CN104971062B - 伊立替康类药物和氯喹类药物组合及其共载脂质体和制备 - Google Patents
伊立替康类药物和氯喹类药物组合及其共载脂质体和制备 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种伊立替康类药物和氯喹类药物组合及其共载脂质体和制备。伊立替康类药物和氯喹类药物组合中伊立替康类药物和氯喹类药物的质量比为1‑100：1‑100。伊立替康类药物和氯喹类药物共载脂质体，由药物、磷脂、胆固醇类化合物和水相介质制成；其中，药物、磷脂和胆固醇类化合物的重量比为1：2‑100：0.8‑35；所述的药物为伊立替康类药物和氯喹类药物。利用伊立替康类药物和氯喹类药物的协同作用，增强了伊立替康类药物对结肠癌敏感株细胞的杀伤作用。所述的共载脂质体的制备方法采用pH梯度法或硫酸铵梯度法，制备工艺简单，控制的参数较少，反应条件较低，有利于降低生产成本，易于工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及药物组合及其脂质体类药剂技术领域，特别涉及一种伊立替康类药物和氯喹类药物组合及其共载脂质体和制备。
背景技术
近些年来，在肿瘤化疗领域，研究者发现单独使用一种化疗药物很少能取得较好的抑瘤效果，因此，肿瘤药物的联合治疗逐渐成为科研工作者们研究的热点，而具有协同作用的两种药物利用纳米载体共同传递，从而靶向到体内的病变部位也被认为是具有极大潜力的肿瘤治疗手段，共载化疗药物的纳米制剂，例如阿糖胞苷和柔红霉素共载脂质体，甚至已经进入到了临床实验阶段(First-in-man study of CPX-351:aliposomal carriercontaining cytarabine and daunorubicin in a fixed 5:1molar ratio for thetreatment of relapsed and refractory acute 5myeloid leukemia,[J]Journal ofClinical Oncology,2011,Vol.29,979-985)。脂质体作为一种化疗药物载体被广泛使用，它不仅可以改善药物体内分布，并能显著增加药物的抗癌效率，同时减少对正常细胞的毒性，药物用脂质体包裹后，能靶向作用于病变部位，从而提高药物的治疗指数，同时还可以减少药物的治疗剂量，降低全身不良反应，提高用药安全性。
伊立替康(Irinotecan,CPT-11)是一种水溶性的喜树碱衍生物，在临床上广泛应用于结肠癌，小细胞肺癌等恶性癌症。目前，伊立替康脂质体也已经应用于临床。现有的伊立替康脂质体也有多种，例如：中国专利ZL201310028546.3公开了一种伊立替康或盐酸伊立替康脂质体及其制备方法；该脂质体含有伊立替康或盐酸伊立替康、中性磷脂以及胆固醇，胆固醇与中性磷脂的重量比例为1:3-5，其通过离子梯度法制备得到。中国专利申请CN201310055065.1公开了一种盐酸伊立替康组合物；其包括空白脂质纳米制剂、盐酸伊立替康溶液和pH调节溶液；所述空白脂质纳米制剂、盐酸伊立替康溶液和pH调节溶液各自独立包装，临床使用前将三种组分混合孵育通过主动载药制成临床载药纳米制剂；其采用三瓶独立包装的设计，贮存过程中药物并未载入脂质纳米制剂中，故该制剂不存在现有制剂药物易泄漏的问题，大大提高了该制剂的稳定性；临床使用前，将三种成分混合孵育制成载药纳米制剂，临床使用简单方便。这些脂质体均是单纯伊立替康类药物的脂质体。
最近几年，研究者们发现，伊立替康与其他药物联合使用时，可以取得更好的治疗效果，例如伊立替康和阿霉素的联合处方被建议在临床实验中使用(Phase II study ofirinotecan plus doxorubicin for early recurrent or platinum-refractoryovarian cancer:interim analysis.[J]International journal of GynecologyCancer,2007,Vol 17,159-163)。伊立替康和舒尼替尼共载的脂质体可以通过后者抑制肿瘤血管生长的作用从而增强前者的抗肿瘤效(A combination of liposomal sunitinibplus liposomal irinotecan and liposome co-loaded with two drugs enhancedantitumor activity in PC12-bearing mouse.[J]Journal of Drug Targeting,2012,Vol 10,873-882)。
氯喹(Chloroquine,CQ)是一种传统的用于预防和治疗疟原虫感染的药物。近几年来，研究者们发现氯喹可通过多种作用机制安全有效地增强化疗药物的抑瘤效果，如抑制细胞膜上的外排泵，介导细胞分化和诱导凋亡，抑制细胞内自噬反应等(Chloroquine andits analogs:A new promise of an old drug for effective and safe cancertherapies.[J]European journal of pharmacology,2009,Vol 625,220-233)。
中国专利ZL 201110025330.2公开了一种氯喹和阿霉素共载脂质体，由药物、磷脂、胆固醇类化合物、内部缓冲系统和pH值调节剂制成；其中，药物、磷脂和胆固醇类化合物的重量比为1∶2-100∶1-35；所述的药物为氯喹类药物和阿霉素类药物；利用氯喹和阿霉素的协同作用，使氯喹和阿霉素共载脂质体具有抑制多药耐药性和降低用药毒性的特点。中国专利ZL 201210336602.5公开了一种氯喹类药物和紫杉醇类药物共载脂质体，由药物、磷脂、胆固醇类化合物、内部缓冲系统和pH值调节剂制成；其中，药物、磷脂和胆固醇类化合物的质量比为1：2-125：1-45；所述的药物为氯喹类药物和紫杉醇类药物；利用氯喹类药物和紫杉醇类药物的协同作用，使氯喹类药物和紫杉醇类药物共载脂质体具有抑制多药耐药性和降低用药毒性的特点。上述文献记载了水溶性药物阿霉素(DOX)或疏水性药物紫杉醇(PTX)均能与氯喹共载在耐药株上取得较好的逆转耐药的效果，但在敏感株细胞上没有显示出协同作用。下面用PTX+CQ对敏感株细胞的具体数据来说明，PTX+CQ对敏感株的细胞毒性(IC50)及联合指数(Combination Index,CI)见表1：
表1
| A549/IC50(μg/ml) | CI | |
| 游离PTX | 0.013 | / |
| 游离CQ | 15.257 | / |
| PTX脂质体 | 0.005 | / |
| CQ脂质体 | 4.330 | / |
| PCL 1:2 | 0.0271 | 5.50 |
| PCL 1:5 | 0.0274 | 5.68 |
表1中，游离PTX为中国专利ZL 201210336602.5中对照组1的紫杉醇注射剂泰素；游离CQ为中国专利ZL 201210336602.5中对照组2的游离磷酸氯喹水溶液；PTX脂质体为中国专利ZL 201210336602.5中对比例1中的紫杉醇脂质体；CQ脂质体为中国专利ZL201210336602.5中对比例2中的氯喹脂质体；PCL1:2为中国专利ZL 201210336602.5中实施例14中的紫杉醇与氯喹共载脂质体，其中，紫杉醇与氯喹的投料质量比为1:2；PCL1:5为中国专利ZL 201210336602.5中实施例16中的紫杉醇与氯喹共载脂质体，其中，紫杉醇与氯喹的投料质量比为1:5。
表1中的CI值远远大于1，为拮抗作用，说明PTX+CQ对A549敏感株没有联合作用。
虽然伊立替康与阿霉素或舒尼替尼的联合使用，取得了更好的治疗效果，但伊立替康与氯喹的联合使用却未见报道。
发明内容
本发明提供了一种伊立替康类药物和氯喹类药物组合，利用伊立替康类药物和氯喹类药物的协同作用，增强了伊立替康类药物对结肠癌敏感株细胞的杀伤作用。
本发明还提供了一种载体选择面广、药物包封率高的伊立替康类药物和氯喹类药物共载脂质体，利用伊立替康类药物和氯喹类药物的协同作用，增强了伊立替康类药物对结肠癌敏感株细胞的杀伤作用，同时，保护了伊立替康类药物内酯环在体内环境的稳定性，并降低了药物用量以及氯喹类药物以游离形式使用时不可忽视的毒性。
一种伊立替康类药物和氯喹类药物组合，所述的伊立替康类药物和氯喹类药物的质量比为1-100：1-100。优选的，所述的伊立替康类药物和氯喹类药物的质量比为1：0.5-5，进一步优选为1：2-5。
本发明发现，用伊立替康类药物和氯喹类药物组合作用于结肠癌敏感株细胞时，IC50值显著降低，细胞毒性明显增强。
一种伊立替康类药物和氯喹类药物共载脂质体，由药物、磷脂、胆固醇类化合物和水相介质制成；其中，药物、磷脂和胆固醇类化合物的质量比为1：2-100：0.8-35；所述的药物为伊立替康类药物和氯喹类药物；所述的伊立替康类药物和氯喹类药物的质量比为1-100：1-100。
本发明发现，用伊立替康类药物和氯喹类药物共载脂质体作用于结肠癌敏感株细胞时，IC50值显著降低，细胞毒性明显增强。表明利用脂质体共载伊立替康类药物和氯喹类药物是一种有效的治疗恶性癌症的手段，脂质体一方面可以保护伊立替康类药物内酯环在体内环境中的稳定性，另一方面可以利用纳米制剂的EPR效应(Enhanced Permeabilityand Retention effect)，运送两种药物至靶部位发挥协同抗癌作用。
优选的，所述的药物、磷脂和胆固醇类化合物的质量比为1：2-50：0.8-12.5；进一步优选为药物、磷脂和胆固醇类化合物的质量比为1：2-20：0.8-5。
所述的伊立替康类药物和氯喹类药物为主要的药效成分，伊立替康类药物和氯喹类药物的比例可以根据实际需要在本发明范围内任意调整，优选的，伊立替康类药物和氯喹类药物的质量比为1：0.5-5，进一步优选为1：2-5。
所述的伊立替康类药物包括伊立替康、伊立替康与酸所成的盐中一种或多种。所述的伊立替康与酸所成的盐可选用盐酸伊立替康。
所述的氯喹类药物包括氯喹、氯喹与酸所成的盐中的一种或多种。所述的氯喹与酸所成的盐可选用磷酸氯喹、盐酸氯喹、硫酸氯喹中的一种或多种。
所述的磷脂可选用天然磷脂、合成磷脂中的一种或两种。所述的天然磷脂为大豆磷脂、卵磷脂中的一种或两种。所述的合成磷脂为中性磷脂、负电性磷脂、聚乙二醇修饰磷脂中的一种或两种以上。所述的合成磷脂具体可选用二豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二棕榈酰磷脂酰甘油酯(DPPG)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰丝氨酸(PS)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)中的一种或两种以上。
所述的胆固醇类化合物选用普通胆固醇、聚乙二醇(PEG)修饰的胆固醇中的一种或者两种。所述的聚乙二醇(PEG)修饰的胆固醇选用聚乙二醇单甲醚胆固醇琥珀酸酯(CHS-PEG)。
所述的水相介质选用硫酸铵水溶液。优选的，所述的硫酸铵水溶液的浓度为0.05mol/L-0.5mol/L。
伊立替康和氯喹都是弱碱性的亲水性药物，可以采用pH梯度法或硫酸铵梯度法同时包载，这给共载制剂的制备提供了极大的便利性。本发明还提供了一种伊立替康类和氯喹类药物共载脂质体的制备方法，采用硫酸铵梯度法将伊立替康类和氯喹类药物装载入脂质体，制备工艺简单、条件温和、控制参数较少，有利于降低生产成本，易于工业化生产。
所述的伊立替康类和氯喹类药物共载脂质体的制备方法，包括以下步骤：
(1)将磷脂和胆固醇类化合物溶于有机溶剂中，混合均匀，除去有机溶剂，形成薄膜，再加入水相介质硫酸铵水溶液混合均匀，充分水化后经粉碎、均一粒径，得到空白脂质体悬液；
(2)将步骤(1)中的空白脂质体悬液以蒸馏水为透析介质，透析4h-20h，造成硫酸铵梯度，得到空白脂质体；
(3)将伊立替康类药物和氯喹类药物加入到空白脂质体中，经水浴孵育后冷却，分离出游离药物，得到伊立替康类药物和氯喹类药物共载脂质体。
步骤(1)中，所述的有机溶剂选用无水乙醇或者氯仿(三氯甲烷)。
所述的水化的条件优选为在30℃-50℃的水浴中水化30min-60min。
所述的粉碎可通过高压匀乳、超声或微射流进行粉碎，得到粒径低于200nm的空白脂质体悬液。
步骤(3)中，所述的伊立替康类药物和氯喹类药物可以先用适量的水或者水性溶剂溶解后再加入到空白脂质体中。
分离出游离药物的方法可采用Sephadex G-50凝胶柱层析法或透析法。
所述的水浴孵育的条件优选为在30℃-50℃的水浴中孵育10min-60min。
所述的伊立替康类药物和氯喹类药物组合、伊立替康类药物和氯喹类药物共载脂质体可作为抗癌药物治疗癌症等疾病，对肿瘤细胞具有较高的杀伤力。
本发明采用动态光散射粒径仪(Malvern Zetasizer Nano-S90，英国)检测粒径。
本发明具有如下优点：
(1)在氯喹的毒性范围内(<20μg/mL)，伊立替康类药物和氯喹类药物组合、伊立替康类药物和氯喹类药物共载脂质体随着氯喹类药物的量的增多，IC50降低。
(2)伊立替康类药物和氯喹类药物组合、伊立替康类药物和氯喹类药物共载脂质体使伊立替康类药物和氯喹类药物协同作用，从而提高了对肿瘤细胞的杀伤力，并且伊立替康类药物和氯喹类药物的协同作用相对可以减少药物的使用量，减小了毒副作用。
(3)由于伊立替康和氯喹都是弱碱性的亲水性药物，可以采用硫酸铵梯度法同时包载，这使得共载制剂的制备方法操作简便，且包封率高，可控性和重现性好。
(4)通过本发明方法制得的伊立替康类药物和氯喹类药物共载脂质体，药物包封率可达到70％以上，平均粒径在100nm左右(如78.9nm-91.0nm)，具有包封率高、稳定性好、成本低等优点。本发明制备方法，制备工艺简单，控制的参数较少，反应条件较低，有利于降低生产成本，易于工业化生产。
(5)本发明磷脂选择面广，可使用天然卵磷脂或大豆磷脂，也可使用合成的中性磷脂或负电性磷脂。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为对本发明权利范围的限制。
空白脂质体的制备
实施例1
称取500mg大豆磷脂(磷脂酰胆碱纯度>76％)和100mg胆固醇溶解于6mL无水乙醚中，充分溶解后混合均匀，然后减压蒸去有机溶剂乙醚，使磷脂等成膜材料在烧瓶底部形成均匀脂膜，然后加入5mL 0.2mol/L的硫酸铵水溶液，50℃水浴旋蒸水化30min，涡旋5min，再用细胞粉碎仪超声10min，均一粒径，将超声后的空白脂质体悬液转移至透析袋中以蒸馏水为透析介质透析6h以除去外水相中的硫酸铵，造成硫酸铵梯度，得到5mL空白脂质体，备用。测得该空白脂质体的平均粒径(数均)为78.6nm。
实施例2
称取400mg卵磷脂(磷脂酰胆碱纯度>76％)和120mg胆固醇溶解于6mL无水乙醚中，充分溶解后混合均匀，然后减压蒸去有机溶剂乙醚，使磷脂等成膜材料在烧瓶底部形成均匀脂膜，然后加入5mL 0.3mol/L的硫酸铵水溶液，50℃水浴旋蒸水化30min，涡旋5min，再用细胞粉碎仪超声10min，均一粒径，将超声后的空白脂质体悬液转移至透析袋中以蒸馏水为透析介质透析10h以除去外水相中的硫酸铵，造成硫酸铵梯度，得到5mL空白脂质体，备用。测得该空白脂质体的平均粒径(数均)为69.4nm。
实施例3
称取2000mg大豆磷脂(磷脂酰胆碱纯度>76％)、1000mgDMPC(磷脂酰胆碱纯度>76％)和750mg胆固醇溶解于6mL无水乙醚中，充分溶解后混合均匀，然后减压蒸去有机溶剂乙醚，使磷脂等成膜材料在烧瓶底部形成均匀脂膜，然后加入5mL 0.4mol/L的硫酸铵水溶液，50℃水浴旋蒸水化30min，涡旋5min，再用细胞粉碎仪超声10min，均一粒径，将超声后的空白脂质体悬液转移至透析袋中以蒸馏水为透析介质透析15h以除去外水相中的硫酸铵，造成硫酸铵梯度，得到5mL空白脂质体，备用。测得该空白脂质体的平均粒径(数均)为88.6nm。
实施例4
称取240mg DPPC(磷脂酰胆碱纯度>76％)和120mg CHS-PEG溶解于6mL无水乙醚中，充分溶解后混合均匀，然后减压蒸去有机溶剂乙醚，使磷脂等成膜材料在烧瓶底部形成均匀脂膜，然后加入5mL 0.5mol/L的硫酸铵水溶液，50℃水浴旋蒸水化30min，涡旋5min，再用细胞粉碎仪超声10min，均一粒径，将超声后的空白脂质体悬液转移至透析袋中以蒸馏水为透析介质透析20h以除去外水相中的硫酸铵，得到造成硫酸铵梯度，得到5mL空白脂质体，备用。测得该空白脂质体的平均粒径(数均)为85.9nm。
实施例5
称取200mg DSPC(磷脂酰胆碱纯度>76％)、400mgPS、200mg胆固醇和100mgCHS-PEG溶解于6mL无水乙醚中，充分溶解后混合均匀，然后减压蒸去有机溶剂乙醚，使磷脂等成膜材料在烧瓶底部形成均匀脂膜，然后加入5mL 0.1mol/L的硫酸铵水溶液，50℃水浴旋蒸水化30min，涡旋5min，再用细胞粉碎仪超声10min，均一粒径，将超声后的空白脂质体悬液转移至透析袋中以蒸馏水为透析介质透析8h以除去外水相中的硫酸铵，造成硫酸铵梯度，得到5mL空白脂质体，备用。测得该空白脂质体的平均粒径(数均)为73.4nm。
实施例6
称取600mgDPPG(磷脂酰胆碱纯度>76％)、1200mgPE、1200mgDSPE-PEG和1050mg胆固醇溶解于6mL无水乙醚中，充分溶解后混合均匀，然后减压蒸去有机溶剂乙醚，使磷脂等成膜材料在烧瓶底部形成均匀脂膜，然后加入5mL 0.05mol/L的硫酸铵水溶液，50℃水浴旋蒸水化30min，涡旋5min，再用细胞粉碎仪超声10min，均一粒径，将超声后的空白脂质体悬液转移至透析袋中以蒸馏水为透析介质透析4h以除去外水相中的硫酸铵，造成硫酸铵梯度，得到5mL空白脂质体，备用。测得该空白脂质体的平均粒径(数均)为72.8nm。
氯喹类药物与伊立替康类药物共载脂质体
实施例7
将盐酸伊立替康与磷酸氯喹质量比为1：0.5的盐酸伊立替康与磷酸氯喹的混合水溶液(其中，伊立替康0.02g)加入到实施例1的5mL空白脂质体中，之后在50℃的水浴中孵育10min，冷却到室温后，用SephadexG-50凝胶柱层析法分离脂质体和未被包封在内的游离药物，得到盐酸伊立替康与磷酸氯喹共载脂质体，测得盐酸伊立替康与磷酸氯喹的包封率分别为100％、100％，载药量分别为3.17％、1.59％，共载脂质体的平均粒径(数均)为88.2nm。
实施例8
将盐酸伊立替康与磷酸氯喹质量比为1：1的盐酸伊立替康与磷酸氯喹的混合水溶液(其中，伊立替康0.02g)加入到实施例1的5mL空白脂质体中，之后在50℃的水浴中孵育10min，冷却到室温后，用SephadexG-50凝胶柱层析法分离脂质体和未被包封在内的游离药物，得到盐酸伊立替康与磷酸氯喹共载脂质体，测得盐酸伊立替康与磷酸氯喹的包封率分别为92.3％、93.8％，载药量分别为2.88％、2.93％，共载脂质体的平均粒径(数均)为89.5nm。
实施例9
将盐酸伊立替康与磷酸氯喹质量比为1：2的盐酸伊立替康与磷酸氯喹的混合水溶液(其中，伊立替康0.02g)加入到实施例1的5mL空白脂质体中，之后在50℃的水浴中孵育10min，冷却到室温后，用SephadexG-50凝胶柱层析法分离脂质体和未被包封在内的游离药物，得到盐酸伊立替康与磷酸氯喹共载脂质体，测得盐酸伊立替康与磷酸氯喹的包封率分别为83.8％、85.4％，载药量分别为2.53％、5.18％，共载脂质体的平均粒径(数均)为91.0nm。
实施例10
将盐酸伊立替康与磷酸氯喹质量比为1：3的盐酸伊立替康与磷酸氯喹的混合水溶液(其中，伊立替康0.02g)加入到实施例1的5mL空白脂质体中，之后在50℃的水浴中孵育10min，冷却到室温后，用SephadexG-50凝胶柱层析法分离脂质体和未被包封在内的游离药物，得到盐酸伊立替康与磷酸氯喹共载脂质体，测得盐酸伊立替康与磷酸氯喹的包封率分别为73.5％、71.7％，载药量分别为2.16％、6.32％，共载脂质体的平均粒径(数均)为86.6nm。
实施例11
将盐酸伊立替康与磷酸氯喹质量比为1：5的盐酸伊立替康与磷酸氯喹的混合水溶液(其中，伊立替康0.02g)加入到实施例1的5mL空白脂质体中，之后在50℃的水浴中孵育10min，冷却到室温后，用SephadexG-50凝胶柱层析法分离脂质体和未被包封在内的游离药物，得到盐酸伊立替康与磷酸氯喹共载脂质体，测得盐酸伊立替康与磷酸氯喹的包封率分别为70.2％、67.8％，载药量分别为1.95％、9.42％，共载脂质体的平均粒径(数均)为86.6nm。
实施例12
将盐酸伊立替康与盐酸氯喹质量比为1：2的盐酸伊立替康与盐酸氯喹的混合水溶液(其中，伊立替康0.02g)加入到实施例2的5mL空白脂质体中，之后在50℃的水浴中孵育10min，冷却到室温后，用SephadexG-50凝胶柱层析法分离脂质体和未被包封在内的游离药物，得到盐酸伊立替康与盐酸氯喹共载脂质体，测得盐酸伊立替康与盐酸氯喹的包封率分别为75.6％、74.7％，载药量分别为2.61％、5.15％，共载脂质体的平均粒径(数均)为78.9nm。
实施例13
将盐酸伊立替康与硫酸氯喹质量比为1：2的盐酸伊立替康与硫酸氯喹的混合水溶液(其中，伊立替康0.02g)加入到实施例3的5mL空白脂质体中，之后在50℃的水浴中孵育10min，冷却到室温后，用SephadexG-50凝胶柱层析法分离脂质体和未被包封在内的游离药物，得到盐酸伊立替康与硫酸氯喹共载脂质体，测得盐酸伊立替康与硫酸氯喹的包封率分别为95.8％、97.6％，载药量分别为0.50％、1.02％，共载脂质体的平均粒径(数均)为85.1nm。
实施例14
将盐酸伊立替康与盐酸氯喹质量比为1：5的盐酸伊立替康与盐酸氯喹的混合水溶液(其中，伊立替康0.02g)加入到实施例4的5mL空白脂质体中，之后在30℃的水浴中孵育60min，冷却到室温后，用SephadexG-50凝胶柱层析法分离脂质体和未被包封在内的游离药物，得到盐酸伊立替康与盐酸氯喹共载脂质体，测得盐酸伊立替康与盐酸氯喹的包封率分别为83.5％、76.7％，载药量分别为3.48％、9.13％，共载脂质体的平均粒径(数均)为84.9nm。
实施例15
将盐酸伊立替康与盐酸氯喹质量比为1：2的盐酸伊立替康与盐酸氯喹的混合水溶液(其中，盐酸伊立替康0.02g)加入到实施例5的5mL空白脂质体中，之后在40℃的水浴中孵育30min，冷却到室温后，用SephadexG-50凝胶柱层析法分离脂质体和未被包封在内的游离药物，得到盐酸伊立替康与盐酸氯喹共载脂质体，测得盐酸伊立替康与盐酸氯喹的包封率分别为72.3％、75.2％，载药量分别为1.51％、3.13％，共载脂质体的平均粒径(数均)为81.8nm。
实施例16
将盐酸伊立替康与硫酸氯喹质量比为1：0.5的盐酸伊立替康和硫酸氯喹的混合水溶液(其中，盐酸伊立替康0.02g)加入到实施例6的5mL空白脂质体中，之后在50℃的水浴中孵育20min，冷却到室温后，用SephadexG-50凝胶柱层析法分离脂质体和未被包封在内的游离药物，得到盐酸伊立替康与硫酸氯喹共载脂质体，测得盐酸伊立替康和硫酸氯喹的包封率分别为95.6％、98.7％，载药量分别为0.47％、0.24％，共载脂质体的平均粒径(数均)为82.6nm。
实施例17
将盐酸伊立替康与磷酸氯喹质量比为1：0.5的盐酸伊立替康与磷酸氯喹混合，其中盐酸伊立替康0.02g，得到盐酸伊立替康与磷酸氯喹组合。
实施例18
将盐酸伊立替康与磷酸氯喹质量比为1：1的盐酸伊立替康与磷酸氯喹混合，其中盐酸伊立替康0.02g，得到盐酸伊立替康与磷酸氯喹组合。
实施例19
将盐酸伊立替康与磷酸氯喹质量比为1：2的盐酸伊立替康与磷酸氯喹混合，其中盐酸伊立替康0.02g，得到盐酸伊立替康与磷酸氯喹组合。
实施例20
将盐酸伊立替康与磷酸氯喹质量比为1：3的盐酸伊立替康与磷酸氯喹混合，其中盐酸伊立替康0.02g，得到盐酸伊立替康与磷酸氯喹组合。
实施例21
将盐酸伊立替康与磷酸氯喹质量比为1：5的盐酸伊立替康与磷酸氯喹混合，其中盐酸伊立替康0.02g，得到盐酸伊立替康与磷酸氯喹组合。
对比例1
将盐酸伊立替康0.02g加入到实施例1的5mL空白脂质体中，之后在50℃的水浴中孵育10min，冷却到室温后，用SephadexG-50凝胶柱层析法分离脂质体和未被包封在内的游离药物，得到盐酸伊立替康脂质体，测得盐酸伊立替康的包封率为99.1％，载药量为4.61％，脂质体的平均粒径(数均)为79.2nm。
对比例2
将磷酸氯喹0.02g加入到实施例1的5mL空白脂质体中，之后在50℃的水浴中孵育10min，冷却到室温后，用SephadexG-50凝胶柱层析法分离脂质体和未被包封在内的游离药物，得到磷酸氯喹脂质体，测得磷酸氯喹的包封率为97.4％，载药量为3.53％，脂质体的平均粒径(数均)为68.0nm。
细胞毒性对比实验
将作为对照组1的游离盐酸伊立替康水溶液(1mg/mL)、作为对照组2的游离磷酸氯喹水溶液(1mg/mL)、对比例制备的脂质体、实施例制备的各种盐酸伊立替康和氯喹类药物不同比例的脂质体以及实施例中各种盐酸伊立替康和氯喹类药物不同比例的组合分别用于细胞实验，采用MTT(噻唑蓝)比色法进行实验，步骤如下：
对数生长期的的癌细胞用胰蛋白酶消化、PBS缓冲液(即：含0.05％吐温-20的pH7.4的磷酸盐缓冲液，质量百分比)洗涤、离心后将其制备成浓度为3×104个/mL的细胞悬液，将该悬液按100μL/孔均匀加入96孔细胞培养板中，每孔细胞数为3000个。将细胞板置于37℃孵箱中，孵育24h，显微镜下观察可见细胞融合贴壁生长。分别将载药脂质体、药物组合、盐酸伊立替康及磷酸氯喹溶于生理盐水中，所有溶液以其中盐酸伊立替康的含量为基准，稀释成不同浓度，折算成盐酸伊立替康溶度分别为0.1μg/mL，0.5μg/mL，1μg/mL，5μg/mL，10μg/mL，25μg/mL，50μg/mL，100μg/mL，200μg/mL，向上述96孔细胞培养板中加入上述不同浓度的溶液25μL/孔，培养48h后，每孔加入32μL浓度为5mg/mL噻唑蓝(MTT)溶液，继续培养4h，吸出上清液，加入200μL二甲基亚砜(DMSO)，然后振摇5min。用酶标仪检测各孔570nm处的OD值，记录结果。上述实验，每组重复3次，每个浓度设3个复孔。
IC50即50％抑制浓度，是抑制半数癌细胞生长时的药物浓度，IC50值越低，说明细胞毒性作用越大。试验中IC50值由IC50.exe软件计算得到。
实验结果显示，同一氯喹类药物和盐酸伊立替康比例，不同种类的磷脂、不同种类的胆固醇对于IC50几乎没有影响。
对照组1、对照组2、对比例1、对比例2及实施例7、8、9、10和11制备的脂质体、实施例19制备的药物组合对两种敏感人结肠癌细胞株HCT-8和HT-29的IC50(μg/mL)值，如表2所示：
表2
| HCT-8/IC50(μg/mL) | CI | HT-29/IC50(μg/mL) | CI | |
| 对照组1 | 41.11 | / | 44.39 | / |
| 对照组2 | 37.36 | / | 76.84 | / |
| 对比例1 | 13.98 | / | 24.9 | / |
| 对比例2 | 32.98 | / | 39.96 | / |
| 实施例7 | 16.39 | 1.71 | 15.07 | 0.91 |
| 实施例8 | 11.49 | 1.46 | 10.88 | 0.83 |
| 实施例9 | 8.68 | 1.47 | 4.56 | 0.45 |
| 实施例10 | 5.33 | 1.05 | 3.65 | 0.46 |
| 实施例11 | 3.21 | 0.83 | 2.49 | 0.44 |
| 实施例19 | 6.95 | 0.60 | 15.65 | 0.90 |
CI﹥1为拮抗作用，CI＝1为相加作用，CI﹤1为协同作用(CI值越小，说明协同作用越强)。
由表2可见，对照组2和对比例2中氯喹类药物没有显示出明显的细胞毒性，表明氯喹类药物的细胞毒性较小；从对照组1和对比例1可以看出，伊立替康类药物脂质体比游离的伊立替康类药物有更小的IC50值，说明制备成脂质体剂型在一定程度上增强了伊立替康类药物的细胞毒性。从实施例19可以看出，游离的伊立替康类药物和氯喹类药物组合可以起到较好的协同作用(CI均小于1)。共载实施例组(实施例7-11)对两种敏感人结肠癌细胞株HCT-8和HT-29细胞都起到了一定的抑制作用，并且随着氯喹比例的增加而加大，根据CI值可判断，伊立替康类药物和氯喹类药物协同作用较好，且在结肠癌细胞株HT-29中协同作用更强，这说明氯喹类药物增强了伊立替康类药物对结肠癌敏感株细胞的杀伤作用。由此可见，本发明伊立替康类药物和氯喹类药物组合、伊立替康类药物和氯喹类药物共载脂质体对细胞起到较好的增敏作用。
实施例17、18、20和21中的药物组合也可以起到较好的协同作用；共载实施例组(实施例12-16)伊立替康类药物和氯喹类药物协同作用也较好，且在结肠癌细胞株HT-29中协同作用更强；这说明氯喹类药物增强了伊立替康类药物对结肠癌敏感株细胞的杀伤作用。
本发明制备方法中参数的变化并不影响共载脂质体的制备，因此本发明制备方法中任意参数的组合均可实现共载脂质体的制备。在此不再赘述。
Claims (7)
1.一种用于治疗结肠癌的伊立替康类药物和氯喹类药物组合物，其特征在于，所述的伊立替康类药物和氯喹类药物的质量比为1：0.5-5；
所述的伊立替康类药物为伊立替康、伊立替康与酸所成的盐中的一种或多种；所述的氯喹类药物为氯喹、氯喹与酸所成的盐中的一种或多种。
2.一种用于治疗结肠癌的伊立替康类药物和氯喹类药物共载脂质体，其特征在于，由药物、磷脂、胆固醇类化合物和水相介质制成；其中，药物、磷脂和胆固醇类化合物的质量比为1：2-100：0.8-35；所述的药物为伊立替康类药物和氯喹类药物；所述的伊立替康类药物和氯喹类药物的质量比为1:0.5-5；所述的伊立替康类药物为伊立替康、伊立替康与酸所成的盐中的一种或多种；所述的氯喹类药物为氯喹、氯喹与酸所成的盐中的一种或多种；所述的胆固醇类化合物为胆固醇、聚乙二醇修饰的胆固醇中的一种或者两种。
3.根据权利要求2所述的用于治疗结肠癌的伊立替康类药物和氯喹类药物共载脂质体，其特征在于，所述的伊立替康与酸所成的盐为盐酸伊立替康；所述的氯喹与酸所成的盐为磷酸氯喹、盐酸氯喹、硫酸氯喹中一种或多种。
4.根据权利要求2所述的用于治疗结肠癌的伊立替康类药物和氯喹类药物共载脂质体，其特征在于，所述的水相介质为硫酸铵水溶液。
5.根据权利要求4所述的用于治疗结肠癌的伊立替康类药物和氯喹类药物共载脂质体，其特征在于，所述的硫酸铵水溶液的浓度为0.05mol/L-0.5mol/L。
6.根据权利要求2或3所述的用于治疗结肠癌的伊立替康类药物和氯喹类药物共载脂质体的制备方法，其特征在于，采用pH梯度法或硫酸铵梯度法制备。
7.根据权利要求2-5任一项所述的用于治疗结肠癌的伊立替康类药物和氯喹类药物共载脂质体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将磷脂和胆固醇类化合物溶于有机溶剂中，混合均匀，除去有机溶剂，形成薄膜，再加入水相介质硫酸铵水溶液混合均匀，充分水化后经粉碎、均一粒径，得到空白脂质体悬液；所述的有机溶剂为无水乙醇或者氯仿；
(2)将步骤(1)中的空白脂质体悬液以蒸馏水为透析介质，透析4h-20h，得到空白脂质体；
(3)将伊立替康类药物和氯喹类药物加入到空白脂质体中，经水浴孵育后冷却，分离出游离药物，得到伊立替康类药物和氯喹类药物共载脂质体。
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