CN102836158A - 氯喹类药物和紫杉醇类药物共载脂质体及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种氯喹类药物和紫杉醇类药物共载脂质体，由药物、磷脂、胆固醇类化合物、内部缓冲系统和pH值调节剂制成；其中，药物、磷脂和胆固醇类化合物的质量比为1：2~125：1~45；所述的药物为氯喹类药物和紫杉醇类药物。利用氯喹类药物和紫杉醇类药物的协同作用，使氯喹类药物和紫杉醇类药物共载脂质体具有抑制多药耐药性和降低用药毒性的特点。本发明还公开了一种氯喹类药物和紫杉醇类药物共载脂质体的制备方法，制备工艺简单、条件温和、控制参数较少，有利于降低生产成本，易于工业化生产。

Description

氯喹类药物和紫杉醇类药物共载脂质体及其制备方法

技术领域

本发明涉及脂质体类药剂技术领域，特别涉及一种氯喹类药物和紫杉醇类药物共载脂质体及其制备方法。

背景技术

肿瘤是威胁人类健康的主要疾病之一，化疗药物为其治疗的主要手段，但由于化疗药的大量使用，肿瘤细胞易产生多药耐药性（multidrugresistance，MDR），而MDR的产生是目前肿瘤化学治疗失败的一个主要原因。

紫杉醇（Paclitaxel，Tax）是一种具有独特抗癌机制的生物碱，对治疗多种晚期癌症有一定疗效。但由于其在水中的溶解度极小，口服无法吸收，且现在临床应用的Tax注射液为由聚氧乙烯蓖麻油/无水乙醇混合溶媒制成的浓溶液，临用前须稀释，不仅使用不便，而且会引起多种毒副作用，其中过敏反应最为严重，由此使其应用严重受限。此外，由于紫杉醇等药物的大量使用容易使细胞产生耐药性，这是当下临床上成功地治疗癌症的一大障碍，为解决这些问题，目前主要尝试采用以下方法来逆转多药耐药性:1）MDR逆转剂；2）化疗药物的化学修饰；3）联用化疗敏感药物；4）运用纳米粒载体及后两者相结合。

一直以来氯喹（CQ）是作为一种安全、有效且价廉的预防和治疗疟原虫感染的药物使用，也常常用于基因转染实验中，以提高转染效率。已有国外文献报道，CQ可作为多药耐药蛋白1（MRP1）的抑制剂，与阿霉素联用，可降低细胞的多药耐药性，从而达到较好的抑癌效果（Reversal ofMRP-Mediated Doxorubicin Resistance with Quinoline-Based Drugs,[J]Biochemical Pharmacology，2000,Vol.59,1245–1252.）。MRP1属于ATP结合盒（ABC）转运家庭，它能够广泛性地将胞内的抗癌药物泵出细胞外，从而大大削弱药物的抗癌作用，使细胞产生耐药（Pharmacogenomics ofABC transporters and its role in cancer chemotherapy，[J]Drug ResistantUpdate,2003,Vol.6,71-84）。但早期研究已表明注射使用氯喹溶液毒性很大，甚至危及生命，而紫杉醇由于聚氧乙烯溶剂会导致急性过敏反应，还可能导致心律失常等副反应，若氯喹注射剂与紫杉醇注射剂联用将使毒副作用更为严重，因此迫切需要通过制剂手段给以解决。

在过去的20年里，控制药物释放和肿瘤靶向的药物运载系统作为一种有吸引力的治疗手段被临床医生广泛应用，在运用的载体中，有纳米粒、白蛋白微球以及脂质体等，而脂质体作为一种化疗药物载体最近在牛身上被重新探讨，由此发现了脂质体不仅可以改善药物体内分布，并能显著增加药物的抗癌效率，同时减少对正常细胞的毒性。药物用脂质体包裹后，能靶向作用于病变部位，从而提高药物的治疗指数，同时还可以减少药物的治疗剂量，降低全身不良反应，提高用药安全性。目前，已批准临床使用或正在进行临床评价的紫杉醇制剂主要是脂质体制剂，如注射用紫杉醇脂质体，商品名力扑素，虽然避免了溶剂导致的过敏反应及药物的相互作用等影响，但是仍存在着容易使细胞产生耐药性以致抗癌效果不佳的问题。

发明内容

本发明提供了一种载体选择面广、药物包封率高的氯喹类药物和紫杉醇类药物共载脂质体，利用氯喹类药物和紫杉醇类药物的协同作用，一定程度上克服了多药耐药性，并降低了氯喹类药物和紫杉醇类药物如氯喹和紫杉醇以游离形式使用时不可忽视的毒性。

本发明还提供了一种氯喹类药物和紫杉醇类药物共载脂质体的制备方法，采用薄膜分散法结合pH梯度法将氯喹类药物和紫杉醇类药物如氯喹和紫杉醇两者顺序装载入脂质体，制得氯喹类药物和紫杉醇类药物共载脂质体，制备工艺简单、条件温和、控制参数较少，有利于降低生产成本，易于工业化生产。

一种氯喹类药物和紫杉醇类药物共载脂质体，由药物、磷脂、胆固醇类化合物、内部缓冲系统和pH值调节剂制成；其中，药物、磷脂和胆固醇类化合物的重量比为1：2~125：1~45。

所述的药物为氯喹类药物和紫杉醇类药物。

优选的，所述的药物、磷脂和胆固醇类化合物的重量比为1：20~125：4~25；进一步优选为药物、磷脂和胆固醇类化合物的质量比为1：20~85：4~17。

所述的氯喹类药物和紫杉醇类药物为主要的药效成分，氯喹类药物和紫杉醇类药物的比例可以根据实际需要任意调整，氯喹类药物和紫杉醇类药物的质量比可以是1~100：1~100，优选氯喹类药物和紫杉醇类药物的质量比为0.5~5：1。

所述的氯喹类药物包括氯喹、氯喹与酸所成的盐中的一种或多种；所述的氯喹与酸所成的盐可选用磷酸氯喹、盐酸氯喹、硫酸氯喹中的一种或多种。

所述的紫杉醇类药物包括紫杉醇、多烯紫杉醇中的一种。

所述的磷脂可选用天然磷脂、合成磷脂中的一种或两种；所述的天然磷脂为大豆磷脂、卵磷脂中的一种或两种；所述的合成磷脂为中性磷脂、负电性磷脂或聚乙二醇修饰磷脂中的至少一种，合成磷脂具体为二豆蔻酰磷脂酰胆碱（DMPC）、二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）、二硬脂酰磷脂酰胆碱（DSPC）、二棕榈酰磷脂酰甘油酯（DPPG）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰丝氨酸（PS）、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇（DSPE-PEG）中的至少一种。

所述的胆固醇类化合物为普通胆固醇、聚乙二醇（PEG）修饰的胆固醇中的一种或者两种，所述的聚乙二醇（PEG）修饰的胆固醇选用聚乙二醇单甲醚胆固醇琥珀酸酯（CHS-PEG）。

所述的内部缓冲系统可选用柠檬酸盐缓冲系统、磷酸盐缓冲系统或碳酸盐缓冲系统；所述的柠檬酸盐缓冲系统优选为0.05mol/L~0.5mol/L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。所述的内部缓冲系统主要是用于乳化磷脂和胆固醇得到脂质体，其用量并没有严格的限制，一般每1重量份的药物中添加1mL~10mL。

所述的pH值调节剂为碱液，可选用氢氧化钠水溶液、磷酸氢二钠水溶液、碳酸钠水溶液、碳酸氢钠水溶液等中的一种或多种，碱液的浓度一般为0.05mol/L~0.5mol/L，以方便调节pH值。所述的pH值调节剂用于调节氯喹类药物和紫杉醇类药物共载脂质体的pH值在5.5~8.0，pH值太小则磷脂双份子层内外形成不了浓度差，药物进不了脂质体内部，pH过大则会产生脂质体破裂等问题，优选调节pH值为7。

所述的氯喹类药物和紫杉醇类药物共载脂质体的制备方法，包括以下步骤：

1）将磷脂和胆固醇类化合物溶于有机溶剂中，再加入用有机溶剂溶解的紫杉醇类药物，充分溶解后混合均匀，除去有机溶剂，然后加入内部缓冲系统混合均匀，得到单载紫杉醇类药物的脂质体悬液；

2）将氯喹类药物溶解在步骤1）制备的单载紫杉醇类药物的脂质体悬液中，用pH值调节剂调节pH至5.5~8.0，在30℃~50℃水浴孵育10min~60min，分离出游离药物，得到氯喹类药物和紫杉醇类药物共载脂质体。

步骤1）中，所述的有机溶剂选用无水乙醇或者氯仿（三氯甲烷）。

步骤1）中，除去有机溶剂，然后加入内部缓冲系统后，可通过高压匀乳、超声或微射流进行粉碎，得到粒径低于200nm的单载紫杉醇类药物的脂质体悬液。

步骤2）中，分离出游离药物的方法可采用Sephadex G-50凝胶柱层析法或透析法。

所述的氯喹类药物和紫杉醇类药物共载脂质体可作为抗癌药物治疗癌症等疾病，对肿瘤细胞具有较高的杀伤力。

本发明采用动态光散射粒径仪（Malvern Zetasizer Nano-S90，英国）检测粒径。

本发明具有如下优点：

（1）磷脂选择面广，可使用天然卵磷脂或大豆磷脂，也可使用合成的中性磷脂或负电性磷脂。

（2）通过本发明方法制得的氯喹类药物和紫杉醇类药物共载脂质体，药物包封率可达到80%以上，粒径可低于200nm，具有包封率高、稳定性好、成本低等优点。

（3）本发明方法制得的氯喹类药物和紫杉醇类药物共载脂质体，能够有效抑制细胞的多药耐药性，可以明显逆转紫杉醇脂质体的耐药性。

（4）在氯喹的毒性范围内（<20μg/ml），氯喹类药物和紫杉醇类药物共载脂质体随着氯喹类药物的量的增多，IC₅₀降低。

（5）氯喹类药物和紫杉醇类药物共载脂质体使氯喹类药物和紫杉醇类药物协同作用，从而提高了对肿瘤细胞的杀伤力，并且氯喹类药物和紫杉醇类药物的协同作用相对可以减少药物的使用量，减小了毒副作用。

（6）由于紫杉醇类药物如紫杉醇为疏水性药物，氯喹类药物如氯喹为弱碱性药物，故采用薄膜分散法结合pH梯度法将两者顺序装载入脂质体，制备氯喹类药物和紫杉醇类药物共载脂质体，制备方法操作简便，且包封率高，可控性和重现性好。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为对本发明权利范围的限制。

单载紫杉醇或多烯紫杉醇脂质体的制备

实施例1

称取250mg大豆磷脂（磷脂酰胆碱纯度>76%）和50mg胆固醇溶解于3mL无水乙醇中，再加入用2ml无水乙醇溶解的2mg紫杉醇，充分溶解后混合均匀，然后减压蒸去有机溶剂乙醇，使磷脂等成膜材料在烧瓶底部形成均匀脂膜，然后加入2mL PBS（磷酸盐，pH=7.4）缓冲液，涡旋5min，最后用细胞粉碎仪超声5min，得到2ml紫杉醇脂质体悬液，测得该紫杉醇脂质体悬液的平均粒径（数均）为98.6nm，用Sephadex G-50凝胶柱层析法分离脂质体和未被包封在内的游离药物，紫杉醇包封率为99.65%，载药量为0.66%。

实施例2

称取250mg大豆磷脂（磷脂酰胆碱纯度>76%）和50mg胆固醇溶解于3mL无水乙醇中，再加入用2ml无水乙醇溶解的2mg紫杉醇，充分溶解后混合均匀，然后减压蒸去有机溶剂乙醇，使磷脂等成膜材料在烧瓶底部形成均匀脂膜，然后加入2mL 0.3mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液（pH=3.5），涡旋5min，最后用细胞粉碎仪超声5min，得到2ml紫杉醇脂质体悬液，备用。

实施例3

称取210mg二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）、40mg磷脂酰乙醇胺（PE）和50mg胆固醇，溶解于3mL无水乙醇中，加入用2ml无水乙醇溶解的2mg紫杉醇，充分溶解后混合均匀，然后减压蒸去有机溶剂乙醇，使磷脂等成膜材料在烧瓶底部形成均匀脂膜，然后加入2mL PBS（磷酸盐，pH=7.4）缓冲液，涡旋5min，最后用细胞粉碎仪超声5min，得到2ml紫杉醇脂质体悬液，测得该脂质体悬液的平均粒径为102nm，用SephadexG-50凝胶柱层析法分离脂质体和未被包封在内的游离药物，紫杉醇包封率为100%，载药量为0.66%。

实施例4

称取200mg大豆磷脂（磷脂酰胆碱纯度>76%）、50mg胆固醇和聚乙二醇单甲醚（分子量为2000）胆固醇琥珀酸酯（CHS-PEG₂₀₀₀）50mg，溶解于3mL无水乙醇中，加入用2ml无水乙醇溶解的2mg紫杉醇，充分溶解后混合均匀，然后减压蒸去有机溶剂乙醇，使磷脂等成膜材料在烧瓶底部形成均匀脂膜，然后加入2mL PBS（磷酸盐，pH=7.4）缓冲液，涡旋5min，最后用细胞粉碎仪超声5min，得到2ml紫杉醇脂质体悬液，测得该脂质体悬液的平均粒径为98.3nm，用SephadexG-50凝胶柱层析法分离脂质体和未被包封在内的游离药物，紫杉醇包封率为100%，载药量为0.66%。

实施例5

称取200mg二硬脂酰磷脂酰胆碱（DSPC）、50mg二棕榈酰磷脂酰甘油酯（DPPG）和50mg胆固醇溶解于3mL无水乙醇中，加入用2ml无水乙醇溶解的2mg紫杉醇，充分溶解后混合均匀，然后减压蒸去有机溶剂乙醇，使磷脂等成膜材料在烧瓶底部形成均匀脂膜，然后加入2mL PBS（磷酸盐，pH=7.4）缓冲液，涡旋5min，最后经微射流减小粒径，得到2ml紫杉醇脂质体悬液，测得该脂质体悬液的平均粒径为98.8nm，用SephadexG-50凝胶柱层析法分离脂质体和未被包封在内的游离药物，紫杉醇包封率为100%，载药量为0.66%。

实施例6

称取200mg二豆蔻酰磷脂酰胆碱（DMPC）、50mg磷脂酰丝氨酸（PS）、50mg胆固醇溶解于3mL无水乙醇中，加入用2ml无水乙醇溶解的2mg紫杉醇，充分溶解后混合均匀，然后减压蒸去有机溶剂乙醇，使磷脂等成膜材料在烧瓶底部形成均匀脂膜，然后加入2mL PBS（磷酸盐，pH=7.4）缓冲液，涡旋5min，最后用细胞粉碎仪超声5min，得到2ml紫杉醇脂质体悬液，测得该脂质体悬液的平均粒径为99nm，用SephadexG-50凝胶柱层析法分离脂质体和未被包封在内的游离药物，紫杉醇包封率为100%，载药量为0.66%。

实施例7

称取210mg二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）、40mg磷脂酰乙醇胺（PE）、50mg胆固醇，溶解于3mL无水乙醇中，加入用2ml无水乙醇溶解的2mg紫杉醇，充分溶解后混合均匀，然后减压蒸去有机溶剂乙醇，使磷脂等成膜材料在烧瓶底部形成均匀脂膜，然后加入2mL PBS（磷酸盐，pH=7.4）缓冲液，涡旋5min，最后用细胞粉碎仪超声5min，得到2ml紫杉醇脂质体悬液，测得该脂质体悬液的平均粒径为98.6nm，用SephadexG-50凝胶柱层析法分离脂质体和未被包封在内的游离药物，紫杉醇包封率为100%，载药量为0.66%。

实施例8

称取210mg大豆磷脂、50mg胆固醇、聚乙二醇单甲醚（分子量为2000）胆固醇琥珀酸酯（CHS-PEG₂₀₀₀）40mg，溶解于3mL无水乙醇中，加入用2ml无水乙醇溶解的2mg紫杉醇，充分溶解后混合均匀，然后减压蒸去有机溶剂乙醇，使磷脂等成膜材料在烧瓶底部形成均匀脂膜，然后加入2mLPBS（磷酸盐，pH=7.4）缓冲液，涡旋5min，最后用细胞粉碎仪超声5min，得到2ml紫杉醇脂质体悬液，测得该脂质体悬液的平均粒径为98.6nm，用SephadexG-50凝胶柱层析法分离脂质体和未被包封在内的游离药物，紫杉醇包封率为100%，载药量为0.66%。

实施例9

称取250mg大豆磷脂（磷脂酰胆碱纯度>76%）和50mg胆固醇溶解于3mL无水乙醇中，再加入用2ml无水乙醇溶解的2mg多烯紫杉醇，充分溶解后混合均匀，然后减压蒸去有机溶剂乙醇，使磷脂等成膜材料在烧瓶底部形成均匀脂膜，然后加入2mL 0.3mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液（pH=3.5），涡旋5min，最后用细胞粉碎仪超声5min，得到2ml多烯紫杉醇脂质体悬液，备用。

实施例10

称取250mg大豆磷脂（磷脂酰胆碱纯度>76%）和50mg胆固醇溶解于3mL无水乙醇中，再加入用2ml无水乙醇溶解的2mg多烯紫杉醇，充分溶解后混合均匀，然后减压蒸去有机溶剂乙醇，使磷脂等成膜材料在烧瓶底部形成均匀脂膜，然后加入2mL PBS（磷酸盐，pH=7.4）缓冲液，涡旋5min，最后用细胞粉碎仪超声5min，得到2ml多烯紫杉醇脂质体悬液，测得该多烯紫杉醇脂质体悬液的平均粒径(数均)为92.7nm，用SephadexG-50凝胶柱层析法分离脂质体和未被包封在内的游离药物，多烯紫杉醇包封率为100%，载药量为0.66%。

实施例11

称取250mg大豆磷脂（磷脂酰胆碱纯度>76%）和50mg胆固醇溶解于3mL无水乙醇中，混合均匀，然后减压蒸去有机溶剂乙醇，使磷脂等成膜材料在烧瓶底部形成均匀脂膜，然后加入2mL 0.3mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液（pH=3.5），涡旋5min，最后用细胞粉碎仪超声5min，得到2ml空白脂质体悬液，备用。

氯喹和紫杉醇（或多烯紫杉醇）共载脂质体

实施例12

按紫杉醇与氯喹质量比为2：1，将氯喹1mg溶解到实施例2的2mL紫杉醇脂质体悬液中，用0.2mol/L磷酸氢二钠水溶液调pH至7.0，之后在40℃水浴中孵育10min，冷却至室温后，用SephadexG-50凝胶柱层析法分离脂质体和未被包封在内的游离药物，得到紫杉醇与氯喹共载脂质体18mL，测得紫杉醇与氯喹的包封率分别为84.46%和94.12%，载药量分别为0.56%和0.29%，测得平均粒径为55.2nm。

实施例13

按紫杉醇与氯喹质量比为1：1，将氯喹2mg溶解到实施例3的2mL紫杉醇脂质体悬液中，用0.2mol/L磷酸氢二钠水溶液调pH至7.0，之后在40℃水浴中孵育10min，冷却至室温后，用SephadexG-50凝胶柱层析法分离脂质体和未被包封在内的游离药物，得到紫杉醇与氯喹共载脂质体18mL，测得紫杉醇与氯喹的包封率分别为102.20%和86.52%，载药量分别为0.67%和0.56%，测得平均粒径为56.0nm。

实施例14

按紫杉醇与氯喹质量比为1：2，将氯喹4mg溶解到实施例4的2mL紫杉醇脂质体悬液中，用0.2mol/L磷酸氢二钠水溶液调pH至7.0，之后在40℃水浴中孵育10min，冷却至室温后，用SephadexG-50凝胶柱层析法分离脂质体和未被包封在内的游离药物，得到紫杉醇与氯喹共载脂质体18mL，测得紫杉醇与氯喹的包封率分别为95.47%和85.59%，载药量分别为0.62%和1.24%，测得平均粒径为56.9nm。

实施例15

按紫杉醇与氯喹质量比为1：3，将氯喹6mg溶解到实施例5的2mL紫杉醇脂质体悬液中，用0.2mol/L磷酸氢二钠水溶液调pH至7.0，之后在40℃水浴中孵育10min，冷却至室温后，用SephadexG-50凝胶柱层析法分离脂质体和未被包封在内的游离药物，得到紫杉醇与氯喹共载脂质体18mL，测得紫杉醇与氯喹的包封率分别为99.80%和94.78%，载药量分别为0.65%和1.85%，测得平均粒径为58.5nm。

实施例16

按紫杉醇与氯喹质量比为1：5，将氯喹10mg溶解到实施例6的2mL紫杉醇脂质体悬液中，用0.2mol/L磷酸氢二钠水溶液调pH至7.0，之后在40℃水浴中孵育10min，冷却至室温后，用SephadexG-50凝胶柱层析法分离脂质体和未被包封在内的游离药物，得到紫杉醇与氯喹共载脂质体18mL，测得紫杉醇与氯喹的包封率分别为87.49%和95.79%，载药量分别为0.56%和3.17%，测得平均粒径为57.4nm。

实施例17

按多烯紫杉醇与氯喹质量比为1：1，将磷酸氯喹2mg溶解到实施例9中的2mL多烯紫杉醇脂质体悬液中，用0.2mol/L磷酸氢二钠水溶液调pH至7.0，之后在40℃水浴中孵育10min，冷却至室温后，用SephadexG-50凝胶柱层析法分离脂质体和未被包封在内的游离药物，得到多烯紫杉醇与氯喹共载脂质体18mL，测得多烯紫杉醇与氯喹的包封率分别为100%和95.00%，载药量分别为0.66%和0.63%，测得平均粒径为91.1nm。

实施例18

按多烯紫杉醇与氯喹质量比为1：2，将磷酸氯喹4mg溶解到实施例10中的2mL多烯紫杉醇脂质体悬液中，用0.2mol/L磷酸氢二钠水溶液调pH至7.0，之后在40℃水浴中孵育10min，冷却至室温后，用SephadexG-50凝胶柱层析法分离脂质体和未被包封在内的游离药物，得到多烯紫杉醇与氯喹共载脂质体18mL，测得多烯紫杉醇与氯喹的包封率分别为100%和96.97%，载药量分别为0.65%和1.27%，测得平均粒径为91.3nm。

对比例1

如实施例1，得到紫杉醇脂质体（PTXL）2mL，紫杉醇包封率为99.65%，载药量为0.66%，测得平均粒径为98.6nm。

对比例2

将氯喹2mg溶解到实施例11的2mL空白脂质体悬液中，用0.2mol/L磷酸氢二钠水溶液调pH至7.0，之后在40℃水浴中孵育10min，冷却至室温后，用SephadexG-50凝胶柱层析法分离脂质体和未被包封在内的游离药物，得到氯喹脂质体（CQL）18ml，氯喹的包封率为98.91%，载药量为1.56%，测得平均粒径为83.1nm。

细胞毒性对比实验

将作为对照组1的紫杉醇注射剂泰素（Taxol）和作为对照组2的游离磷酸氯喹水溶液（FCQ）、对比例制备的脂质体、实施例制备的各种氯喹类药物和紫杉醇类药物不同比例的脂质体分别用于细胞实验，采用MTT（噻唑蓝）比色法进行实验，步骤如下：

对数生长期的的癌细胞用胰蛋白酶消化、PBS缓冲液（即：含0.05%吐温-20的pH7.4的磷酸盐缓冲液）洗涤、离心后将其制备成浓度为5×10⁴/ml的细胞悬液，将该悬液按100μl/孔均匀加入96孔细胞培养板中，每孔细胞数为5000个。将细胞板置于37℃孵箱中，孵育24h，显微镜下观察可见细胞融合贴壁生长。分别将载药脂质体及氯喹溶于生理盐水中，所有溶液以其中紫杉醇的含量为基准，稀释成不同浓度，向上述96孔细胞培养板中加入上述不同浓度的紫杉醇溶液25μl/孔，培养48h后，每孔加入31.5μl浓度为5mg/ml噻唑蓝（MTT）溶液，继续培养4h，吸出上清液，加入200μl二甲基亚砜(DMSO)，然后震摇5min。用酶标仪检测各孔570nm处的OD值，记录结果。上述实验，每组重复3次，每个浓度设4个复孔。

IC₅₀即50%抑制浓度，是抑制半数癌细胞生长时的药物浓度，IC₅₀值越低，说明细胞毒性作用越大。试验中IC₅₀值由IC₅₀.exe软件计算得到。并且实验结果显示，同一氯喹和紫杉醇比例，不同种类的磷脂对于IC₅₀几乎没有影响。

对照组1、对照组2，对比例1、对比例11及实施例12至16制备的脂质体对两种敏感细胞株A549（肺腺癌上皮细胞）和A2780（卵巢癌细胞）及对应的紫杉醇耐药细胞株A549/T和A2780/T的IC₅₀（μg/ml）值，如表1和表2所示：

表1

表2

从表1和表2的结果可见，对照组2中游离磷酸氯喹水溶液（FCQ）的IC₅₀比对照组1中紫杉醇注射剂泰素（Taxol）和对比例1紫杉醇脂质体（PTXL）的IC₅₀大，表明游离的氯喹相对游离的紫杉醇和紫杉醇脂质体的细胞毒性要小，各实施例组对耐药组细胞都起到了一定的抑制作用，并且随着氯喹比例的增加而加大，说明紫杉醇和氯喹两者协同作用较好，且对A549/T的作用比对A2780/T的强。由于紫杉醇为疏水性药物，缓释作用较明显，因此48h紫杉醇脂质体的细胞毒性普遍比游离紫杉醇的要小，而与氯喹共载以后，48h细胞毒性明显增大，由此既可以达到脂质体的长循环和减轻副作用的效果，又可以相对的减少化疗药物的剂量，由此可见，本发明氯喹和紫杉醇共载脂质体对细胞的耐药性有较好的逆转作用，且相对于Taxol和紫杉醇脂质体有明显的优势。

Claims (10)

1.一种氯喹类药物和紫杉醇类药物共载脂质体，其特征在于，由药物、磷脂、胆固醇类化合物、内部缓冲系统和pH值调节剂制成；其中，药物、磷脂和胆固醇类化合物的质量比为1：2~125：1~45；

所述的pH值调节剂调节脂质体pH至5.5~8.0；

所述的药物为氯喹类药物和紫杉醇类药物；

所述的氯喹类药物为氯喹、氯喹与酸所成的盐中的一种或多种；

所述的紫杉醇类药物为紫杉醇、多烯紫杉醇中的一种；

所述的胆固醇类化合物为胆固醇、聚乙二醇修饰胆固醇中的一种或者两种。

2.根据权利要求1所述的氯喹类药物和紫杉醇类药物共载脂质体，其特征在于，所述的药物、磷脂和胆固醇类化合物的质量比为1：20~85：4~17。

3.根据权利要求1所述的氯喹类药物和紫杉醇类药物共载脂质体，其特征在于，所述的氯喹与酸所成的盐为磷酸氯喹、盐酸氯喹、硫酸氯喹中的一种或多种。

4.根据权利要求1所述的氯喹类药物和紫杉醇类药物共载脂质体，其特征在于，所述的磷脂为天然磷脂、合成磷脂中的一种或两种；所述的天然磷脂为大豆磷脂、卵磷脂中的一种或两种；所述的合成磷脂为中性磷脂、负电性磷脂或聚乙二醇修饰磷脂中的一种或多种。

5.根据权利要求4所述的氯喹类药物和紫杉醇类药物共载脂质体，其特征在于，所述的合成磷脂为二豆蔻酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰甘油酯、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇中的一种或多种。

6.根据权利要求1所述的氯喹类药物和紫杉醇类药物共载脂质体，其特征在于，所述的内部缓冲系统为柠檬酸盐缓冲系统、磷酸盐缓冲系统或碳酸盐缓冲系统；所述的pH值调节剂为碱液。

7.根据权利要求6所述的氯喹类药物和紫杉醇类药物共载脂质体，其特征在于，所述的柠檬酸盐缓冲系统为0.05mol/L~0.5mol/L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液；

所述的碱液为氢氧化钠水溶液、磷酸氢二钠水溶液、碳酸钠水溶液、碳酸氢钠水溶液中的一种或多种。

8.根据权利要求1所述的氯喹类药物和紫杉醇类药物共载脂质体，其特征在于，所述的氯喹类药物和紫杉醇类药物的质量比为1~100：1~100。

9.根据权利要求1~8任一项所述的氯喹类药物和紫杉醇类药物共载脂质体的制备方法，包括以下步骤：

1）将磷脂和胆固醇类化合物溶于有机溶剂中，再加入用有机溶剂溶解的紫杉醇类药物，充分溶解后混合均匀，除去有机溶剂，然后加入内部缓冲系统混合均匀，得到单载紫杉醇类药物的脂质体悬液；

2）将氯喹类药物溶解在步骤1）制备的单载紫杉醇类药物的脂质体悬液中，用pH值调节剂调节pH至5.5~8.0，在30℃~50℃水浴孵育10min~60min，分离出游离药物，得到氯喹类药物和紫杉醇类药物共载脂质体。

10.根据权利要求9所述的氯喹类药物和紫杉醇类药物共载脂质体的制备方法，其特征在于，所述的有机溶剂为无水乙醇或者氯仿。