CN104928338B

CN104928338B - 一种赤魟软骨多肽类血管生成抑制因子快速制备方法

Info

Publication number: CN104928338B
Application number: CN201510235435.9A
Authority: CN
Inventors: 王斌; 潘欣; 迟长凤; 陈荫; 赵玉勤; 孙坤来
Original assignee: Zhejiang Ocean University ZJOU
Current assignee: Zhejiang Ocean University ZJOU
Priority date: 2015-05-11
Filing date: 2015-05-11
Publication date: 2020-09-08
Anticipated expiration: 2035-05-11
Also published as: CN104928338A

Abstract

本发明公开了一种赤魟软骨多肽类血管生成抑制因子快速制备方法，其具有细胞膜悬液的制备、细胞膜固定相的制备、赤魟软骨蛋白的制备与酶解、赤魟软骨多肽类血管生成抑制因子的制备等步骤。该血管生成抑制因子能有效抑制鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)的血管生成，并对荷Lewis肺癌小鼠肺癌组织的血管内皮细胞生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和血小板衍生生长因子(PDGF)三种促血管生成因子的表达有明显的抑制作用。

Description

一种赤魟软骨多肽类血管生成抑制因子快速制备方法

技术领域

本发明涉及一种海洋生物活性多肽的制备方法，尤其涉及一种赤魟软骨多肽类血管生成抑制因子快速制备方法。

背景技术

肿瘤的生长和转移都依赖于新生血管的生成，采用抗血管疗法治疗肿瘤具有高效、低毒、不易产生耐药性的优点。因此，寻找活性显著地血管生成抑制因子成为抗肿瘤药物的研究热点。肿瘤血管生成受多种因子影响，而血管内皮生长因子（VEGF）是最重要的血管生成因子，也是内皮细胞VEGF信号转导的主要执行者，直接参与新生血管形成过程。研究表明VEGF必须通过与位于细胞膜上的特异性受体VEGFR-2结合来发挥作用，因而以VEGFR-2为靶点进行药物筛选成为抗肿瘤血管生成的重要策略。

制备和筛选方法在抗肿瘤药物研究中非常重要，而常规的方法费时长，所得到的活性物质假阳性率高，而比较理想的制备和筛选方法应是将制备方法和筛选方法有效结合，最大限度地保证抗肿瘤药物研发的成功率。

软骨鱼软骨富含多种抗肿瘤活性物质，主要包括血管生成抑制因子、抗肿瘤因子和抗入侵因子，但目前尚未得到有效利用。虽已有报道从赤魟、孔鳐等软骨中制备血管生成抑制因子，但得到的活性物质因为分子量大，含量低，而难以进行药物开发。

基于以上现状，本发明以赤魟软骨为材料，采用酶解和细胞膜色谱技术建立了肿瘤血管生成抑制因子的快速制备方法，并提供一种活性显著的赤魟软骨多肽类血管生成抑制因子。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种赤魟软骨多肽类血管生成抑制因子的快速制备方法。

本发明为解决上述技术问题所采取的技术方案为：一种赤魟软骨多肽类血管生成抑制因子的快速制备方法，其包括以下步骤：

1）细胞膜悬液的制备：取血管内皮生长因子特异性受体（VEGFR）高表达的、处于对数生长期的肿瘤细胞，采用MEM培养基（含10% 的胎牛血清），于37℃、5 % CO₂培养箱内培养。当细胞计数达到10⁵～10⁷时，应用胰蛋白酶将细胞消化下来，于4℃、1000 r/min离心10～15 min，取沉淀用生理盐水清洗2次后，加入到50 mM的Tris-HCl溶液超声25～30 min破碎细胞，将悬液于1000 r/min、4℃条件下离心5～10 min，取上清液于12000 r/min、4℃ 条件下离心20～25 min，得细胞膜沉淀，用生理盐水重悬，清洗2～3 次后，加入生理盐水至膜蛋白含量为2.0～2.3 mg/mL，即为细胞膜悬液；

2）细胞膜固定相的制备：取预处理的大孔球形硅胶加入到低温（4℃）反应管中，在振荡条件下，按照固液比1g：25～30 mL将细胞膜悬液加入到反应管中，吸附15～20 h，超声研磨20～25 min后，于4000 r/min离心10～15 min，收集沉淀，用生理盐水洗涤2～3次，除去未结合的细胞膜，得细胞膜固定相；

3）赤魟软骨蛋白的制备与酶解：将破碎匀浆的赤魟软骨按固液比1 g：10～15 mL加入到1.0 mol/L盐酸胍溶液中，4 ℃、振荡抽提44～48 h后，于4 ℃、10000 r/min离心15～20 min，取上清液装入截留分子量为1 kDa的透析袋中，用双蒸水于4 ℃以下透析22～24h，透析液冷冻干燥，得赤魟软骨蛋白；将赤魟软骨蛋白按固液比1 g :15～20 mL加入到巴比妥钠-盐酸缓冲液（pH 7.0）中，按照赤魟软骨蛋白质量的1.5～2.5%加入中性蛋白酶（酶活力≥1.0×10⁵ U/g），酶解温度55～65 ℃，酶解3～4 h，将溶液升温至90～95℃，并于此温度保持10～15 min，温度降至35～40 ℃，用NaOH调pH至7.5～8.0，按照赤魟软骨蛋白质量的1.5～2.5%加入胰蛋白酶（酶活力≥1.9×10⁴ U/g），酶解温度为35～40 ℃，酶解3～4h，将溶液升温至90～95℃，并于此温度保持10～15 min，于10000 r/min、4℃ 条件下离心15～20 min，取上清液，上清液采用1 kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于1 kDa部分，置于截留分子量为100的透析袋中，三蒸水透析24 h，冻干，得酶解物活性组分；

4）赤魟软骨多肽类血管生成抑制因子的制备：将酶解物活性组分用三蒸水配成0.03～0.05 mg/mL的溶液，将细胞膜固定相按照固液比1 g:10mL加入到活性组分溶液中，35～40℃保温孵育2～3 h后，4000 r/min离心10～15 min，留取上清液，沉淀用三蒸水淋洗8～10次，合并洗涤液和上清液，冻干，即为细胞膜吸附剩余物；利用RP-HPLC建立酶解物活性组分和细胞膜吸附剩余物的指纹图谱，纯化制备消失或峰面积显著减小的差异峰，并对其进行鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）血管生成抑制作用测定，活性最强峰经蛋白/多肽序列分析仪测定氨基酸序列为Gly-Tyr-Ile-Cys-Pro-Gln-Trp（GYICPQW），ESI-MS检测分子量为865.98Da。

优选，所述1）中的肿瘤细胞为肝癌细胞Bel-7402；

优选，所述2）中大孔球形硅胶的预处理方法为：将大孔球形硅胶（规格：5μm, 200Å）中加入适量HCl溶液（1 mol/L），超声处理15～20 min，转移至圆底烧瓶瓶中搅拌回流水解2～3 h后，将硅胶移至烧杯中，加双蒸水洗涤3～5次，每次25～30 min。将洗涤处理好的大孔球形硅胶减压抽干，于120 ℃下活化6～8 h。

优选，所述4）中RP-HPLC条件为：进样量为5～10 μL；色谱柱为Amethyst C18（250mm × 4.6 mm，5 μm）；洗脱条件为0～40 min内乙腈浓度由10%匀速升至50%；流速0.4 mL/min；紫外检测波长为215 nm。

本发明为解决上述第三个技术问题所采取的技术方案为：一种赤魟软骨多肽类血管生成抑制因子的应用，其特征在于Gly-Tyr-Ile-Cys-Pro-Gln-Trp（GYICPQW）对鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）血管生成具有显著抑制作用，Gly-Tyr-Ile-Cys-Pro-Gln-Trp（GYICPQW）具有安全无毒副作用和活性强等优点，可用于制备抑制血管生成、防治肿瘤的药物。

与现有技术相比，本发明的优点在于：提取、纯化工艺较先进、快速、准确度高，制得的血管生成抑制因子活性显著，可用于肿瘤疾病的治疗。

附图说明

图1是本发明步骤示意图；

图2是本发明的酶解物活性组分（A）和细胞膜吸附剩余物（B）的RP-HPLC指纹图谱。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例：一种赤魟软骨多肽类血管生成抑制因子的制备方法，制备流程如下：赤魟软骨→组织破碎→盐酸胍抽提→超滤→细胞膜固定相吸附→HPLC指纹图谱比较分析→血管生成抑制因子。

1）细胞膜悬液的制备：取血管内皮生长因子特异性受体（VEGFR）高表达的、处于对数生长期的肝癌细胞Bel-7402，采用MEM培养基（含10% 的胎牛血清），于37℃、5 % CO₂培养箱内培养，当细胞计数达到10⁷时，应用胰蛋白酶将细胞消化下来，于4℃、1000 r/min离心10 min，取沉淀用生理盐水清洗2遍后，加入到50 mM的Tris-HCl溶液超声30 min破碎细胞。将悬液于1000 r/min、4℃条件下离心5 min，取上清液于12000 r/min、4℃ 条件下离心25min，得到细胞膜沉淀，用生理盐水重悬，清洗3 次后，加入生理盐水至膜蛋白含量为2.2mg/mL，即为细胞膜悬液；

2）细胞膜固定相的制备：取预处理的大孔球形硅胶加入到低温（4℃）反应管中，在振荡条件下，按照固液比1g：25 mL将细胞膜悬液加入到反应管中，吸附15 h，超声研磨25min后，于4000 r/min离心15 min，收集沉淀，用生理盐水洗涤3次，除去未结合的细胞膜，得Bel-7402细胞膜固定相。

3）赤魟软骨蛋白的制备与酶解：将破碎匀浆的赤魟软骨按固液比1 g : 15 mL加入到1.0 mol/L盐酸胍溶液中，4 ℃、振荡抽提48 h后，于4 ℃、10000 r/min离心15 min，取上清液装入截留分子量为1 kDa的透析袋中，用双蒸水于4 ℃以下透析24 h，透析液冷冻干燥，得赤魟软骨蛋白；将赤魟软骨蛋白按固液比1 g : 20 mL加入到巴比妥钠-盐酸缓冲液（pH 7.0）中，按照赤魟软骨蛋白质量的2%加入中性蛋白酶（酶活力≥1.0×10⁵ U/g），酶解温度60 ℃，酶解4 h，将溶液升温至95℃，并于此温度保持10 min，温度降至37 ℃，用NaOH调pH至7.8，按照赤魟软骨蛋白质量的2%加入胰蛋白酶（酶活力≥1.9×10⁴ U/g），酶解温度为37℃，酶解4 h，将溶液升温至95℃，并于此温度保持15 min，于10000 r/min、4℃ 条件下离心20 min，取上清液，上清液采用1 kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于1 kDa部分，置于截留分子量为100的透析袋中，三蒸水透析24 h，冻干，得酶解物活性组分。

4）赤魟软骨多肽类血管生成抑制因子的制备：将酶解物活性组分用三蒸水配成0.05 mg/mL的溶液，将细胞膜固定相按照固液比1 g:10 mL加入到活性组分溶液中，37℃保温孵育2 h后，4000 r/min离心15 min，留取上清液，沉淀用三蒸水淋洗8次，合并洗涤液和上清液，冻干，即为细胞膜吸附剩余物；利用RP-HPLC（进样量为5～10 μL；色谱柱为Amethyst C18（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；洗脱条件为0～40 min内乙腈浓度由10%匀速升至50%；流速0.4 mL/min；紫外检测波长为215 nm）建立酶解物活性组分和细胞膜吸附剩余物的指纹图谱，纯化制备消失或峰面积显著减小的差异峰，并对其进行鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）血管生成抑制作用测定，得赤魟软骨多肽类血管生成抑制因子P3（图1）。

5）结构检测：收集对鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）血管生成抑制作用最强的多肽P3，经检测为单一峰，经蛋白/多肽序列分析仪测定氨基酸序列为Gly-Tyr-Ile-Cys-Pro-Gln-Trp（GYICPQW），ESI-MS检测分子量为865.98 Da。

将制得的Gly-Tyr-Ile-Cys-Pro-Gln-Trp（GYICPQW）进行鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）血管生成抑制活性测定，测定方法参考贺国安、罗进贤、张添元等“改进的鸡胚绒毛尿囊膜技术－无气室孵育法”（记载于《中山大学学报（自然科学版）》，2003年第2册（第42卷）：第126-128页）。结果表明，赤魟软骨多肽类血管生成抑制因子GYICPQW显著抑制鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）血管生成并呈剂量依赖关系（表1）。

表1 赤魟软骨多肽类血管生成抑制因子对鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）血管生成的抑制作用

将制得的赤魟软骨多肽类血管生成抑制因子GYICPQW进行促血管生成因子表达影响的测定，测定方法参考孙晓佳、张月英、贾青等“蝎毒多肽提取物联合化疗抑制Lewis肺癌血管生成实验研究”（记载于《中国中药杂志》，2011年第12期（第36卷）：第1644-1649页）。给荷Lewis 肺癌小鼠腹腔注射赤魟血管生成抑制因子GYICPQW (20.0mg/kg·d×14)，取肺癌组织进行免疫组化检查，检测结果表明：赤魟软骨血管生成抑制因子GYICPQW对血管内皮细胞生长因子(VEGF) 、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF) 和血小板衍生生长因子(PDGF) 等三种促血管生成因子的表达有明显的抑制作用(表2) 。

表2 赤魟软骨多肽类血管生成抑制因子对促血管生成因子表达的抑制作用

尽管已结合优选的实施例描述了本发明，然其并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，能够对在这里列出的主题实施各种改变、同等物的置换和修改，因此本发明的保护范围当视所提出的权利要求限定的范围为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江海洋学院

<120> 一种赤魟软骨多肽类血管生成抑制因子快速制备方法

<130> zjou-2015-wb0502

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 1

Gly Tyr Ile Cys Pro Gln Trp

1 5

Claims

1.一种赤魟软骨多肽类血管生成抑制因子快速制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）细胞膜悬液的制备：取血管内皮生长因子特异性受体高表达的、处于对数生长期的肿瘤细胞，采用含胎牛血清的培养基，于CO₂培养箱内培养；当细胞计数达到10⁵～10⁷时，应用胰蛋白酶将细胞消化，然后离心，取沉淀；将沉淀用生理盐水清洗后，加入到50mM的Tris-HCl溶液超声破碎细胞，将悬液于1000 r/min、4℃条件下离心，取上清液于12000 r/min、4℃条件下离心20～25 min，得细胞膜沉淀，用生理盐水重悬，清洗后，加入生理盐水至膜蛋白含量为2.0～2.3 mg/mL，即为细胞膜悬液；

2）细胞膜固定相的制备：取预处理的大孔球形硅胶加入到低温反应管中，在振荡条件下，按照固液比1g：25～30mL将细胞膜悬液加入到反应管中，吸附15～20h，超声研磨20～25min后，于4000 r/min离心10～15min，收集沉淀，用生理盐水洗涤2～3次，除去未结合的细胞膜，得细胞膜固定相；

3）赤魟软骨蛋白的制备与酶解：将破碎匀浆的赤魟软骨按固液比1g：10～15mL加入到1.0mol/L 盐酸胍溶液中，4℃、振荡抽提44～ 48h后，于4℃、10000r/min离心15～20 min，取上清液装入截留分子量为 1kDa 的透析袋中，用双蒸水于4℃以下透析22～24h，透析液冷冻干燥，得赤魟软骨蛋白；将赤魟软骨蛋白按固液比1g :15～20 mL 加入到巴比妥钠-盐酸缓冲液中，按照赤魟软骨蛋白质量的1.5～2.5%加入酶活力≥ 1.0×10⁵ U/g的中性蛋白酶，酶解温度55～65℃，酶解3～4h，将溶液升温至90～95℃，并于此温度保持10～15min，温度降至35～40℃，用NaOH调pH至7.5～8.0，按照赤魟软骨蛋白质量的1.5～2.5%加入胰蛋白酶，酶解温度为35～40℃，酶解3～4h，将溶液升温至90～95℃，并于此温度保持10～15min，于10000r/min、4℃条件下离心15～20min，取上清液，上清液采用1kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于1kDa部分，置于截留分子量为100的透析袋中，三蒸水透析24h，冻干，得酶解物活性组分；

4）赤魟软骨多肽类血管生成抑制因子的制备：将酶解物活性组分用三蒸水配成0.03～0.05mg/mL的溶液，将细胞膜固定相按照固液比1g:10mL加入到活性组分溶液中，35～40℃保温孵育2～3h后，4000 r/min离心10～15min，留取上清液，沉淀用三蒸水淋洗8～10次，合并洗涤液和上清液，冻干，即为细胞膜吸附剩余物；利用RP-HPLC建立酶解物活性组分和细胞膜吸附剩余物的指纹图谱，纯化制备消失或峰面积显著减小的差异峰，并对其进行鸡胚绒毛尿囊膜CAM血管生成抑制作用测定，活性最强峰经蛋白/多肽序列分析仪测定氨基酸序列为Gly-Tyr-Ile-Cys-Pro-Gln-Trp，ESI-MS检测分子量为865.98Da；

所述步骤1）中的肿瘤细胞为肝癌细胞Bel-7402；

所述步骤2）中大孔球形硅胶的预处理方法为：将规格为5μm的200Å大孔球形硅胶中加入HCl溶液，超声处理15～20min，转移至圆底烧瓶瓶中搅拌回流水解2～3h后，将硅胶移至烧杯中，加双蒸水洗涤3～5次，每次25～30min，将洗涤处理好的大孔球形硅胶减压抽干，于120℃下活化6～8h；

所述步骤4）中的RP-HPLC条件为：进样量为5～10μL；色谱柱是规格为250mm×4.6 mm，5μm的Amethyst C18；洗脱条件为0～40min内乙腈浓度由10%匀速升至50%；流速0.4mL/min；紫外检测波长为215nm。