CN104940948A - 一种亲水性基因运载实时示踪器及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种亲水性基因运载实时示踪器及其制备方法。所述的亲水性基因运载实时示踪器是一种荧光纳米球，其形貌为均匀的球形，粒径在100-200nm范围，表面具有强正电荷；所述的荧光纳米球是在硫化锌掺锰量子点表面包覆带有正电的两亲性高分子。本发明制得的亲水性基因运载实时示踪器，裸露在示踪器表面的正电咪唑可以与具有负电性的基因进行有效结合，包覆的红色荧光硫化锌掺锰量子点可实现基因递送的实时可视化；该示踪器既能运载基因序列又可以进行实时荧光示踪的功能，荧光稳定，毒性极低，并且基因转染效率高，能够在癌细胞细胞质中酸性条件下降解，这在基因治疗中具有重要的意义。

Description

一种亲水性基因运载实时示踪器及其制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种亲水性基因运载实时示踪器及其制备方法，应用于基因治疗中的荧光成像跟踪。

背景技术

在过去的几十年里，基因递送和治疗已经受到世界各地研究学者的广泛研究。尽管病毒载体提供了更大的转染效率，但是在安全性方面具有很大的问题。因此，设计出在靶器官和组织中能实现安全、高效，并具有靶向性的高基因表达的基因载体是至关重要的，这不仅能实现基因进入细胞，并且能够示踪其在细胞内循环的路径。

近年来，关于药物输送和荧光成像已经得到了很好的研究，但是荧光实时示踪基因递送的研究还没有得到很大的研究。由于荧光蛋白、基因染料和纳米颗粒可以与基因通过共价键结合，因此可以作为荧光载体，但是，新的化学键的生成也许会破坏基因，导致低的甚至失去基因转染效率或者治疗作用。为了保持基因的序列和结构不变，选择一种新的基因运载方法至关重要。

由于基因上有大量的磷酸二酯键，因此基因序列是显示负电性的，我们选择带有正电性的载体通过静电作用与基因结合，将其载入体内，进行治疗作用。通过这种物理作用，基因的原始性质保持不变，并且能够得到高转染效率和基因治疗作用。目前，常用的基因运载体为聚合高分子，基因转染效率好(Wang,W.；Nan,W.J.；Sun,L.；Liu,W.G.,React.Funct.Polym.2013,73,993-1000.)，但是不能对基因运载过程进行实时示踪。因此对荧光材料进行表面正电修饰又成为一大亮点，通过配体交换得到亲水性正电荧光颗粒(Li,J.M.；Zhao,M.X.；Su,H.；Wang,Y.Y.；Tan,C.P.；Ji,L.N.；Mao,Z.W.,Biomaterials 2011,32,7978-7987.)，这些方法将无机油相颗粒转入水相的过程费时费力，配体交换修饰还会导致荧光性能降低。

因此发展新的合成方法，制备出分散性好、尺寸均一、荧光性能稳定、转染效率高的亲水性基因运载实时示踪器，这对病理诊断和基因治疗在临床上的潜在应用具有重要的指导意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种亲水性基因运载实时示踪器及其制备方法。

本发明所述的亲水性基因运载实时示踪器是一种荧光纳米球，其形貌为均匀的球形，粒径在100-200nm范围，表面具有强正电荷；所述的荧光纳米球是在硫化锌掺锰量子点表面包覆带有正电的两亲性高分子；所述的带有正电的两亲性高分子的正电单体为氯化1-烯丙基-3-甲基咪唑。

本发明所述的亲水性基因运载实时示踪器的制备方法，其具体步骤如下：

e.向反应釜中加入0.5-1.5mL氯仿、0.13-0.15g氯化1-烯丙基-3-甲基咪唑、0.05-0.1g甲基丙烯酸、4.0-5.0g苯乙烯、0.01-0.2g偶氮二异丁腈，搅拌混合均匀，80-120℃下加热反应8-12h；

f.待反应釜冷却至室温，然后加入甲醇得到沉淀，干燥后即为带有正电的两亲性高分子；

g.将0.1-1.0mg聚乙二醇、50-300μL硫化锌掺锰量子点的氯仿溶液、30.0-50.0mg步骤b得到的带有正电的两亲性高分子、0.60-0.95mL氯仿混合均匀后，倒入5-10mL的pH＝8.0-10的氢氧化钠水溶液中，超声乳化得到白色乳浊液；

h.将步骤c的乳浊液在45-65℃水浴中搅拌加热1-3h，待氯仿完全挥发后，自然冷却至室温，8000-11000r/min离心10-20min，最后将得到的沉淀分散到4-8mL超纯水中，即得到带有正电的亲水性基因运载实时示踪器。

上述的亲水性基因运载实时示踪器运载示踪基因的方法为：将亲水性基因运载实时示踪器与基因按质量比10:1-50:1在37℃培养箱中孵育1-5小时，通过静电作用得到亲水性基因运载实时示踪器与基因的复合体，该复合体与细胞37℃下共同培养。

本发明的有益效果：采用本发明所述的方法制得的亲水性基因运载实时示踪器，过程简单易操作，裸露在示踪器表面的正电咪唑可以与具有负电性的基因进行有效结合，包覆的红色荧光硫化锌掺锰量子点可实现基因递送的实时可视化，实现既能运载基因序列又可以进行实时荧光示踪的功能。合成过程中加入了可降解高分子聚乙二醇，在基因运输过程中，聚乙二醇可以保护基因序列不被生物降解，并且可以整体降低基因运载实时示踪器的细胞毒性。人体内的网状内皮系统包括巨噬细胞、网状细胞等，当大尺寸异物粒进入体内之后很容易被网状内皮系统所清除，从而脱离血液循环，而尺寸在100-200nm之间的胶体微粒适合体内的运输，不会被网状内皮系统清除，更由于我们在其表面修饰了亲水性官能团羧基和正电咪唑，这更有利于血液循环和体内循环过程；并且在水相中有很好的分散性和稳定性，每16.8mg荧光纳米球示踪器对应1-3mL去离子水。制得的亲水性基因运载实时示踪器具有很强的基因序列静电结合能力，荧光稳定，毒性极低，并且基因转染效率高，能够在癌细胞细胞质中酸性条件下降解，这在生物技术领域，特别是基因治疗中的荧光成像跟踪领域具有重要的意义。

附图说明

图1：实施例1制得的亲水性基因运载实时示踪器的透射电镜照片。

图2：实施例1制得的亲水性基因运载实时示踪器的X射线衍射照片。

图3：实施例1制得的亲水性基因运载实时示踪器与基因结合之后的透射电镜照片。

图4：实施例1制得的亲水性基因运载编码增强型绿色荧光蛋白质粒的凝胶电泳分析照片。

图5：实施例1制得的亲水性基因运载实时示踪器实时荧光示踪运载编码增强型绿色荧光蛋白质粒过程的共聚焦显微镜照片。

图6：实施例2制得的亲水性基因运载实时示踪器的透射电镜照片。

具体实施方式

实施例1

1、向反应釜中加入1.0mL氯仿、0.184g氯化1-烯丙基-3-甲基咪唑、0.046g甲基丙烯酸、5.0g苯乙烯、0.096g偶氮二异丁腈，搅拌混合均匀，100℃下加热反应10h；

2、待反应釜完全冷却至室温，产物用甲醇沉淀干燥得到带有正电的两亲性高分子；

3、将0.2mg聚乙二醇、150μL浓度1mol/L的硫化锌掺锰量子点的氯仿溶液(锰的摩尔掺杂量为5％)、50.0mg步骤b得到的带有正电的两亲性高分子、0.85mL氯仿混合均匀后，倒入10mL的pH＝9.0的氢氧化钠水溶液，超声乳化得到白色乳浊液；

4、超声结束之后在50℃下水浴搅拌加热1.5h，油相溶剂氯仿完全挥发后，自然冷却至室温，10000r/min离心15min，再将沉淀分散到6mL超纯水中，即得到带有正电的亲水性基因运载实时示踪器。其透射电镜照片、X射线衍射照片如图1，2所示。

5、基因运载实时示踪器与编码增强型绿色荧光蛋白质粒以40:1的质量比在37℃培养箱中孵育3小时，通过静电作用得到基因运载实时示踪器/编码增强型绿色荧光蛋白质粒复合体，其透射电镜照片如3所示。

6、基因运载实时示踪器负载基因的能力通过琼脂糖凝胶电泳来考察，我们选择编码增强型绿色荧光蛋白质粒作为基因模型。基因运载实时示踪器与1μg编码增强型绿色荧光蛋白质粒以不同的质量比进行结合，基因运载实时示踪器与编码增强型绿色荧光蛋白质粒的质量比分别为1:0，1:1，1:5，1:10，1:15，1:20和1:50，各混合物在37℃下培育涡旋3小时。分别取10μL不同比例基因运载实时示踪器与编码增强型绿色荧光蛋白质粒静电结合之后的混合物于凝胶孔中，80mV，90min，跑胶结束后在凝胶成像仪上进行数据分析。1％琼脂糖凝胶电泳的配制方法为：0.5g琼脂糖溶解到50mL 0.5×三羟甲基氨基甲烷缓冲液中，加热完全溶解，当温度冷却到50-60℃时滴加2.5μL溴化乙锭(10mg/mL)。凝胶电泳分析结果如图4所示。

7、在六孔板每孔中加2×10⁵个HepG2肝癌细胞，加入1mL含有10％胎牛血清的DMEM细胞培养基。在37℃培养箱中孵育24h之后，弃去培养液，加入1mL包含基因运载实时示踪器/编码增强型绿色荧光蛋白质粒复合体(20.0μg基因运载实时示踪器+1.0μg编码增强型绿色荧光蛋白质粒)的无胎牛血清的DMEM细胞培养基，细胞饥饿培养4h之后，用2mL含有10％胎牛血清的DMEM细胞培养基替换之前的培养液，分别继续培养12h，24h，48h，培养时间结束，弃去每孔的培养液，用磷酸盐缓冲液清洗细胞3次，用10％甲醛固定细胞15min。在共聚焦显微镜上拍摄照片，选用488nm光源激发硫化锌掺锰量子点(锰的摩尔掺杂量为5％)和绿色荧光蛋白，分别得到红色和绿色照片。我们以硫化锌掺锰量子点(锰的摩尔掺杂量为5％)的红色荧光对基因运输过程进行实时荧光示踪，以编码增强型绿色荧光蛋白质粒表达出来的绿色荧光蛋白来证明基因的成功运输和表达。共聚焦照片如图5所示。

实施例2

1、向反应釜中加入1mL氯仿、0.138g氯化1-烯丙基-3-甲基咪唑、0.092g甲基丙烯酸、5.0g苯乙烯、0.096g偶氮二异丁腈，搅拌混合均匀，100℃下加热反应10h；

2、待反应釜完全冷却至室温，产物用甲醇沉淀干燥得到带有正电的两亲性高分子；

3、将0.2mg聚乙二醇、150μL浓度1mol/L的硫化锌掺锰量子点的氯仿溶液(锰的摩尔掺杂量为5％)、50.0mg步骤b得到的带有正电的两亲性高分子、0.85mL氯仿混合均匀后，倒入10mL的pH＝9.0的氢氧化钠水溶液，超声乳化得到白色乳浊液；

4、超声结束之后在50℃下水浴搅拌加热1.5h，油相溶剂氯仿完全挥发后，自然冷却至室温，10000r/min离心15min，再将沉淀分散到6mL超纯水中，即得到带有正电的亲水性基因运载实时示踪器。其透射电镜照片如图6所示

5、基因运载实时示踪器与编码增强型绿色荧光蛋白质粒以40:1的质量比在37℃培养箱中孵育3小时，通过静电作用得到基因运载实时示踪器/编码增强型绿色荧光蛋白质粒复合体。

6、基因运载实时示踪器负载基因的能力通过琼脂糖凝胶电泳来考察，我们选择编码增强型绿色荧光蛋白质粒作为基因模型。基因运载实时示踪器与1μg编码增强型绿色荧光蛋白质粒以不同的质量比进行结合，基因运载实时示踪器与编码增强型绿色荧光蛋白质粒的质量比分别为1:0，1:1，1:5，1:10，1:15，1:20和1:50，各混合物在37℃下培育涡旋3小时。分别取10μL不同比例基因运载实时示踪器与编码增强型绿色荧光蛋白质粒静电结合之后的混合物于凝胶孔中，80mV，90min，跑胶结束后在凝胶成像仪上进行数据分析。1％琼脂糖凝胶电泳的配制方法为：0.5g琼脂糖溶解到50mL 0.5×三羟甲基氨基甲烷缓冲液中，加热完全溶解，当温度冷却到50-60℃时滴加2.5μL溴化乙锭(10mg/mL)。

7、在六孔板每孔中加2×10⁵个HepG2肝癌细胞，加入1mL含有10％胎牛血清的DMEM细胞培养基。在37℃培养箱中孵育24h之后，弃去培养液，加入1mL包含基因运载实时示踪器/编码增强型绿色荧光蛋白质粒复合体(20.0μg基因运载实时示踪器+1.0μg编码增强型绿色荧光蛋白质粒)的无胎牛血清的DMEM细胞培养基，细胞饥饿培养4h之后，用2mL含有10％胎牛血清的DMEM细胞培养基替换之前的培养液，分别继续培养12h，24h，48h，培养时间结束，弃去每孔的培养液，用磷酸盐缓冲液清洗细胞3次，用10％甲醛固定细胞15min。在共聚焦显微镜上拍摄照片，选用488nm光源激发硫化锌掺锰量子点(锰的摩尔掺杂量为5％)和绿色荧光蛋白，分别得到红色和绿色照片。我们以硫化锌掺锰量子点(锰的摩尔掺杂量为5％)的红色荧光对基因运输过程进行实时荧光示踪，以编码增强型绿色荧光蛋白质粒表达出来的绿色荧光蛋白来证明基因的成功运输和表达。

Claims (3)

1.一种亲水性基因运载实时示踪器，其特征在于，该示踪器是一种荧光纳米球，其形貌为均匀的球形，粒径在100-200nm范围，表面具有强正电荷；所述的荧光纳米球是在硫化锌掺锰量子点表面包覆带有正电的两亲性高分子；所述的带有正电的两亲性高分子的正电单体为氯化1-烯丙基-3-甲基咪唑。

2.一种亲水性基因运载实时示踪器的制备方法，其特征在于，其具体步骤如下：

a.向反应釜中加入0.5-1.5mL氯仿、0.13-0.15g氯化1-烯丙基-3-甲基咪唑、0.05-0.1g甲基丙烯酸、4.0-5.0g苯乙烯、0.01-0.2g偶氮二异丁腈，搅拌混合均匀，80-120℃下加热反应8-12h；

b.待反应釜冷却至室温，然后加入甲醇得到沉淀，干燥后即为带有正电的两亲性高分子；

c.将0.1-1.0mg聚乙二醇、50-300μL硫化锌掺锰量子点的氯仿溶液、30.0-50.0mg步骤b得到的带有正电的两亲性高分子、0.60-0.95mL氯仿混合均匀后，倒入5-10mL的pH＝8.0-10的氢氧化钠水溶液中，超声乳化得到白色乳浊液；

d.将步骤c的乳浊液在45-65℃水浴中搅拌加热1-3h，待氯仿完全挥发后，自然冷却至室温，8000-11000r/min离心10-20min，最后将得到的沉淀分散到4-8mL超纯水中，即得到带有正电的亲水性基因运载实时示踪器。

3.一种亲水性基因运载实时示踪器运载示踪基因的方法，其特征在于，其具体操作步骤为：将亲水性基因运载实时示踪器与基因按质量比10:1-50:1在37℃培养箱中孵育1-5小时，通过静电作用得到亲水性基因运载实时示踪器与基因的复合体，该复合体与细胞37℃下共同培养。