CN102499320B - 一种抑制蛋白在水溶液中聚集并物性修饰的方法及产物和应用 - Google Patents

一种抑制蛋白在水溶液中聚集并物性修饰的方法及产物和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抑制蛋白在水溶液中聚集并物性修饰的方法及产物和应用，包括以下步骤：(1)将蛋白用缓冲液溶解，蛋白的质量份数为1～10份，缓冲溶液是pH？6.0～8.0的0.01M～0.2M的任意缓冲盐体系；(2)将大分子拥挤试剂加入步骤(1)的溶液中混匀，在60～95℃的恒温磁力搅拌器中搅拌4～30h后，冰浴迅速冷却至室温；(3)将产物离心，除去不溶物；(4)将步骤(3)得到的产物透析后，得到少聚集的蛋白物性修饰产物。本发明方法简单且易于操作，产物在抑制蛋白聚集的同时，蛋白水溶性、乳化性、起泡性、热稳定性等功能性质有很大的提高，能用于制备改性蛋白、食品添加剂或医药行业中。

Description

一种抑制蛋白在水溶液中聚集并物性修饰的方法及产物和应用
技术领域
本发明属于食品领域，涉及蛋白的物性修饰，特别涉及一种新型的抑制蛋白聚集的方法，以及这些修饰蛋白在食品领域的应用。
背景技术
蛋白质广泛存在于动植物中，其具有的营养特性和功能特性(乳化性、起泡性、持水性等)使其在食品工业以及医药保健、饲料行业均得到了广泛的应用，其不仅对食品在制造、加工或保藏中的物理化学性质起着重要的作用，还可以有效的提高产品的营养价值。但天然植物蛋白具有高疏水性，在某些食品体系中的应用受到限制，因而需要对蛋白进行物性修饰来提高其功能特性，扩大其应用领域。
在食品和医药领域，已经对蛋白质聚集和影响蛋白质聚集的因素有了广泛的研究，如高温(热处理)、高盐或低酸等因素常常诱发蛋白质聚集。这是因为蛋白分子的一些反应基团在水溶液中由于分子内作用力以及疏水相互作用被包埋于结构的内部，而热处理能使其从分子内部转移到分子表面，从而因疏水相互作用等诱发蛋白聚集。但是热处理又是蛋白制品加工过程中不可避免的单元操作，如热杀菌、喷雾干燥等。因此目前如何控制蛋白质在热处理过程中或高盐、低酸性条件下的聚集行为成为蛋白质领域的研究难点。近几年有文献报道蛋白质的聚集和许多有害基因疾病的关系，说明探讨蛋白质聚集行为的控制不仅在食品领域，在生物医药领域同样具有非常重要的理论和实际意义。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术存在的缺陷，提供一种新型的抑制蛋白在水溶液中聚集的方法，同时得到一种功能性良好的蛋白物性修饰产物，使其兼具蛋白质的功能性质和糖的稳定作用，以作为食品添加剂应用于食品生产中。本发明模拟生命科学领域的大分子拥挤体系，将多糖和蛋白质处于加入高分子惰性拥挤试剂聚乙二醇的大分子拥挤环境中，体系中的拥挤试剂为多糖和惰性高聚物聚乙二醇，蛋白能够处于少聚集的反应状态，同时对蛋白进行物性修饰，以改善蛋白功能特性，扩大其应用范围。该法具有操作方便、性能稳定等优点，方法具有良好的工业化、规模化的应用前景及有利于食品及医用放大生产，其对于扩展蛋白的应用空间具有相当重要的实际意义。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种抑制蛋白在水溶液中聚集并物性修饰的方法，包括以下步骤：
(1)将蛋白用缓冲液溶解，蛋白的质量份数为1～10份，缓冲溶液是pH6.0～8.0的0.01M～O.2M的任意缓冲盐体系；
(2)将大分子拥挤试剂加入步骤(1)的溶液中混匀，在60～95℃的恒温磁力搅拌器中搅拌4～30h后，冰浴迅速冷却至室温；所述大分子拥挤试剂为包括多糖和惰性拥挤试剂聚乙二醇在内的大分子物质的混合物；
(3)将步骤(2)得到的产物离心，除去不溶物；
(4)将步骤(3)得到的产物透析以除去惰性拥挤试剂聚乙二醇及其它小分子物质，得到少聚集的蛋白物性修饰产物。
优选地，步骤(2)所述大分子拥挤试剂的总质量份数为10～40份，多糖与聚乙二醇的质量比为1:1～1:3。
优选地，步骤(1)所述蛋白为大豆7S球蛋白、大豆分离蛋白、乳清蛋白、β-乳球蛋白或牛血清白蛋白BSA。
优选地，步骤(2)所述多糖为葡聚糖、卡拉胶、瓜尔豆胶和可溶性淀粉中的一种或一种以上。
优选地，步骤(2)所述惰性拥挤试剂聚乙二醇为PEG2000、PEG3000、PEG3350或PEG4000。
优选地，步骤(3)所述离心速度为3000～5000rpm,离心时间为20～30min。
优选地，步骤(4)所述透析温度为4℃，时间为24～48h。
本发明所述的方法来抑制蛋白质的聚集，同时对蛋白质进行物性修饰。所述的蛋白产物明显抑制了蛋白宏观聚集体的形成，是一种有效的蛋白质去聚集方法，且产物水溶性、乳化性、起泡性等功能性质有很大的提高。能用于制备改性蛋白、食品添加剂或医药行业中，尤其是产物经纯化后作为可溶性的蛋白添加剂应用于酸性运动型饮料中或者作为乳化剂应用于肉制品中。
本发明原理如下：
本发明采用“大分子拥挤环境”作为生成蛋白物性修饰产物的反应体系，通过将生命科学领域中拥挤理论对蛋白质结构稳定的科学现象进一步应用于修饰蛋白的制备，当体系中存在有高浓度的生物大分子时，大分子之间的反应遵循分子排斥容积理论，促进反应向溶质总体积减小的方向，即朝结合方向移动；另外，大分子拥挤环境下蛋白分子构型趋于稳定，蛋白变性程度以及聚合程度将会减轻。大分子拥挤环境能够使蛋白分子在水溶液中处于非聚集或者较少聚集的反应状态。
本发明将蛋白、多糖和聚乙二醇置于大分子拥挤环境中，多糖既充当了大分子拥挤试剂，又能与蛋白发生糖基化反应，形成共价结合的大分子复合物，其既保留了蛋白质的表面活性又具有多糖的亲水性能。同时惰性拥挤试剂聚乙二醇的加入能进一步有效促进反应的进行及抑制蛋白聚集。
糖基化对于蛋白质聚集的调节作用直接与肽链的折叠和聚集的动态区间有关，通过共价键结合到蛋白质肽链上的糖链能够影响蛋白质的聚集行为，而这可以用来解释糖基化对于蛋白质聚集行为的调节作用，一方面，通过糖基化降低蛋白质表面疏水性而抑制了蛋白质的聚集行为，另一方面，糖链共价连接到蛋白质分子上减少了蛋白质正电荷的数量导致蛋白质电荷发生变化，从而改变了分子之间的静电排斥作用，最终影响了蛋白质的聚集行为。因此，本发明想通过糖基化及大分子拥挤环境共同作用控制蛋白质聚集行为。
在蛋白质聚集过程中，浊度和粒度是常用来表征蛋白聚集程度的重要指标。因此在反应过程中选用浊度和粒度作为检测指标。浊度反映了溶液中不同悬浮粒子的大小及数量，蛋白质聚集至一定程度，溶液中颗粒直径变大，溶液浊度升高，也称为宏观聚集体。粒径分布采用马尔文纳米粒度分布仪来研究，利用动态光散射技术研究溶液中聚集体粒子的粒径分布。方法为将糖基化产物溶于缓冲液中，于540nm处测定浊度，另取上述溶液用粒度分布仪测定粒径分布。
并对蛋白的溶解性、乳化性、起泡性、热稳定性等功能性质进行测定，以反映蛋白功能特性的显著改善。
本发明具有如下的优点及有益效果：
(1)在大分子拥挤环境下进行蛋白与多糖的共价接枝，不仅有利于共价接枝的进行，而且用大分子拥挤环境及糖基化两个方面共同作用来抑制蛋白质的聚集行为，为一种全新的抑制蛋白质聚集的方法。
(2)本发明有效解决了食品加工过程中热处理导致的蛋白质聚集行为，且能在高盐、低酸等食品加工过程中常遇到的极端条件下应用，并对蛋白进行有效的物性修饰，从而扩展了蛋白质在食品中的应用范围。
(3)本发明具有工业化、规模化的应用前景，亦能有效应用于生物医药领域。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
准确称取0.5g大豆7S球蛋白，溶解于10mL 0.01mol/L pH 6.5的磷酸钠缓冲溶液，称取1.5g葡聚糖和1.5g聚乙二醇(PEG3000)加入到缓冲液中混匀，于恒温磁力搅拌器中在95℃反应6h，反应结束后迅速冰浴冷却至室温(25℃)终止反应，产物5000rpm离心20min,于4℃透析48h以除去惰性拥挤试剂聚乙二醇及其它小分子物质。将产物冷冻干燥，得到蛋白的物性修饰产物。
对比实施例1
准确称取0.5g大豆7S球蛋白，溶解于10mL 0.01mol/L pH 6.5的磷酸钠缓冲溶液，称取1.5g葡聚糖加入到缓冲液中混匀，于恒温磁力搅拌器中在95℃反应6h，反应结束后迅速冰浴冷却至室温(25℃)终止反应，产物5000rpm离心20min,于4℃透析48h以除去惰性拥挤试剂聚乙二醇及其它小分子物质。将产物冷冻干燥，得到糖基化的蛋白产物。
采用浊度表征蛋白的聚集程度，采用乳化性来标准蛋白的功能特性。实施例1和对比实施例1蛋白的聚集情况及乳化性对比结果如表1所示：
表1
从表1可以看出，本发明实施例1中以聚乙二醇作为惰性大分子拥挤试剂所得蛋白物性修饰产物浊度较低，且蛋白的乳化性更好。说明在惰性拥挤试剂聚乙二醇存在的大分子拥挤环境下对蛋白进行改性，能有效的抑制蛋白在水溶液中的聚集，并显著改善蛋白的乳化性能。
实施例2
准确称取0.1g大豆7S球蛋白，溶解于10mL 0.01mol/L pH 6的磷酸钠缓冲溶液，称取0.5g葡聚糖和1.5g聚乙二醇(PEG2000)加入到缓冲液中混匀，于恒温磁力搅拌器中在80℃反应10h，反应结束后迅速冰浴冷却至室温(25℃)终止反应，产物4000rpm离心30min,于4℃透析24h以除去惰性拥挤试剂聚乙二醇及其它小分子物质。将产物冷冻干燥，得到蛋白的物性修饰产物。
对比实施例2
准确称取0.1g大豆7S球蛋白，溶解于10mL 0.01mol/L pH 6的磷酸钠缓冲溶液，称取0.5g葡聚糖加入到缓冲液中混匀，于恒温磁力搅拌器中在80℃反应10h，反应结束后迅速冰浴冷却至室温(25℃)终止反应，产物4000rpm离心30min,于4℃透析24h以除去惰性拥挤试剂聚乙二醇及其它小分子物质。将产物冷冻干燥，得到糖基化的蛋白产物。
表2
从表2可以看出，本发明实施例2中以聚乙二醇作为惰性大分子拥挤试剂所得蛋白物性修饰产物平均粒径较低，且蛋白的起泡性更好。说明在惰性拥挤试剂聚乙二醇存在的大分子拥挤环境下对蛋白进行改性，能有效的抑制蛋白在水溶液中的聚集，并显著改善蛋白的起泡性能。
实施例3
准确称取0.6g大豆分离蛋白，溶解于20mL 0.01mol/L pH 8的磷酸钠缓冲溶液，称取3g卡拉胶和5g聚乙二醇(PEG3350)加入到缓冲液中混匀，于恒温磁力搅拌器中在60℃反应30h，反应结束后迅速冰浴冷却至室温(25℃)终止反应，产物4000rpm离心30min,于4℃透析30h以除去惰性拥挤试剂聚乙二醇及其它小分子物质。将产物冷冻干燥，得到蛋白的物性修饰产物。将产物纯化后作为乳化剂应用于火腿肠等肉制品中，其能产生比普通大豆分离蛋白更好的乳化性及热稳定性，使火腿肠的风味及口感更佳。
实施例4
准确称取0.5g大豆分离蛋白，溶解于10mL 0.01mol/L pH 7.5的磷酸钠缓冲溶液，称取1.5g葡聚糖和1.5g聚乙二醇(PEG3000)加入到缓冲液中混匀，于恒温磁力搅拌器中在90℃反应8h，反应结束后迅速冰浴冷却至室温(25℃)终止反应，产物4000rpm离心30min,于4℃透析48h以除去惰性拥挤试剂聚乙二醇及其它小分子物质。将产物冷冻干燥，得到蛋白的物性修饰产物。将产物纯化后作为可溶性的蛋白添加剂应用于酸性运动型饮料中，由于此蛋白物性修饰产物在酸性条件下不易形成聚集，其溶解性良好，且应用于饮料中，可增加饮料蛋白含量，提高饮料的营养价值。

Claims (9)

1.一种抑制蛋白在水溶液中聚集并物性修饰的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将蛋白用缓冲液溶解，蛋白的质量份数为1～10份，缓冲溶液是pH6.0～8.0的0.01M～O.2M的任意缓冲盐体系；
(2)将大分子拥挤试剂加入步骤(1)的溶液中混匀，在60～95℃的恒温磁力搅拌器中搅拌4～30h后，冰浴迅速冷却至室温；所述大分子拥挤试剂为包括多糖和惰性拥挤试剂聚乙二醇在内的大分子物质的混合物；
(3)将步骤(2)得到的产物离心，除去不溶物；
(4)将步骤(3)得到的产物透析后，得到少聚集的蛋白物性修饰产物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述大分子拥挤试剂的总质量份数为10～40份，多糖与聚乙二醇的质量比为1:1～1:3。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述蛋白为大豆7S球蛋白、大豆分离蛋白、乳清蛋白、β-乳球蛋白或牛血清白蛋白BSA。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述多糖为葡聚糖、卡拉胶、瓜尔豆胶和可溶性淀粉中的一种以上。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述惰性拥挤试剂聚乙二醇为PEG2000、PEG3000、PEG3350或PEG4000。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述离心速度为3000～5000rpm,离心时间为20～30min。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述透析温度为4℃，时间为24～48h。
8.一种根据权利要求1～7任一项所述的方法制备的少聚集的蛋白物性修饰产物。
9.根据权利要求8所述蛋白物性修饰产物的应用，其特征在于，所述产物经纯化后作为可溶性的蛋白添加剂应用于酸性运动型饮料中或者作为乳化剂应用于肉制品中。
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