CN104974142A - 取代三氨基三嗪类分泌型天冬氨酸蛋白酶抑制剂及其制备方法 - Google Patents

取代三氨基三嗪类分泌型天冬氨酸蛋白酶抑制剂及其制备方法 Download PDF

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CN104974142A CN201510323842.5A CN201510323842A CN104974142A CN 104974142 A CN104974142 A CN 104974142A CN 201510323842 A CN201510323842 A CN 201510323842A CN 104974142 A CN104974142 A CN 104974142A
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    • C07D405/02—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings
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Abstract

本发明涉及一种取代三氨基三嗪类化合物，其制备方法和在制药中的应用，所述的化合物的结构通式如下所示，其中:R1为取代的苯环，R2为取代的芳环、萘环或芳香杂环。本发明优点在于：本发明通过基于结构的虚拟筛选和进一步结构改造，合成一种全新的取代三氨基三嗪类化合物；所述化合物是一类全新结构类型的真菌Sap2抑制剂，具有较好的抑酶活性和线虫体内抗真菌活性，为深入研究和开发新结构类型抗真菌药物开辟了新的途径，可用于制备治疗抗真菌感染的药物及与现有抗菌药物联用药物。

Description

取代三氨基三嗪类分泌型天冬氨酸蛋白酶抑制剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体地说，是一种新型的取代三氨基三嗪类分泌型天冬氨酸蛋白酶抑制剂——N2-(呋喃-2-基甲基)-6-[2-(取代-基甲烯基)肼基]-N4-取代-1,3,5-三嗪-2,4-二胺化合物以及制备方法。
背景技术
近年来，侵入性真菌感染的发病率和相关的死亡率已经极大程度上增加。临床上，白念珠菌(致死率：20％～40％)、新型隐球菌(致死率：20％～70％)和烟曲霉菌(致死率：50％～90％)被确证为侵染性真菌感染的三大主要病因。目前，抗真菌药物大体可分为四大类：多烯类(如两性霉素B，作用于真菌细胞膜脂质)、氟胞嘧啶类(如5-氟胞嘧啶，作用于真菌核酸)、唑类(如氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑，作用于羊毛甾醇14α-去甲基化酶)和棘白菌素类(如阿尼芬净、卡泊芬净，作用于真菌细胞壁β-1,3葡聚糖合成酶)。然而，这些抗真菌药物普遍存在抗菌谱窄、副作用强、生物利用度差、易产生耐药性、药物-药物相互作用严重等问题。例如，两性霉素B存在严重的肾毒性副作用，并产生大量一氧化氮，导致神经毒性；唑类化合物的耐药性问题显著；棘白菌素类口服无效，并且对新型隐球菌无效。因此，寻找具有全新作用机制、抗菌谱广、无交叉耐药性的新型抗真菌化学实体成为了抗真菌药物研究中的迫切任务。
大量实验证明，分泌型天冬氨酸蛋白酶(secreted aspartic protease，Sap)是白色念珠菌致病的重要毒力因素，并已经显示了作为抗真菌新靶点的良好前景。Sap2已经被证实具有多种生物学功能，如为自身细胞提供营养、附着和入侵宿主细胞、破坏宿主的保护屏障、损害宿主免疫应激反应等。同时，Sap2小分子抑制剂的研究仍处于起步阶段。
为了发现具有全新结构类型的新型Sap2小分子抑制剂，通过基于结构的虚拟筛选和进一步结构改造，得到N2-(呋喃-2-基甲基)-6-[2-(取代-基甲烯基)肼基]-N4-取代-1,3,5-三嗪-2,4-二胺化合物，其具有Sap2抑酶活性，目前尚未见有该类化合物的合成及其Sap2抑酶活性和线虫体内抗真菌活性的报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种取代三氨基三嗪类化合物。
本发明的第二个目的是，提供所述的三氨基三嗪类化合物的药学上可接受的盐类。
本发明的第三个目的是，提供所述的三氨基三嗪类化合物的制备方法。
本发明的第四个目的是，提供所述的三氨基三嗪类化合物或其药学上可接受的盐类的应用。
为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：一种取代三氨基三嗪类化合物，所述的化合物的结构通式为：
其中:R1为取代的苯环，R2为取代的芳环、萘环或芳香杂环；
(1)苯环、萘环和芳香杂环各种取代基位置位于除去连接位置的其它任何位置，单取代或多取代，取代基指：氢、羟基、氨基、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、硝基、氰基、三氟甲基或卤素；其中，卤素包括F、Cl、Br、I；
(2)取代芳香杂环独立地表示：喹啉、四氢喹啉、异喹啉、四氢异喹啉、吡啶、噻吩、噻唑、吡唑、呋喃、噁唑、异噁唑、哒嗪、吡嗪。
优选的，所述的化合物选自如下所示的化合物：
(1)R1基团为R2基团为
(2)R1基团为R2基团为
(3)R1基团为R2基团为
(4)R1基团为R2基团为
(5)R1基团为R2基团为
(6)R1基团为R2基团为
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(24)R1基团为R2基团为
(25)R1基团为R2基团为
(26)R1基团为R2基团为
(27)R1基团为R2基团为
为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：所述的三氨基三嗪类化合物的药学上可接受的盐类，所述的盐类是所述的化合物的有机碱盐或无机碱盐，无机碱包括但不限于氢氧化钾、氢氧化钠、碳酸钾、碳酸钠，有机碱包括但不限于甲胺、乙胺。
为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：所述的三氨基三嗪类化合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备4,6-二氯-N-(取代)苯基-1,3,5-三嗪-2-胺(Ⅱ)
三聚氯氰(Ⅰ)和(取代)苯胺于丙酮中，冰浴搅拌反应2小时，4,6-二氯-N-(取代)苯基-1,3,5-三嗪-2-胺(Ⅱ)；
(2)制备6-氯-N2-(呋喃-2-基甲基)-N4-(取代)苯基-1,3,5-三嗪-2,4-二胺(Ⅲ)
化合物4,6-二氯-N-(取代)苯基-1,3,5-三嗪-2-胺(Ⅱ)、2-呋喃甲胺及5％的Na2CO3溶液，室温搅拌反应12小时，得到6-氯-N2-(呋喃-2-基甲基)-N4-(取代)苯基-1,3,5-三嗪-2,4-二胺(Ⅲ)；
(3)制备N2-(呋喃-2-基甲基)-6-肼基-N4-(取代)苯基-1,3,5-三嗪-2,4-二胺(Ⅳ)
6-氯-N2-(呋喃-2-基甲基)-N4-(取代)苯基-1,3,5-三嗪-2,4-二胺(Ⅲ)和肼于二氯甲烷中，回流搅拌反应12小时，得到N2-(呋喃-2-基甲基)-6-肼基-N4-(取代)苯基-1,3,5-三嗪-2,4-二胺(Ⅳ)；
(4)制备N2-(呋喃-2-基甲基)-6-[(取代)肼基]-N4-苯基-1,3,5-三嗪-2,4-二胺(Ⅴ)
N2-(呋喃-2-基甲基)-6-肼基-N4-(取代)苯基-1,3,5-三嗪-2,4-二胺(Ⅳ)和不同取代的醛于甲苯中，回流搅拌反应3小时,得到N2-(呋喃-2-基甲基)-6-[(取代)肼基]-N4-苯基-1,3,5-三嗪-2,4-二胺(Ⅴ)；
(5)制备N2-(呋喃-2-基甲基)-6-[(取代)肼基]-N4-(取代)苯基-1,3,5-三嗪-2,4-二胺(VI)
6-氯-N2-(呋喃-2-基甲基)-N4-(4-甲氧苯基)-1,3,5-三嗪-2,4-二胺和不同取代的苯甲醛于甲苯中，回流搅拌反应3小时,得到N2-(呋喃-2-基甲基)-6-[(取代)肼基]-N4-(取代)苯基-1,3,5-三嗪-2,4-二胺(VI)；
(6)制备取代-{2-[(2-{4-[(呋喃-2-基甲基)胺基]-6-[((取代)苯基)胺基]-1,3,5-三嗪-2-基}肼基)甲烯基]苯氧基}乙酸(VII)
N2-(呋喃-2-基甲基)-6-[(取代)肼基]-N4-(4-甲氧苯基)-1,3,5-三嗪-2,4-二胺(VI)和LiOH·H2O于混合溶剂(THF:MeOH:H2O＝3:2:1)中，室温搅拌反应1小时，取代-{2-[(2-{4-[(呋喃-2-基甲基)胺基]-6-[((取代)苯基)胺基]-1,3,5-三嗪-2-基}肼基)甲烯基]苯氧基}乙酸(VII)。
为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是：所述的三氨基三嗪类化合物或其药学上可接受的盐类在制备抗真菌、拓扑异构酶抑制剂、抗肿瘤、抗高血压或抗血栓药物中的应用。
所述的三氨基三嗪类化合物抑制Sap2的活性。
本发明优点在于：
1、本发明通过基于结构的虚拟筛选和进一步结构改造，合成一种全新的取代三氨基三嗪类化合物；
2、本发明所述化合物是一类全新结构类型的真菌Sap2抑制剂，具有较好的抑酶活性和线虫体内抗真菌活性，为深入研究和开发新结构类型抗真菌药物开辟了新的途径，可用于制备治疗抗真菌感染的药物及与现有抗菌药物联用药物。
附图说明
图1.(A)Sap2水解底物原理；(B)FRET-pair吸收和激发波谱。
图2.纯化前后Sap2的SDS-PAGE。M道：标记蛋白；1道：未诱导蛋白；2道：诱导蛋白；3道：纯化重组蛋白。
图3.化合物27对线虫的Kaplan-Meier生存曲线。
具体实施方式
本发明提供一种新型的取代三氨基三嗪类抗真菌化合物，包括N2-(呋喃-2-基甲基)-6-[2-(取代-基甲烯基)肼基]-N4-取代-1,3,5-三嗪-2,4-二胺化合物。
本发明化合物的结构通式如下：
其中：R1为取代的苯环，R2为取代的芳环、萘环或芳香杂环。
(1)苯环、萘环和芳香杂环各种取代基位置可以位于除去连接位置的其它任何位置，可以是单取代，也可以多取代，取代基指：氢、羟基、氨基、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、硝基、氰基、三氟甲基或卤素。其中，卤素包括F、Cl、Br、I。
(2)取代芳香杂环独立地表示：喹啉、四氢喹啉、异喹啉、四氢异喹啉、吡啶、噻吩、噻唑、吡唑、呋喃、噁唑、异噁唑、哒嗪、吡嗪等。
通式化合物优选自R1和R2基团如下的化合物：
(1)R1基团为R2基团为
(2)R1基团为R2基团为
(3)R1基团为R2基团为
(4)R1基团为R2基团为
(5)R1基团为R2基团为
(6)R1基团为R2基团为
(7)R1基团为R2基团为
(8)R1基团为R2基团为
(9)R1基团为R2基团为
(10)R1基团为R2基团为
(11)R1基团为R2基团为
(12)R1基团为R2基团为
(13)R1基团为R2基团为
(14)R1基团为R2基团为
(15)R1基团为R2基团为
(16)R1基团为R2基团为
(17)R1基团为R2基团为
(18)R1基团为R2基团为
(19)R1基团为R2基团为
(20)R1基团为R2基团为
(21)R1基团为R2基团为
(22)R1基团为R2基团为(23)R1基团为R2基团为
(24)R1基团为R2基团为
(25)R1基团为R2基团为
(26)R1基团为R2基团为
(27)R1基团为R2基团为
上述苯并噻唑类化合物可按照常规方法制备为药用盐的形式。包括其有机碱盐及无机碱盐：无机碱包括(但不限于)氢氧化钾、氢氧化钠、碳酸钾、碳酸钠等，有机碱包括(但不限于)甲胺、乙胺等。
本发明化合物的合成反应流程如下：
路线1：
路线2：
具体步骤为：
(1)制备4,6-二氯-N-(取代)苯基-1,3,5-三嗪-2-胺(Ⅱ)
三聚氯氰(Ⅰ)和(取代)苯胺于丙酮中，冰浴搅拌反应2小时，4,6-二氯-N-(取代)苯基-1,3,5-三嗪-2-胺(Ⅱ)；
(2)制备6-氯-N2-(呋喃-2-基甲基)-N4-(取代)苯基-1,3,5-三嗪-2,4-二胺(Ⅲ)
化合物4,6-二氯-N-(取代)苯基-1,3,5-三嗪-2-胺(Ⅱ)、2-呋喃甲胺及5％的Na2CO3溶液，室温搅拌反应12小时，得到6-氯-N2-(呋喃-2-基甲基)-N4-(取代)苯基-1,3,5-三嗪-2,4-二胺(Ⅲ)；
(3)制备N2-(呋喃-2-基甲基)-6-肼基-N4-(取代)苯基-1,3,5-三嗪-2,4-二胺(Ⅳ)
6-氯-N2-(呋喃-2-基甲基)-N4-(取代)苯基-1,3,5-三嗪-2,4-二胺(Ⅲ)和肼于二氯甲烷中，回流搅拌反应12小时，得到N2-(呋喃-2-基甲基)-6-肼基-N4-(取代)苯基-1,3,5-三嗪-2,4-二胺(Ⅳ)；
(4)制备N2-(呋喃-2-基甲基)-6-[(取代)肼基]-N4-苯基-1,3,5-三嗪-2,4-二胺(Ⅴ)
N2-(呋喃-2-基甲基)-6-肼基-N4-(取代)苯基-1,3,5-三嗪-2,4-二胺(Ⅳ)和不同取代的醛于甲苯中，回流搅拌反应3小时,得到N2-(呋喃-2-基甲基)-6-[(取代)肼基]-N4-苯基-1,3,5-三嗪-2,4-二胺(Ⅴ)；
(5)制备N2-(呋喃-2-基甲基)-6-[(取代)肼基]-N4-(取代)苯基-1,3,5-三嗪-2,4-二胺(VI)
6-氯-N2-(呋喃-2-基甲基)-N4-(4-甲氧苯基)-1,3,5-三嗪-2,4-二胺和不同取代的苯甲醛于甲苯中，回流搅拌反应3小时,得到N2-(呋喃-2-基甲基)-6-[(取代)肼基]-N4-(取代)苯基-1,3,5-三嗪-2,4-二胺(VI)；
(6)制备取代-{2-[(2-{4-[(呋喃-2-基甲基)胺基]-6-[((取代)苯基)胺基]-1,3,5-三嗪-2-基}肼基)甲烯基]苯氧基}乙酸(VII)
N2-(呋喃-2-基甲基)-6-[(取代)肼基]-N4-(4-甲氧苯基)-1,3,5-三嗪-2,4-二胺(VI)和LiOH·H2O于混合溶剂(THF:MeOH:H2O＝3:2:1)中，室温搅拌反应1小时，取代-{2-[(2-{4-[(呋喃-2-基甲基)胺基]-6-[((取代)苯基)胺基]-1,3,5-三嗪-2-基}肼基)甲烯基]苯氧基}乙酸(VII)。
下面结合实施例对本发明进行详细描述。但下列实施例不应看作对本发明范围的限制。
表1 优选化合物的化学结构和1H-NMR和MS数据
本发明所述化合物是一类全新结构类型的真菌Sap2抑制剂，具有较好的抑酶活性和线虫体内抗真菌活性，为深入研究和开发新结构类型抗真菌药物开辟了新的途径，可用于制备治疗抗真菌感染的药物及与现有抗菌药物联用药物。
下面结合实施例对本发明进行详细描述。但下列实施例不应看作对本发明范围的限制。
实施例1：制备4,6-二氯-N-苯基-1,3,5-三嗪-2-胺(Ⅱ，R1＝)的制备
将三聚氯氰(9.22g,50mmol,1equiv)溶解于30mL丙酮中，冰浴搅拌至0℃。缓缓滴加溶有苯胺(4.66g,50mmol,1equiv)丙酮溶液20mL。在冰浴下继续搅拌反应2h，之后室温反应2h。反应结束后，加入冰水20mL。待固体析出完全后，抽滤，得到白色固体10.85g，收率:90％。1H-NMR(300MHz,DMSO-d6)δ:11.12(s,1H,NH),7.69(d,2H,J＝2.36,7.95Hz),7.36(d,2H,J＝8.35Hz),7.16(t,1H,J＝7.40Hz).ESI-MS(m/z):239.24[M-1].
实施例2：6-氯-N2-(呋喃-2-基甲基)-N4-苯基-1,3,5-三嗪-2,4-二胺(Ⅲ，R1＝)的制备
将4,6-二氯-N-苯基-1,3,5-三嗪-2-胺(2.41g,10mmol,1equiv)溶解于30mL四氢呋喃中，加入2-呋喃甲胺(0.92mL,10mmol,1equiv)及5％的Na2CO3溶液30mL，室温搅拌反应12h，过滤反应析出固体，水洗2-5次，得到白色固体2.81g，收率:93％。1H-NMR(300MHz,DMSO-d6)δ:10.07(br s,1H,NH),8.59(br s,1H,NH),7.49-7.81(m,3H),7.19-7.38(m,2H),7.02(t,1H,J＝7.18Hz),6.31-6.48(m,1H),6.15-6.30(m,1H),4.48(d,2H,J＝5.05Hz).ESI-MS(m/z):302.49[M+1].
实施例3：N2-(呋喃-2-基甲基)-6-肼基-N4-苯基-1,3,5-三嗪-2,4-二胺(Ⅳ，R1＝)的制备
将6-氯-N2-(呋喃-2-基甲基)-N4-苯基-1,3,5-三嗪-2,4-二胺(1.51g,5mmol,1equiv)溶解于50mL二氯甲烷中，加肼(0.64mL,20mmol,4equiv)回流搅拌反应12h。反应结束后，分别用水50mL，饱和NaCl溶液50mL×2洗涤，无水硫酸钠干燥，溶液加入石油醚100mL，过滤析出固体，得到白色固体0.99g，收率:67％。1H-NMR(300MHz,DMSO-d6)δ:9.03(br s,1H,NH),7.92(br s,1H,NH),7.46-7.83(m,3H),7.24-7.44(br s,2H,NHNH 2 ),7.19(t,2H,J＝7.92Hz),6.88(t,1H,J＝7.07Hz),6.30-6.44(m,1H),6.12-6.29(m,1H),4.46(d,2H,J＝5.21Hz),4.21(br s,1H,NHNH2).ESI-MS(m/z):298.33[M+1].
实施例4：N2-(呋喃-2-基甲基)-6-[2-(萘-1-基甲烯基)肼基]-N4-苯基-1,3,5-三嗪-2,4-二胺(Ⅴ，R1＝R2＝)的制备(表中化合物1)
将N2-(呋喃-2-基甲基)-6-肼基-N4-苯基-1,3,5-三嗪-2,4-二胺(0.30g,0.1mmol,1equiv)溶解于25mL甲苯中，加入1-萘甲醛(0.64mL,20mmol,4equiv)，利用酯水分离器回流搅拌反应3h。反应结束后，减压蒸干溶剂，加入最少量的CH2Cl2溶解固体，向溶液中滴加石油醚，有大量固体析出，过滤，得到白色固体0.28g，收率:65％，m.p.:144-145℃。1H-NMR(500MHz,DMSO-d6)δ:10.94(br s,1H,NH),9.31(br s,1H,NH),8.46-9.06(m,2H),7.95-8.12(m,2H),7.43-7.94(m,8H),7.26(t,2H,J＝7.31Hz),6.96(t,2H,J＝7.01Hz),6.39(s,1H),6.19-6.37(m,1H),4.54(d,2H,J＝4.63Hz).13C-NMR(125MHz,DMSO-d6)δ(ppm):166.28,164.68,153.70,142.25(2C),140.98,134.06,130.81,130.60,130.00,129.17,128.77(2C),127.53,126.60,126.00,124.51,122.06(2C),120.17(2C),110.95,107.18,106.92,37.65.ESI-MS(m/z):436.38[M+1].
实施例5：N2-(呋喃-2-基甲基)-6-[2-(萘-1-基甲烯基)肼基]-N4-苯基-1,3,5-三嗪-2,4-二胺(Ⅴ，R1＝R2＝)的制备(表中化合物22)
将N2-(呋喃-2-基甲基)-6-肼基-N4-(4-甲氧苯基)-1,3,5-三嗪-2,4-二胺(0.51g,0.1mmol,1equiv)溶解于25mL甲苯中，加入2-甲酰基苯氧基醋酸乙酯(0.42mL,20mmol,4equiv)，利用酯水分离器回流搅拌反应3h。反应结束后，减压蒸干溶剂，加入最少量的CH2Cl2溶解固体，向溶液中滴加石油醚，有大量固体析出，过滤，得到白色固体0.35g，收率:72％，m.p.:180-181℃。1H-NMR(500MHz,DMSO-d6)δ:10.94(br s,1H,NH),9.10(br s,1H,NH),8.04(s,1H),7.59-8.05(m,3H),7.57(s,1H),7.46(br s,1H,NH),7.32(t,1H,J＝7.92Hz),7.05(t,1H,J＝6.99Hz),6.97(d,1H,J＝8.86Hz),6.83(d,2H,J＝8.86Hz),6.36-6.43(m,1H),6.17-6.35(m,1H),4.89(s,2H),4.49(s,2H),4.18(dd,2H,J＝7.17,14.32Hz),3.72(s,3H),1.22(t,1H,J＝7.17Hz).13C-NMR(125MHz,DMSO-d6)δ(ppm):169.08,166.22,164.52,156.07,154.73,142.19,138.16,133.96,130.66,125.90,124.23,121.73(2C),113.94(3C),113.23,110.92,107.27,106.82,65.61,61.19,55.63,37.63,14.51.ESI-MS(m/z):518.29[M+1].
实施例6：N2-(呋喃-2-基甲基)-6-[2-(萘-1-基甲烯基)肼基]-N4-苯基-1,3,5-三嗪-2,4-二胺(Ⅴ，R1＝R2＝)的制备(表中化合物25)
将2-{2-[(2-{4-[(呋喃-2-基甲基)胺基]-6-[(4-甲氧基苯基)胺基]-1,3,5-三嗪-2-基}肼基)甲烯基]苯氧基}乙酸乙酯(0.11g,0.22mmol,1equiv)和LiOH·H2O(0.014g,0.33mmol,1.5equiv)于5mL混合溶剂(THF:MeOH:H2O＝3:2:1)中，室温搅拌反应1h。减压蒸干溶剂，加入水(20mL)，1M HCl调节pH至2.0-3.0，有沉淀生成。过滤沉淀，用冷水洗涤，得到白色固体64mg，收率:59％，m.p.:188-189℃。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6+D2O)δ:8.59(s,1H),7.97(d,2H,J＝7.60Hz),7.43-7.71(m,3H),7.28-7.42(m,1H),7.15-6.93(m,2H),7.89(d,2H,J＝8.80Hz),6.41(s,1H),6.34(s,1H),4.78(s,2H),4.52(s,2H),3.77(s,3H).13C-NMR(125MHz,DMSO-d6)δ(ppm):170.44,164.54,158.85,156.75,155.77,142.86,142.42,132.04(2C),126.56,124.14(2C),121.59,114.20(3C),113.25,111.05,107.67(2C),65.43,55.70,37.63.ESI-MS(m/z):490.25[M+1].
实施例中所用试剂均为市售分析纯。
表中化合物2-24以不同的(取代)苯甲醛为合成原料，重复实施例4中的步骤，便能合成所需不同取代三氨基三嗪类化合物；表中化合物25-27重复实施例6中的步骤，便能合成所需不同取代三氨基三嗪类化合物。
实施例7：本发明合成的N2-(呋喃-2-基甲基)-6-[2-(取代-基甲烯基)肼基]-N4-取代-1,3,5-三嗪-2,4-二胺化合物的Sap2抑酶活性
(一)基本原理：
本实验基于荧光发光法测定酶活性，Sap2能够特异性水解氨基酸肽键，如此肽段(H2N-Dabcyl-Arg-Lys-Pro-Ala-Leu-Phe-┆-Phe-Arg-Leu-Glu(EDANS)–Arg-CO2H)两个苯丙氨酸相连肽键可以被其特异性水解。上述肽段为FRET-pair-labeled substrates(fluorescence resonance energy transfer)荧光共振能量转移基团修饰的底物，底物的一端被Dabcyl(4,4-dimethyl aminoazobenzene-4’-carboxylic acid)修饰，另一端有EDANS(5-[(2-aminoethyl)amino]naphthalene-1-sulfonic acid)基团修饰，当EDANS基团受到激发后，其发射波段可以被Dabcyl基团完全吸收，因此，两个基团位于同一底物上时，荧光发光被吸收；当底物被水解，带有EDANS基团的水解底物将会发出非常强的荧光。见图1。
(二)试验材料
底物：H2N-Dabcyl-Arg-Lys-Pro-Ala-Leu-Phe-Phe-Arg-Leu-Glu(EDANS)-Arg-CO2H(吉尔生物化工公司定制)、Sap2酶(南京钟鼎生物技术有限公司原核表达)，见图2。
(三)其它材料
柠檬酸钠缓冲液(50mM,pH 4.5，含NaCl 50mM，自配)
阳性药：Pepstatin A(Sigma)
DMSO：Sigma
黑色不结合平底96孔板：Corning，型号3650。
(四)仪器
仪器：Bioteck Synergy 2多功能酶标仪，Gen5操作软件。
(五)样品配置
底物用DMSO(Sigma)配置成18.75μM浓度的待用溶液；阳性药PepA用DMSO(Sigma)溶解，配置成系列浓度：10μM～0.001nM；其他待测样品用DMSO(Sigma)溶解，配置成系列浓度：100μM～0.01μM。实验单位：共200μL，185μL缓冲液+5μL酶+5μL抑制剂(DMSO溶液)+5μL底物(DMSO溶液)，每个浓度单位为双复孔。Sap2酶用pH 4.5柠檬酸钠缓冲液稀释10倍，室温活化2h。通过水解18.75μM浓度的底物，将酶稀释到100units/min的浓度，此时荧光强度随时间成线性增长，酶的稀释液待用。
(六)试验方法
a)将185μL柠檬酸钠缓冲液、5μL Sap2酶、5μL抑制剂依次加入黑色96孔板，设置双复孔，PepA做阳性对照，未加入抑制剂的DMSO做空白。溶液体系充分混合振荡，30℃孵育30min。
b)加入18.75μM底物5μL，振板混合均匀，以此为时间点，每10min测定化合物荧光发光(λex＝340/30nm,λem＝485/20nm)。
c)根据单位时间荧光发光的增加程度，计算出每个浓度下抑制剂的抑制率％。
d)把每个浓度的抑制率与样品浓度的log值进行非线性拟合，得到活性与剂量的依赖关系，通过软件直接得到IC50值。软件Graphpad prism 5.0，拟合模块：log(inhibitor)vs response--varible slop，将拟合曲线底部和顶部分别设为0和100％。
(七)Sap2抑酶活性
表1.三氨基三嗪类化合物对Sap2的抑酶活性
实施例8：本发明合成的2,2'-[{4-[(2-{4-[(呋喃-2-基甲基)胺基]-6-[(4-甲氧基苯基)胺基]-1,3,5-三嗪-2-基}肼基)甲烯基]-1,3-苯基}二(氧)]双乙酸(化合物27)的线虫体内抗真菌活性
(一)试验材料
1)菌株
白念菌SC5314(C.albicansSC5314)
2)线虫
秀丽隐杆线虫glp-4；sek-1(C.elegans glp-4；sek-1nematodes)
3)培养基
BHI培养基，NGM培养基，LB培养基，YPD培养基，M9缓冲液，线虫裂解液
4)药品
阳性药氟康唑(fluconazole)，PBS缓冲液作阴性对照
(二)试验方法
1)线虫的培养
含大肠杆菌的NGM培养基15℃培养。大肠杆菌：LB液体培养基37℃培养。
2)线虫的同步化
线虫于15℃恒温箱中培养5-6d至育卵，用M9缓冲液冲洗干净，加入裂解液线虫，振荡后收集虫卵；M9缓冲液中孵化24h，得到Ll期幼虫，再转移到NGM培养基上25℃培养3d，得L4期成虫。
3)白念菌线虫感染模型
a)把生长在YPD琼脂培养基上的白念菌挑取单菌落于2mL YPD液体培养基中，30℃培养过夜。次日，取100μL菌液在BHI琼脂培养基上(含卡那霉素45μg/mL)，推出方形菌斑，30℃培养20h。
b)同步化的秀丽隐杆线虫glp-4；sek-1成虫用M9缓冲液冲洗干净，400～500只干净线虫置于白念菌方形菌斑内，25℃培养4h(预留作为空白对照的不染菌线虫)。
c)线虫置于15mL锥形管中用6mL无菌的M9缓冲液仔细冲洗，一共冲洗四次。
d)在12孔组织培养板(Corning)中，每孔加入2mL培养基(含80％M9,20％BHI，45μg/mL卡那霉素)。之后，每孔放入30只线虫进行培养。
e)每组药物浓度梯度为4，8，16，32μg/mL，并设立不加药孔对照。每种处理均设3孔平行对照。将培养板于25℃培养5d，每24h计数各孔线虫存活情况。活线虫形态呈正弦型；死线虫形态呈直线型，无蠕动，铂丝触碰无反应。
f)线虫生存数据采用Kaplan-Meier方法进行作图，log-rank检验进行统计学分析。P<0.05认为有统计学意义，作图分析软件Graphpad prism 5.0。
(三)实验结果
根据Sap2抑酶活性结果，对化合物27测试秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)真菌感染模型体内抗真菌生长活性。氟康唑(fluconazole)作为阳性对照药，使用剂量为实验常用剂量32μg/mL。结果显示，与空白对照比较，化合物27(P＝0.0041)对白念菌感染的线虫均表现出一定保护作用(图3)。
上述实验结果表明，部分三氨基三嗪类化合物具有较优Sap2抑酶活性，本发明所述化合物中高抑酶活性化合物具有线虫体内抗真菌活性，说明本类化合物可用于制备治疗抗真菌感染的药物。
本发明所述取代三氨基三嗪类化合物是一类新结构类型的Sap2抑制剂和抗真菌活性化合物，本发明为深入研究和开发新的抗真菌药物开辟了新的途径。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种取代三氨基三嗪类化合物，其特征在于，所述的化合物的结构通式为：
其中:R1为取代的苯环，R2为取代的芳环、萘环或芳香杂环；
(1)苯环、萘环和芳香杂环各种取代基位置位于除去连接位置的其它任何位置，单取代或多取代，取代基指：氢、羟基、氨基、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、硝基、氰基、三氟甲基或卤素；其中，卤素包括F、Cl、Br、I；
(2)取代芳香杂环独立地表示：喹啉、四氢喹啉、异喹啉、四氢异喹啉、吡啶、噻吩、噻唑、吡唑、呋喃、噁唑、异噁唑、哒嗪、吡嗪。
2.根据权利要求1所述的三氨基三嗪类化合物，其特征在于，所述的化合物选自如下所示的化合物：
(1)R1基团为R2基团为
(2)R1基团为R2基团为
(3)R1基团为R2基团为
(4)R1基团为R2基团为
(5)R1基团为R2基团为
(6)R1基团为R2基团为
(7)R1基团为R2基团为
(8)R1基团为R2基团为
(9)R1基团为R2基团为
(10)R1基团为R2基团为
(11)R1基团为R2基团为(12)R1基团为R2基团为
(13)R1基团为R2基团为
(14)R1基团为R2基团为
(15)R1基团为R2基团为
(16)R1基团为R2基团为(17)R1基团为R2基团为
(18)R1基团为R2基团为
(19)R1基团为R2基团为
(20)R1基团为R2基团为
(21)R1基团为R2基团为
(22)R1基团为R2基团为
(23)R1基团为R2基团为
(24)R1基团为R2基团为
(25)R1基团为R2基团为
(26)R1基团为R2基团为
(27)R1基团为R2基团为
3.根据权利要求1或2任一所述的三氨基三嗪类化合物的药学上可接受的盐类，其特征在于，所述的盐类是所述的化合物的有机碱盐或无机碱盐，无机碱包括但不限于氢氧化钾、氢氧化钠、碳酸钾、碳酸钠，有机碱包括但不限于甲胺、乙胺。
4.根据权利要求1所述的三氨基三嗪类化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备4,6-二氯-N-(取代)苯基-1,3,5-三嗪-2-胺(Ⅱ)
三聚氯氰(Ⅰ)和(取代)苯胺于丙酮中，冰浴搅拌反应2小时，4,6-二氯-N-(取代)苯基-1,3,5-三嗪-2-胺(Ⅱ)；
(2)制备6-氯-N2-(呋喃-2-基甲基)-N4-(取代)苯基-1,3,5-三嗪-2,4-二胺(Ⅲ)
化合物4,6-二氯-N-(取代)苯基-1,3,5-三嗪-2-胺(Ⅱ)、2-呋喃甲胺及5％的Na2CO3溶液，室温搅拌反应12小时，得到6-氯-N2-(呋喃-2-基甲基)-N4-(取代)苯基-1,3,5-三嗪-2,4-二胺(Ⅲ)；
(3)制备N2-(呋喃-2-基甲基)-6-肼基-N4-(取代)苯基-1,3,5-三嗪-2,4-二胺(Ⅳ)
6-氯-N2-(呋喃-2-基甲基)-N4-(取代)苯基-1,3,5-三嗪-2,4-二胺(Ⅲ)和肼于二氯甲烷中，回流搅拌反应12小时，得到N2-(呋喃-2-基甲基)-6-肼基-N4-(取代)苯基-1,3,5-三嗪-2,4-二胺(Ⅳ)；
(4)制备N2-(呋喃-2-基甲基)-6-[(取代)肼基]-N4-苯基-1,3,5-三嗪-2,4-二胺(Ⅴ)
N2-(呋喃-2-基甲基)-6-肼基-N4-(取代)苯基-1,3,5-三嗪-2,4-二胺(Ⅳ)和不同取代的醛于甲苯中，回流搅拌反应3小时,得到N2-(呋喃-2-基甲基)-6-[(取代)肼基]-N4-苯基-1,3,5-三嗪-2,4-二胺(Ⅴ)；
(5)制备N2-(呋喃-2-基甲基)-6-[(取代)肼基]-N4-(取代)苯基-1,3,5-三嗪-2,4-二胺(VI)
6-氯-N2-(呋喃-2-基甲基)-N4-(4-甲氧苯基)-1,3,5-三嗪-2,4-二胺和不同取代的苯甲醛于甲苯中，回流搅拌反应3小时,得到N2-(呋喃-2-基甲基)-6-[(取代)肼基]-N4-(取代)苯基-1,3,5-三嗪-2,4-二胺(VI)；
(6)制备取代-{2-[(2-{4-[(呋喃-2-基甲基)胺基]-6-[((取代)苯基)胺基]-1,3,5-三嗪-2-基}肼基)甲烯基]苯氧基}乙酸(VII)
N2-(呋喃-2-基甲基)-6-[(取代)肼基]-N4-(4-甲氧苯基)-1,3,5-三嗪-2,4-二胺(VI)和LiOH·H2O于混合溶剂(THF:MeOH:H2O＝3:2:1)中，室温搅拌反应1小时，取代-{2-[(2-{4-[(呋喃-2-基甲基)胺基]-6-[((取代)苯基)胺基]-1,3,5-三嗪-2-基}肼基)甲烯基]苯氧基}乙酸(VII)。
5.根据权利要求1或2任一所述的三氨基三嗪类化合物或权利要求3所述的化合物的药学上可接受的盐类在制备抗真菌、拓扑异构酶抑制剂、抗肿瘤、抗高血压或抗血栓药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的三氨基三嗪类化合物抑制Sap2的活性。
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