CN104961738B - 从白刺种子中提取分离MTCA及其ss、rs两种构象的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了从白刺种子中提取分离两种构型的1‑甲基‑1，2，3，4‑四氢‑β‑咔啉‑3‑羧基酸的方法。本发明还提供了从白刺种子中同时提取分离(1S，3S)、(1R，3S)两种构型的1‑甲基‑1，2，3，4‑四氢‑β‑咔啉‑3‑羧基酸的方法。本发明利用高速逆流色谱并采用了合理的溶剂体系从白刺种子中同时提取分离得到了高纯度的1‑甲基‑1，2，3，4‑四氢‑β‑咔啉‑3‑羧基酸和ssMTCA、rsMTCA，该技术不需要使用固相载体，无不可逆吸附，样品损失小、无污染、高效、快速、低成本。本发明工艺简单、操作方便、安全、重复性好，可工业化生产。

Description

从白刺种子中提取分离MTCA及其ss、rs两种构象的方法
技术领域
本发明涉及从白刺种子中同时提取分离两种手性生物碱的方法。
背景技术
白刺种子中含有多种活性成分，目前从白刺种子中分离得到了很多活性物质，主要有以下几类物质，黄酮类：槲皮素、异鼠李素-7-O-α-L-鼠李糖甙、山奈素-7-O-α-L-鼠李糖甙、异鼠李素-7-O-β-D-葡萄糖甙、槲皮素-7-O-α-L-鼠李糖甙、异鼠李糖、尿囊素、胡萝卜苷、异鼠李糖；生物碱类：L-色氨酸、尿囊素和1-甲基-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-羧基酸(1-Methyl-1，2，3，4-tetrahydro-β-carboline-3-carboxylic acid，简称MTCA)。
MTCA属于吲哚类生物碱，目前吲哚类生物碱的研究已成为抗肿瘤药物活性的热点。特别是在新药及其新药先导化合物发现中起着不可替代的作用。吲哚类生物碱抗肿瘤成分主要对卵巢癌、淋巴癌和消化道系统癌如肝癌、结肠癌等有较显著的疗效。此外，吲哚类生物碱抗肿瘤成分在诱导肿瘤细胞分化、促进肿瘤细胞凋亡以及提高机体免疫方面亦表现出一定的作用。MTCA活性实验表明MTCA具有较强的清除羟基自由基的能力，在细胞浓度低于30μg/mL时对人表皮细胞Hucat时有一定的促进作用，同时对人肝癌细胞7221细胞有促进凋亡的作用。
研究表明MTCA广泛的存在于食品中如小麦、黑麦面粉、大豆蛋白、牛乳以及酒精饮料如啤酒和红酒中。从食品、酒精饮料以及生物样品分离出来的MTCA通常会包括两种类型(1S，3S)-1-甲基-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-羧基酸(简称ssMTCA)和(1R，3S)-1-甲基-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-羧基酸(简称rsMTCA)。在两个MTCA的非对映体中，ssMTCA的含量是rsMTCA含量的四倍之多。对两种异构体的提取分离研究，可以为更好地认识各异构体药理活性打下基础。
之前对其中的单一化合物即ssMTCA的分离主要是通过硅胶柱结合葡聚糖凝胶LH-20和RP-18柱纯化得到或者是通过液液提取结合固相微萃取与离子交换获得。但目前还未见使用高速逆流色谱从白刺种子中提取分离ssMTCA的研究报道，更未见从白刺种子中提取分离rsMTCA的方法。
发明内容
高速逆流色谱(High-speed counter-current chromatography，简称HSCCC)分离技术是一种连续高效的液-液分配色谱分离技术，它不用任何固态的支撑物或载体，利用两相溶剂体系在高速旋转的螺旋管内建立起一种特殊的单向性流体动力学平衡，其中一相作为固定相，另一相作为流动相，在连续洗脱的过程中能保留大量的固定相，物质的分离依据其在两相中分配系数的不同而实现，特别适合于天然产物活性成分的分离。
本发明的目的就在于提供一种利用HSCCC技术从白刺种子中同时提取分离ssMTCA和rsMTCA的方法。
具体地，本发明提供了从白刺种子中提取分离(1S，3S)、(1R，3S)两种构型的1-甲基-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-羧基酸的方法，它包括如下操作步骤：
(1)粗提物的制备：
取白刺种子，以乙醇为溶剂进行提取，提取液回收乙醇至无醇味，加入石油醚进行萃取，取水层，上大孔吸附树脂柱，依次用水、10％V/V乙醇溶洗脱，收集10％V/V乙醇洗脱液，浓缩、干燥即得粗提物；
(2)采用高速逆流色谱法分离：
取正丁醇：0.5％甲酸＝5∶6V/V，置于分液漏斗中配制两相溶剂系统，取上相为固定相，下相为流动相；取粗提物，溶解于适量固定相和流动相的混合液中，得到样品溶液；以20～40mL/min的流速将固定相泵入主机并充满分离螺线管，保持温度25～30℃，主机正向旋转，转速为800～1000r/min，以1.5～3.0mL/min的速度泵入流动相，待流动相从管柱口流出且基线稳定后，注入样品溶液，在254～280nm波长下进行检测，收集出峰时间300～350min的成分，即得初步纯化物；
(3)半制备液相色谱分离：
取初步纯化物，上半制备液相色谱，在254～280nm下检测，依次收集第一和第二大色谱峰洗脱部位，除去溶剂即可分别得到(1S，3S)-1-甲基-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-羧基酸、(1R，3S)-1-甲基-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-羧基酸，色谱条件如下：
流动相：甲醇-水＝(25～30)∶(75～70)。进一步地，步骤(1)中，提取所用乙醇的浓度为65％～95％，进一步为70％～80％，优选为75％V/V。
步骤(2)中制备的初步纯化物即为1-甲基-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-羧基酸，ss和rsMTCA的混合物。本发明一个具体实施方式中，1-甲基-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-羧基酸的纯度达到了97.20％，在95％以上。
进一步地，所述大孔吸附树脂为非极性大孔吸附树脂，优选使用D101树脂。
进一步地，步骤(2)中，固定相的流速为30mL/min，温度为30℃，主机转速为900r/min，流动相的流速为1.7mL/min。
本发明实验中对影响分离效果的其它主要因素如主机转速、流动相流速、以及水浴温度进行了选择与优化。结果表明，低的进样量、高主机转速和低流动相流速可以改善分离的效果，提高固定相的保留率，但相应的会增加分离所需要的时间。水浴温度的增高可以降低分离所需要的时间，因此最终确定的分离条件为：流动相流速为1.7mL/min，主机转速为900rpm/min，温度为30℃。
进一步地，步骤(2)、(3)中，检测波长为254nm。
本发明半制备色谱中，甲醇浓度高会导致分离速度快，保留时间短，但分离效果不理想。甲醇浓度低可以改善样品的分离效果，但分离速度相应缩短，分离时间延长。因此综合考虑，本实验采用30％甲醇等度洗脱，即流动相为甲醇-水＝30∶70。
本发明还提供了从白刺种子中分离纯化1-甲基-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-羧基酸的方法，它包括如下操作步骤：
(1)粗提物的制备：
取白刺种子，以乙醇为溶剂进行提取，提取液回收乙醇至无醇味，加入石油醚进行萃取，取水层，上大孔吸附树脂柱，依次用水、10％V/V乙醇溶洗脱，收集10％V/V乙醇洗脱液，浓缩、干燥即得粗提物；
(2)采用高速逆流色谱法分离：
取正丁醇：0.5％甲酸＝5∶6V/V，置于分液漏斗中配制两相溶剂系统，取上相为固定相，下相为流动相；取粗提物，溶解于适量固定相和流动相的混合液中，得到样品溶液；以20～40mL/min的流速将固定相泵入主机并充满分离螺线管，保持温度25～30℃，主机正向旋转，转速为800～1000r/min，以1.5～3.0mL/min的速度泵入流动相，待流动相从管柱口流出且基线稳定后，注入样品溶液，在254～280nm波长下进行检测，收集出峰时间300～350min的成分，除去溶剂即得1-甲基-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-羧基酸。
上述方法制备的1-甲基-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-羧基酸的纯度在95％以上。本发明一个具体实施方式中，其纯度为97.20％。
本发明利用高速逆流色谱并采用了合理的溶剂体系从白刺种子中同时提取分离得到了高纯度的1-甲基-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-羧基酸和ssMTCA、rsMTCA，该技术不需要使用固相载体，无不可逆吸附，样品损失小、无污染、高效、快速、低成本。本发明工艺简单、操作方便、安全、重复性好，可工业化生产。
附图说明
图1本发明逆流色谱图
图2本发明化合物的半制备色谱图
图3本发明目标化合物ssMTCA的HPLC图谱
图4初步纯化物的HPLC图谱
图5本发明目标化合物rsMTCA的色谱图
本发明图谱中，标注为数字“2”的色谱峰为ssMTCA，标注为数字“3”的色谱峰为rsMTCA。
具体实施方式
实施例1：
1、粗提物制备
白刺种子经高速万能粉碎机粉碎后，中药煎煮机中以1∶10kg/L的料液比进行提取，提取时间2h，提取溶剂75％的乙醇，提取次数为3次。3次提取后将提取溶液合并，回收乙醇至无醇味，加入石油醚进行反复萃取。将经过石油醚萃取后的水层于旋转蒸发仪上浓缩蒸干，加水溶解，上D101大孔树脂进行初步分离。对大孔树脂进行洗脱，洗脱溶液及浓度依次是：水、10％V/V乙醇溶液，收集10％乙醇洗脱液部分，于旋转蒸发仪上浓缩蒸干备用。
2、采用高速逆流色谱法分离：
取正丁醇：0.5％甲酸＝5∶6V/V，置于分液漏斗中配制两相溶剂系统，取上相为固定相，下相为流动相；取粗提物，溶解于适量固定相和流动相的混合液中，得到样品溶液；以30mL/min的流速将固定相泵入主机并充满分离螺线管，保持温度30℃，主机正向旋转，转速为900r/min，以1.7mL/min的速度泵入流动相，待流动相从管柱口流出且基线稳定后，注入样品溶液，在254nm波长下进行检测，收集出峰时间300～350min的成分，即得初步纯化物(逆流色谱图见图1)；
3、半制备液相色谱分离：
取初步纯化物，上半制备液相色谱，在254nm下检测，依次收集第一大峰和第二大峰(制备色谱图见图2)，除去溶剂即可同时得到ssMTCA和rsMTCA，色谱条件如下：
流动相：甲醇-水∶30∶70。
实施例2：
1、粗提物制备
白刺种子经高速万能粉碎机粉碎后，中药煎煮机中以1∶15kg/L的料液比进行提取，提取时间3h，提取溶剂65％的乙醇，提取次数为3次。3次提取后将提取溶液合并，回收乙醇至无醇味，加入石油醚进行反复萃取。将经过石油醚萃取后的水层于旋转蒸发仪上浓缩蒸干，加水溶解，上D101大孔树脂进行初步分离。对大孔树脂进行洗脱，洗脱溶液及浓度依次是：水、10％V/V乙醇溶液，收集10％乙醇洗脱液部分，于旋转蒸发仪上浓缩蒸干备用。
2、采用高速逆流色谱法分离：
取正丁醇：0.5％甲酸＝5∶6V/V，置于分液漏斗中配制两相溶剂系统，取上相为固定相，下相为流动相；取粗提物，溶解于适量固定相和流动相的混合液中，得到样品溶液；以20mL/min的流速将固定相泵入主机并充满分离螺线管，保持温度30℃，主机正向旋转，转速为800r/min，以1.5mL/min的速度泵入流动相，待流动相从管柱口流出且基线稳定后，注入样品溶液，在280nm波长下进行检测，收集出峰时间300～350min的成分，即得初步纯化物(逆流色谱图见图1)；
3、半制备液相色谱分离：
取初步纯化物，上半制备液相色谱，在254nm下检测，依次收集第一大峰和第二大峰(制备色谱图见图2)，除去溶剂即可同时得到ssMTCA和rsMTCA，色谱条件如下：
流动相：甲醇-水＝25∶75。
实施例3：
1、粗提物制备
白刺种子经高速万能粉碎机粉碎后，中药煎煮机中以1∶8kg/L的料液比进行提取，提取时间1.5h，提取溶剂95％的乙醇，提取次数为3次。3次提取后将提取溶液合并，回收乙醇至无醇味，加入石油醚进行反复萃取。将经过石油醚萃取后的水层于旋转蒸发仪上浓缩蒸干，加水溶解，上D101大孔树脂进行初步分离。对大孔树脂进行洗脱，洗脱溶液及浓度依次是：水、10％V/V乙醇溶液，收集10％乙醇洗脱液部分，于旋转蒸发仪上浓缩蒸干备用。
2、采用高速逆流色谱法分离：
取正丁醇：0.5％甲酸＝5∶6V/V，置于分液漏斗中配制两相溶剂系统，取上相为固定相，下相为流动相；取粗提物，溶解于适量固定相和流动相的混合液中，得到样品溶液；以40mL/min的流速将固定相泵入主机并充满分离螺线管，保持温度25℃，主机正向旋转，转速为1000r/min，以3.0mL/min的速度泵入流动相，待流动相从管柱口流出且基线稳定后，注入样品溶液，在270nm波长下进行检测，收集出峰时间300～350min的成分，即得初步纯化物(逆流色谱图见图1)；
3、半制备液相色谱分离：
取初步纯化物，上半制备液相色谱，在254nm下检测，依次收集第一大峰和第二大峰(制备色谱图见图2，)，除去溶剂即可同时得到ssMTCA和rsMTCA，色谱条件如下：
流动相：甲醇-水∶28∶72。
对目标化合物进行检测：
(1)HPLC检测：
流动相A：甲醇；流动相B：水。梯度洗脱条件如下：0-16min，10％-27％A；16-21min，27％-29％A；21-35min，29％-45％A。流速：1mL/min，柱温：30℃，检测波长：254nm。
上述条件下的ssMTCA色谱图如图3所示，经检测，该化合物的纯度可达99.5％。
上述条件下的rsMTCA色谱图如图5所示，经检测，该化合物的纯度可达97.8％。
对初步纯化物的HPLC检测图谱见图4，ss和rsMTCA的总含量为97.20％。由图3～5分析可知，本发明高速逆流色谱法能够将MTCA从白刺种子粗提物中有效分离；通过半制备色谱法，能够有效地对ss和rs两种构型化合物进行分离纯化。
(2)结构鉴定
本发明制备的目标化合物ssMTCA的鉴定数据为：白色粉末，m.p。290-293℃，1HNMR(DMSO-d6)δ：11.18(1H，s，9-NH)，7.43(1H，d，J＝7.8Hz，H-5)，7.34(1H，d，J＝8.1Hz，H-8)，7.08(1H，dd，J＝7.5，15.0Hz，H-7)，7.00(1H，dd，J＝7.8，15.0Hz，H-6)，4.53(1H，m，H-1)，3.66(1H，dd，J＝4.5，11.4Hz，H-3)，3.19(1H，dd，J＝3.6，12.3Hz，H-4a)，2.79(1H，t，J＝13.5Hz，H-4b)，1.63(3H，d，J＝6.6Hz，CH3)。13C NMR(DMSO-d6)δ：17.04(q，CH3)，49.02(d，C-1)，132.41(s，C-1a)，57.55(d，C-3)，23.26(t，C-4)，106.62(s，C-4a)，117.88(d，C-5)，126.10(s，C-5a)，118.74(d，C-6)，121.62(d，C-7)，111.16(d，C-8)，136.38(s，C-8a)，169.87(s，COOH)。以上数据与文献1、2对照一致，确定其结构为(1S，3S)-1-甲基-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-羧基酸(ssMTCA)。
本发明制备的目标化合物rsMTCA：白色粉末，mp240-243℃，1H NMR(DMSO-d6)δ：11.02(1H，s，9-NH)，7.42(1H，d，J＝7.8Hz，H-5)，7.32(1H，d，J＝7.8Hz，H-8)，7.09(1H，t，J＝7.2Hz，H-7)，7.00(1H，t，J＝7.5Hz，H-6)，4.61(1H，br，H-1)，3.80(1H，br，H-3)，3.07(1H，dd，J＝4.8，15.9Hz，H-4a)，2.95(1H，m，H-4b)，1.57(3H，d，J＝6.6Hz，CH3)。13C NMR(DMSO-d6)δ：18.57(q，CH3)，46.35(d，C-1)，134.00(s，C-1a)，52.73(d，C-3)，22.88(t，C-4)，105.54(s，C-4a)，117.76(d，C-5)，126.19(s，C-5a)，118.52(d，C-6)，121.05(d，C-7)，112.00(d，C-8)，136.09(s，C-8a)。以上数据与文献2对照一致，确定其结构为(1R，3S)-1-甲基-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-羧基酸(rsMTCA)。
小结：
本发明中，HSCCC技术是作为一种粗分离工具来使用的，首先通过本技术将两种非对应异构的吲哚生物碱MTCA的混合体分离出来，通过此技术获得的混合物的纯度较高，几乎不含有其它杂质。其次，利用制备色谱技术进一步地将不同手性的MTCA混合物在25min内完全分离开来，且目标化合物的纯度能达到95％以上。
参考文献：
[1]Li X N，Chu C，Cheng D P，et al.Two Alkaloids from Asparaguscochinchinensis[J].Chemistry of Natural Compounds，2014，50(2)：326-328.
[2]Li G，Deng Z，Li J，et al.Chemical constituents from starfishAsterias rollestoni[J].JOURNAL OF CHINESE PHARMACEUTICAL SCIENCES.，2004，13：81-86.

Claims (8)

1.从白刺种子中分离纯化1-甲基-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-羧基酸的方法，其特征在于：它包括如下操作步骤：
(1)粗提物的制备：
取白刺种子，以乙醇为溶剂进行提取，提取液回收乙醇至无醇味，加入石油醚进行萃取，取水层，上非极性大孔吸附树脂柱，依次用水、10％V/V乙醇溶液洗脱，收集10％V/V乙醇洗脱液，浓缩、干燥即得粗提物；
(2)采用高速逆流色谱法分离：
取正丁醇∶0.5％甲酸＝5∶6V/V，置于分液漏斗中配制两相溶剂系统，取上相为固定相，下相为流动相；取粗提物，溶解于适量固定相和流动相的混合液中，得到样品溶液；以20～40mL/min的流速将固定相泵入主机并充满分离螺线管，保持温度25～30℃，主机正向旋转，转速为800～1000r/min，以1.5～3.0mL/min的速度泵入流动相，待流动相从管柱口流出且基线稳定后，注入样品溶液，在254nm波长下进行检测，收集出峰时间300～350min的成分，除去溶剂即得1-甲基-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-羧基酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，提取所用乙醇的浓度为65％～95％。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，提取所用乙醇的浓度为70％～80％。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，提取所用乙醇的浓度为75％V/V。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述大孔吸附树脂为D101树脂。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，固定相的流速为30mL/min，温度为30℃，主机转速为900r/min，流动相的流速为1.7mL/min。
7.从白刺种子中同时提取分离(1S，3S)、(1R，3S)两种构型的1-甲基-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-羧基酸的方法，其特征在于：它包括如下操作步骤：
(1)粗提物的制备：
取白刺种子，以乙醇为溶剂进行提取，提取液回收乙醇至无醇味，加入石油醚进行萃取，取水层，上非极性大孔吸附树脂柱，依次用水、10％V/V乙醇溶液洗脱，收集10％V/V乙醇洗脱液，浓缩、干燥即得粗提物；
(2)采用高速逆流色谱法分离：
取正丁醇∶0.5％甲酸＝5∶6V/V，置于分液漏斗中配制两相溶剂系统，取上相为固定相，下相为流动相；取粗提物，溶解于适量固定相和流动相的混合液中，得到样品溶液；以20～40mL/min的流速将固定相泵入主机并充满分离螺线管，保持温度25～30℃，主机正向旋转，转速为800～1000r/min，以1.5～3.0mL/min的速度泵入流动相，待流动相从管柱口流出且基线稳定后，注入样品溶液，在254nm波长下进行检测，收集出峰时间300～350min的成分，即得初步纯化物；
(3)半制备液相色谱分离：
取初步纯化物，上半制备液相色谱，在254nm下检测，依次收集第一和第二大色谱峰洗脱部位，除去溶剂即可得到(1S，3S)-1-甲基-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-羧基酸、(1R，3S)-1-甲基-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-羧基酸，色谱条件如下：
流动相∶甲醇-水＝(25～30)∶(75～70)。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：步骤(3)中，流动相为甲醇-水＝30∶70。
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