CN104957356B - 一种糖基化改性提高卵白蛋白起泡性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种糖基化改性提高卵白蛋白起泡性的方法，考察葡萄糖添加量、反应pH值、反应温度和反应时间对卵白蛋白起泡性和稳定性的影响，采用Box‑Behnken试验设计方法，利用DesignExpert软件进行响应面分析。结果表明：经糖基化改性后卵白蛋白起泡性模型显著，而稳定性模型不显著。糖基化改性最佳工艺参数：反应温度60℃、pH值7.4、葡萄糖添加量3.5%、加热时间30min，此条件下测得改性卵白蛋白起泡性为140.3%，与未改性卵白蛋白起泡性112.5%进行比较，其起泡性提高24.7%。

Description

一种糖基化改性提高卵白蛋白起泡性的方法

技术领域

本发明属于卵白蛋白起泡技术领域，具体涉及一种糖基化改性提高卵白蛋白起泡性的方法。

背景技术

鸡蛋作为一个完整的生命体，含有生命生长发育所必须的元素，它由一些特殊的生理活性物质组成，其生理功能远远超出现在的研究成果。鸡蛋中含有丰富的蛋白质作为一种食品材料，被广泛添加到各种食品中。它不仅具有提高营养价值的功能，并且具有改善各种食品品质和功效的特性。卵白蛋白具有很强的乳化性与起泡性，这方面的功能特性可广泛的应用于食品行业。尤其是卵白蛋白的起泡性，在蛋糕、冰淇淋类食品中的应用相当普遍^[1-3]。

通常食品泡沫是由连续液相和分散气相所构成。而蛋白质可否成为起泡剂主要靠其迁移至界面的速率和其形成稳定膜的能力。经糖基化改性^[4-8]后，使卵白蛋白某些性质发生改变从而使卵白蛋白的起泡性增强。

影响卵白蛋白起泡性的因素有很多，如蛋白质浓度、pH值、温度、离子强度、糖类、脂类等^[9]，蛋鸡的年龄和产蛋季节也对卵白蛋白的起泡性有一定的影响。目前通过研究发现对卵白蛋白进行适度改性可以提高卵白蛋白的起泡性能，其改性的方法包括物理法、化学法、酶法和基因工程方法等^[10-13]。蛋白质的化学改性是通过对蛋白质中侧链基团羟基(-OH)、羧基(-COOH)、氨基(-NH₂)等进行改性或加入其它的基团，从而改善其起泡性和稳定性。食品蛋白质的化学改性方法分为：酰化、磷酸化、糖基化、氨基酸共价连接和氧化等方法。化学改性的优点有：设备要求和成本低、反应时间短、改性效果好等优点。所以蛋白质改性的主流方法是化学改性。酶法改性分有：水解改性和非水解改性。蛋白质通过蛋白酶催化水解生成蛋白肽，蛋白肽易溶解且具有多种生物学活性。蛋白质的酶法改性对蛋白质的营养性不影响，也不产生毒性等优点^[18]。

卵白蛋白为磷酸糖蛋白，有高度二级结构的球型结构，相对分子质量为43.0kDa，等电点为4.5，50%以上为疏水氨基酸残基，含3.5%糖基及埋藏于疏水中心内部的1个二硫键、4个自由巯基，巯基均包埋在蛋白质的疏水核心部分。卵白蛋白相对有序度较高，结构较为致密，自然卵白蛋白在储运过程中会转化为热稳定性的S-卵白蛋白构型。卵白蛋白的结构独特性决定其分子改性以改善其功能特性时，呈现出与其他常用食品蛋白不同的机理与条件。随着蛋品深加工、综合利用的研究深入，鸡蛋生物活性成分的多级联产提纯技术日趋发展与完善，卵白蛋白作为鸡蛋清中含量最大的蛋白组分，是各种方法提纯其它功能活性成分时必须首先分离的对象，采用生物、物理或化学方法改善卵白蛋白的功能特性，对促进其高效综合利用具有重要意义。

本发明主要是采用湿法糖基化改性改善卵白蛋白起泡性的方法，研究单糖类起泡剂的使用对卵白蛋白起泡性的影响，同时寻找一种合适的卵白蛋白起泡剂的替代品。

发明内容

本发明的目的在于提供一种糖基化改性提高卵白蛋白起泡性的方法，能有效预测实际糖基化产物起泡性，具有一定应用价值。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种糖基化改性提高卵白蛋白起泡性的方法：将1.0g卵白蛋白与适量葡萄糖混合均匀，其中葡萄糖的体积质量分数为3.5%，溶于100mL蒸馏水中，搅拌，调节pH值=7.4，得蛋白浓度10mg/mL的混合溶液；60℃水浴加热30min后，取出迅速冷却，得到改性后卵白蛋白。

本发明的显著优点在于：本发明能有效预测实际糖基化产物起泡性，具有一定应用价值。

附图说明

图1是葡萄糖添加量对卵白蛋白起泡性和稳定性的影响

图2是pH值对卵白蛋白起泡性和稳定性的影响

图3是反应温度对卵白蛋白起泡性和稳定性的影响

图4是反应时间对卵白蛋白起泡性和稳定性的影响

图5是各两因素交互作用的响应面及等高线图，a.反应温度与pH值，b.葡萄糖量与反映温度。

图6是卵白蛋白改性前后泡沫显微图像A.改性前，B.改性后。

具体实施方式

1材料与方法

1.1实验仪器和试剂

1.1.1实验仪器

FA2004电子天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；HJ-3数显恒温磁力搅拌器，常州澳华仪器有限公司；PHS-4A实验室pH计，上海向阳科学仪器厂；LXJ-IIB离心机，上海安亭科学仪器厂；HH-S2恒温水浴锅，金坛市成辉仪器厂；FD5-series真空冷冻干燥机，上海海信科学仪器厂；FJ200-SH型数显高速分散均质机，上海标本模型制造厂。

1.1.2实验试剂

新鲜鸡蛋：超市购买；硫酸铵、氢氧化钠、葡萄糖、盐酸等均为分析纯。

1.2实验方法

1.2.1卵白蛋白提取

选择新鲜的鸡蛋，将蛋白与蛋黄分离，蛋白与去离子水按重量比为1:1稀释，在25℃下磁力搅拌10min，用纱布过滤，然后边磁力搅拌，边缓慢加入PEG8000，用量为混合液的15wt.%；搅拌1-2h，混合液在5000r/min的条件下离心20min，取上清液边磁力搅拌，边用1mol/L HCl调pH值至4.5，静置30min后产生沉淀，收集沉淀即为卵白蛋白纯品，冷冻干燥后冷藏备用。

1.2.2卵白蛋白糖基化改性

分别称量1.0g卵白蛋白和一定量葡萄糖，混合均匀后_，溶于50mL蒸馏水中搅拌，调节pH值到某一确定值后，定容到100mL容量瓶中，得到蛋白浓度10mg/mL的混合溶液，混合溶液转移到烧杯中，将烧杯置于60℃水浴锅中加热30min后，取出迅速冷却，得到改性后卵白蛋白待测液^[16]。

1.2.3起泡性及稳定性测定

试验组：取改性后待测液，在室温下于高速组织捣碎机中均质2min(7000r/min)，然后快速移至250mL量筒，记下均质停止时泡沫体积V₀，起泡性根据均质停止时泡沫体积与100mL的百分比来计算。

起泡性/%=V₀/100×100

均质停止20min后，记下此时泡沫体积V₁，泡沫稳定性根据20min时泡沫占均质停止时泡沫的体积分数来计算^[17]。

泡沫稳定性/%=V₁/V₀×100

空白对照组：取1.0g卵白蛋白溶解于100mL蒸馏水中制得待测液，将该待测液按试验组处理方法进行处理计算即可。

2结果与分析

2.1单因素试验

2.1.1葡萄糖添加量对卵白蛋白起泡性和稳定性的影响

在温度60℃、pH值8.0、反应时间30min的条件下，分别将1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%葡萄糖（混合溶液体积的质量百分数）与1.0g卵白蛋白混合进行反应，考察葡萄糖添加量对卵白蛋白起泡性和稳定性的影响，确定葡萄糖量的取值范围。结果如图1所示。

由图1可知，随着葡萄糖量的增加，卵白蛋白起泡性和稳定性也随之提高，当葡萄糖量达到3.0%时，卵白蛋白起泡性和稳定性达到最佳，继续增加葡萄糖的量，卵白蛋白起泡性和稳定性随葡萄糖量的增加而下降。因而确定葡萄糖量为3.0%时，卵白蛋白改性效果最好。

2.1.2反应pH值对卵白蛋白起泡性和稳定性的影响

在温度60℃、葡萄糖量3.0%、反应时间30min的条件下，分别调节反应液pH值5.0、6.0、7.0、8.0、9.0进行反应，考察反应pH值对卵白蛋白起泡性和稳定性的影响，从而确定pH值取值范围。结果如图2所示。

由图2可知，随着pH值升高，卵白蛋白的起泡性和稳定性随之增加，当pH值达到8.0左右；卵白蛋白起泡性和的稳定性达到最高值。继续升高pH值，卵白蛋白起泡性和稳定性逐渐下降。因而确定pH值8.0左右，卵白蛋白改性效果最佳。原因可能是pH值小于8.0时为酸性，会抑制糖基化的发生。pH值大于8.0时为碱性碱性过强会破坏蛋白质的一级结构^[19]。

2.1.3反应温度对卵白蛋白起泡性和稳定性的影响

在pH值8.0、葡萄糖量3.0%、反应时间30min的条件下，分别调节温度30℃、40℃、50℃、60℃、70℃进行反应，探究反应温度对卵白蛋白起泡性和稳定性的影响，以此确定温度的取值范围。结果如图3所示。

由图3可知，随着温度的升高卵白蛋白起泡性和稳定性也随之上升，当温度达到60℃时，卵白蛋白起泡性和稳定性都达到最高值，继续升高反应温度，卵白蛋白起泡性和稳定性逐渐降低。从而确定反应温度60℃时，卵白蛋白改性效果最佳。原因可能是适当的升高温度有助于糖基化的发生，当温度过高时过高的温会破蛋白质的活性。从而降低蛋白质性能。

2.1.4反应时间对卵白蛋白起泡性和稳定性的影响

在pH值8.0、葡萄糖量3.0%、温度60℃的条下，分别设置反应时间10min、20min、30min、40min、50min进行反应，考察反应时间对卵白蛋白起泡性和稳定性的影响，因此确定反应时间范围。结果如图4所示。

由图4可知，随着反应时间的增加，卵白蛋白起泡性和稳定性也随之上升，当反应时间达到30min时，卵白蛋白起泡性和稳定性都达到最高值，继续增加反应时间，卵白蛋白起泡性和稳定性逐步降低。因而可知反应时间30min时，卵白蛋白改性效果最好。

2.2响应面法优化试验

2.2.1回归方程的建立与显著性分析

表1响应面试验因素及水平编码表

表2Box-Behnken中心组合试验结果

表3回归模型方差分析结果

注：**表示极显著(p<0.01)，*表示显著(0.01<p<0.05)

在单因素的基础上，确定了反应温度、pH值、反应时间、葡萄糖添加量4个因素的实验水平，水平编码见表1，并在此基础上采用统计软件Design-Export8.0.5进行Box-Behnken实验设计，见表2，对表2实验数据进行二次项回归拟合，得起泡性的拟合回归方程为：

Y=5.72300X₁+38.71000X₂+47.64000X₃+0.21500X₁X₂-0.12500X₁X₃+0.75000X₂X₃-0.056650X²-3.66500X₂ ²-6.56500X₃ ²-259.23000。

对该模型进行显著性检验，结果见表3。对起泡稳定性进行回归分析后，发现该模型不显著，因而不进行方差分析。从表3可以看出，模型P<0.0001表明模型极显著。失拟项P=0.5100>0.05模型失拟项不显著。相关系数R ²=0.9952，模型修正决定系数R² _adj=0.9890，说明该模型高度显著，可以用此模型对糖基化改性卵白蛋白进行分析和预测。由表3可知，X₂、X₃、X₁X₂、X₁ ²、X₂ ²、X₃ ²对卵白蛋白起泡性影响极显著（P<0.01），X₁X₃影响显著（P<0.05），X₁、X₂X₃对其影响不显著采用逐步回归分析的方法，表明所探究因素对响应值影响极大且不是简单的一次线性关系。通过比较方差分析表中各因素的F值可知，反应温度、葡萄糖量、对卵白蛋白起泡性的影响分别达到了极显著与显著水平。

2.2.2两因素交互作用对卵白蛋白起泡性的影响

由图5可知，反应温度和pH值的交互作用对卵白蛋白起泡性具有显著的影响，反应温度在50～60℃范围内，随着pH值增大，卵白蛋白起泡性逐渐升高，而反映温度在60～70℃范围内，随着pH值增大，卵白蛋白起泡性呈现逐渐下降的趋势。由图5b可知，反应温度和葡萄糖量的交互作用对卵白蛋白起泡性具有显著的影响，葡萄糖量在2～3%范围内，随着反应温度升高，卵白蛋白起泡性逐渐升高，而葡萄糖量在3～4%范围内，随着反映温度升高，卵白蛋白起泡性先有提升然后呈稳定趋势。

利用得到的回归方程，分别对X₁、X₂、X₃求偏阶倒数，并令其偏倒等于零，通过Design-Export8.0.5软件计算可知，糖基化改性卵白蛋白最优工艺参数：反应温度60.77℃、pH值7.42、葡萄糖量3.47%，起泡性预测值为140.995%。最优工艺参数修正为反应温度60℃、pH值7.4、葡萄糖量3.5%，所得卵白蛋白起泡性实际值为140.3%，说明建立模型可靠性高，可作为卵白蛋白起泡性的最佳条件。在反应温度60℃、pH值7.4条件下处理未经糖基化改性的卵白蛋白起泡性为112.5%，因此，与此条件下卵白蛋白起泡性相比，经糖基化改性后卵白蛋白起泡性可提高24.7%。

2.3卵白蛋白糖基化改性前后泡沫微观结构观察

微观结构观察主要从几方面入手：泡沫大小、泡沫量、泡沫分散情况。由图6(A)可知，未经糖基化改性的卵白蛋白泡沫大而分散，且大小不一，泡沫量比较少。而从图6(B)可知，经糖基化改性后卵白蛋白泡沫小而密集，且大小相对均匀，泡沫量较大。由两图比较可知，卵白蛋白经糖基化改性后效果显著。

3结论

以卵白蛋白为原料添加适量葡萄糖对其进行改性，并以改性后卵白蛋白起泡性作为评价指标。在单因素基础上采用响应面法(RSM)优化了糖基化改性卵白蛋白工艺条件。通过验证实验和回归分析得到糖基化改性的最佳条件为：反应温度60℃、pH值7.4、葡萄糖添加量3.5%、反映时间30min，在此条件下得到的糖基化产物的起泡性为140.3%。与响应面分析理论值140.995%能较好的吻合，说明该模型能有效预测实际糖基化产物起泡性，具有一定应用价值。同时与未改性前卵白蛋白起泡性112.5%进行比较可知，改性后卵白蛋白的起泡性明显提高。

参考文献

1]刘宝全，张立莹，范圣第，等.鸡蛋深加工技术[J].农牧产品开发，1999，(6)：26-27.

[2]张兰威，牟光庆，许高升.蛋制品工艺学[M].哈尔滨：黑龙江科学技术出版社，1996：176.

[3]王旭清，罗岩，司伟达，等.影响蛋清蛋白起泡性的工艺研究[J].食品工业，2013，34(5)：54-55.

[4]张倩，杨振，张艳贞，等.蛋白质糖基化修饰的研究方法及其应用[J].生物技术通报，2003，(1)：47-49.

[5]赵海贤，于国萍.干法糖基化改性提高大豆分离蛋白的乳化性[J].食品研究与开发，2012，33(9)：7-11.

[6]于滨，迟玉杰.糖基化对卵白蛋白分子特性及乳化性的影响[J].中国农业科学，2009，(7)：2499-2504.

[7]罗永康，张爱荣.糖基化反应改善蛋白质功能特性的研究进展[J].食品科技，2004，(7)：4-10.

[8]于滨，迟玉杰.糖基化改善蛋清蛋白功能性的研究[J].中国家禽，2009，31(7)：15-18.

[9]FennemaOR，王璋译.食品化学[M].北京：中国轻工业出版社，1991：230-233.

[10]黄友如，华欲飞.大豆分离蛋白改性研究[J].粮食与油脂，2002，(8)：5-7.

[11]李瑜，尹春明.化学磷酸化改性小麦面筋蛋白[J].食品工艺科技，2006，31(4)：20-23.

[12]涂勇刚，聂旭亮，徐明生，等.响应曲面法优化木瓜蛋白酶改善蛋清蛋白起泡性能工艺[J].食品科学，2011，32(20)：84-88.

[13]魏晓芳，刘会洲.热变性对蛋白质结构及泡沫行为的影响[J].化工冶金，2000，21(4)：379-3821.

[14]聂珍媛，夏金兰，潘佳民.卵白蛋白的分离及卵白蛋白铁的制备与表征[J].天然产物研究与开发，2008，(5)：870-875.

[15]李健，王晓文，岳喜庆.卵白蛋白提取及可食性膜制备[J].食品工业科技，2011，32(1)：232-234.

[16]麻小娟.糖基化对卵白蛋白的构象及其抗原性和过敏原性的影响[D].南昌：南昌大学，2011，(6)：34-35.

[17]黄群，金永国，马美湖，等.超高压处了理对S-卵白蛋白构想与功能特性的影响[J].农业机械学报，2013，44(3)：161-166.

[18]何智坤.卵白蛋白的干燥加热硒酸化及其性质和结构的研究[D].云南：云南大学，2013，(6)：7-12.

[19]崔冰.卵白蛋白-CMC-复合体系相行为及糖基化改性研究[D].武汉：华中农业大学，2012，(6)：44-46.

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (1)

1.一种糖基化改性提高卵白蛋白起泡性的方法，其特征在于：将1.0g卵白蛋白和葡萄糖混合均匀，其中葡萄糖的体积质量分数为3.5%，溶于100mL蒸馏水中，搅拌，调节pH值至7.4，得到蛋白浓度10mg/mL的混合溶液；60℃水浴加热30min后，取出迅速冷却，得到改性后卵白蛋白。