生型烟草中的丙二醛含量高于转LcChi2基因烟草中的丙二醛含量。植物在逆境下遭受伤害，往往发生膜脂过氧化作用，丙二醛(MDA)是膜脂过氧化的最终分解产物，其含量可以反映植物遭受逆境伤害的程度，丙二醛(MDA)从膜上产生的位置释放出后，可以与蛋白质、核酸反应，从而丧失功能，还可使纤维素分子间的桥键松驰，或抑制蛋白质的合成，因此，丙二醛(MDA)的积累可能对膜和细胞造成一定的伤害。

(4)转LcChi2基因烟草冷胁迫下相对电导率测定

将鉴定为阳性的烟草植株收获的T1代种子置于烟草生根培养基上进行生根培养，7天后将生根后的烟草移栽至土壤中，待其生长至六叶期时进行冷胁迫实验(温度为4℃)，分别在冷胁迫0h，6h，12h，24h四个时间点测定烟草叶片相对电导率，结果如图22所示，在冷胁迫条件下，随着冷胁迫的时间延长，野生型烟草和转LcChi2基因烟草的相对电导率值都有所增加，但是在冷胁迫12h后，野生型烟草的相对电导率值高于转LcChi2基因烟草相对电导率值。在低温胁迫下，膜的生物物理化学状态发生变化，膜质组成和透性开始发生变化，这会导致植物质膜选择透性的改变或丧失，而膜透性的增加与外渗电导率呈正相关，膜透性的测定可作为植物抗冷性研究中的一个生理指标。

上述实施例中，所采用的培养基的基本组成情况如下所示：

酵母SC-U诱导培养基：0.01％(半胱氨酸、精氨酸、亮氨酸、苏氨酸、腺嘌呤)，0.005％(苯丙氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、缬氨酸、酪氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、异亮氨酸、组氨酸)，0.67％酵母氮源，2％半乳糖(过滤除菌)，1％棉子糖(过滤除菌)，0.2％琼脂粉。

YPD培养基：1％ Yeast Extract(酵母膏)，2％ Peptone(蛋白胨)，2％ Dextrose(glucose)(葡萄糖)，2％琼脂粉，10％ 10×Dextrose。

烟草共培养基：选用MS培养基，0.5mg/L 6-BA，0.1mg/L NAA。

烟草筛选培养基：选用MS培养基，0.5mg/L 6-BA，0.1mg/L NAA，20mg/L Kan，500mg/L Cef。

烟草生根培养基：选用MS培养基，0.1mg/L NAA，50mg/L Kan，500mg/L Cef。

PDA培养基：20％马铃薯，2％葡萄糖，2％琼脂。

YEP培养基：5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，5g/L琼脂粉，pH 5.8，高温高压灭菌后加入25mg/L Rif，100mg/L Spe。

玉米筛选培养基II：N6基础盐和维生素，0.69g/L脯氨酸，2mg/L 2，4-D，30g/L蔗糖，8g/L琼脂，pH 5.8，高温高压灭菌后加入250mg/L Cef，0.85mg/L硝酸银，3mg/L双丙氨膦。

玉米暗分化培养基：MS基础盐和维生素，100mg/L肌醇，60g/L蔗糖，3g/L植物凝胶，pH 5.8，高温高压灭菌后加入250mg/L Cef，3mg/L双丙氨膦。

玉米光分化培养基：MS基础盐和维生素，100mg/L肌醇，30g/L蔗糖，3g/L植物凝胶，pH 5.8，高温高压灭菌。

玉米萌发培养基：MS基础盐和维生素，30g/L蔗糖，3g/L植物凝胶，pH 5.8，高温高压灭菌。

玉米生根培养基：MS基础盐和维生素，100mg/L肌醇，30g/L蔗糖，3g/L植物凝胶，pH5.8，高温高压灭菌。

水稻诱导培养基：N6基础盐和维生素，2mg/L 2，4-D，30g/L蔗糖，10g/L葡萄糖，0.5g/L水解酪蛋白，8g/L琼脂，pH 5.8，高温高压灭菌后加入0.5mg/L KT，0.5mg/L NAA。

水稻共培养基：N6基础盐和维生素，2mg/L 2，4-D，30g/L蔗糖，10g/L葡萄糖，0.5g/L水解酪蛋白，8g/L琼脂，pH 5.2，高温高压灭菌后加入200mol/LAS。

水稻筛选培养基：N6基础盐和维生素，2mg/L 2，4-D，30g/L蔗糖，8g/L琼脂，pH5.8，高温高压灭菌后加入0.5mg/L KT，0.5mg/L NAA，潮霉素。

水稻分化培养基：MS基础盐和维生素，30g/L蔗糖，10g/L葡萄糖，0.5g/L水解酪蛋白，3g/L植物凝胶，pH 5.8，高温高压灭菌后加入0.5mg/L KT，2.0mg/L 6-BA，25mg/L潮霉素，300mg/L羧苄青霉素。

水稻生根培养基：MS基础盐和维生素，1.0mg/L Met，30g/L蔗糖，10g/L葡萄糖，0.5g/L水解酪蛋白，3g/L植物凝胶，pH 5.8，高温高压灭菌后加入0.5mg/L KT，2.0mg/L 6-BA，25mg/L潮霉素，300mg/L羧苄青霉素。

MS培养基：MS基础盐和维生素，30g/L蔗糖，3g/L植物凝胶，pH 5.8，高温高压灭菌。

Claims (5)

1.羊草几丁质酶LcChi2基因在提高植物耐冷性方面的应用，其特征在于，所述羊草几丁质酶LcChi2基因的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO:1所示；所述羊草几丁质酶LcChi2基因的核苷酸序列所编码的多肽的氨基酸序列如列表中的SEQ ID NO:2所示；

通过以下方法实现：

(1)将羊草几丁质酶LcChi2基因可操作地连于载体上的表达调控序列后，形成含SEQID NO:1所示核苷酸序列的重组载体；

(2)将步骤(1)获得的重组载体转化宿主植物细胞，经过筛选获得转化细胞；

(3)将步骤(2)获得的转化细胞培育成具有耐冷性的转LcChi2基因植株及其后代；

所述植物为：烟草、水稻或玉米。

2.根据权利要求1所述的羊草几丁质酶LcChi2基因在提高植物耐冷性方面的应用，其特征在于，步骤(1)中，所述载体为植物表达载体pBI121或植物表达载体pCAMBIA3300。

3.根据权利要求1所述的羊草几丁质酶LcChi2基因在提高植物耐冷性方面的应用，其特征在于，步骤(3)中，所述后代包括转LcChi2基因植株种子及转LcChi2基因植株组织。

4.一种培育具有耐冷能力植物的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)将羊草几丁质酶LcChi2基因可操作地连于载体上的表达调控序列后，形成含SEQID NO:1所示核苷酸序列的重组载体；

(2)将步骤(1)获得的重组载体转化宿主植物细胞，经过筛选获得转化细胞；

(3)将步骤(2)获得的转化细胞培育成具有耐冷性的转LcChi2基因植株及其后代；所述后代包括转LcChi2基因植株种子及转LcChi2基因植株组织；

所述植物为：烟草、水稻或玉米。

5.根据权利要求4所述的一种培育具有耐冷能力植物的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述载体为植物表达载体pBI121或植物表达载体pCAMBIA3300。