CN116478233A - 降血压海参肽及其制备方法和应用 - Google Patents
降血压海参肽及其制备方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116478233A CN116478233A CN202310674697.XA CN202310674697A CN116478233A CN 116478233 A CN116478233 A CN 116478233A CN 202310674697 A CN202310674697 A CN 202310674697A CN 116478233 A CN116478233 A CN 116478233A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sea cucumber
- antihypertensive
- peptide
- cucumber peptide
- water
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 77
- 241000251511 Holothuroidea Species 0.000 title claims abstract description 74
- 230000003276 anti-hypertensive effect Effects 0.000 title claims abstract description 32
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 13
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 25
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 16
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 11
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 9
- 108090000145 Bacillolysin Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 102000035092 Neutral proteases Human genes 0.000 claims abstract description 8
- 108091005507 Neutral proteases Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims abstract description 8
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims abstract description 8
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 claims abstract description 6
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 45
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 15
- XXMFJKNOJSDQBM-UHFFFAOYSA-N 2,2,2-trifluoroacetic acid;hydrate Chemical compound [OH3+].[O-]C(=O)C(F)(F)F XXMFJKNOJSDQBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims description 9
- 239000003480 eluent Substances 0.000 claims description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 7
- 238000009835 boiling Methods 0.000 claims description 5
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 5
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims description 5
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 5
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000011068 loading method Methods 0.000 claims description 5
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 5
- 239000002220 antihypertensive agent Substances 0.000 claims description 3
- 229940127088 antihypertensive drug Drugs 0.000 claims description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 abstract description 28
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 abstract description 18
- 238000003032 molecular docking Methods 0.000 abstract description 8
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 abstract description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 abstract description 3
- 238000012795 verification Methods 0.000 abstract description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 abstract description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 abstract description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 abstract description 2
- 102000004270 Peptidyl-Dipeptidase A Human genes 0.000 description 25
- 108090000882 Peptidyl-Dipeptidase A Proteins 0.000 description 25
- UUUHXMGGBIUAPW-UHFFFAOYSA-N 1-[1-[2-[[5-amino-2-[[1-[5-(diaminomethylideneamino)-2-[[1-[3-(1h-indol-3-yl)-2-[(5-oxopyrrolidine-2-carbonyl)amino]propanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]pentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-methylpentanoyl]pyrrolidine-2-carbon Chemical compound C1CCC(C(=O)N2C(CCC2)C(O)=O)N1C(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C1CCCN1C(=O)C(CCCN=C(N)N)NC(=O)C1CCCN1C(=O)C(CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)C1CCC(=O)N1 UUUHXMGGBIUAPW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- QIAFMBKCNZACKA-UHFFFAOYSA-N N-benzoylglycine Chemical compound OC(=O)CNC(=O)C1=CC=CC=C1 QIAFMBKCNZACKA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000005541 ACE inhibitor Substances 0.000 description 5
- 229940044094 angiotensin-converting-enzyme inhibitor Drugs 0.000 description 5
- 230000036772 blood pressure Effects 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 4
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 4
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 4
- CUKWUWBLQQDQAC-VEQWQPCFSA-N (3s)-3-amino-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(2s,3s)-1-[[(2s)-1-[(2s)-2-[[(1s)-1-carboxyethyl]carbamoyl]pyrrolidin-1-yl]-3-(1h-imidazol-5-yl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-(4-hydroxyphenyl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-methyl-1-ox Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C(C)C)C1=CC=C(O)C=C1 CUKWUWBLQQDQAC-VEQWQPCFSA-N 0.000 description 3
- 102400000345 Angiotensin-2 Human genes 0.000 description 3
- 101800000733 Angiotensin-2 Proteins 0.000 description 3
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 3
- 101000878457 Macrocallista nimbosa FMRFamide Proteins 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 229950006323 angiotensin ii Drugs 0.000 description 3
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 3
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 3
- 230000001077 hypotensive effect Effects 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 description 3
- XELZGAJCZANUQH-UHFFFAOYSA-N methyl 1-acetylthieno[3,2-c]pyrazole-5-carboxylate Chemical compound CC(=O)N1N=CC2=C1C=C(C(=O)OC)S2 XELZGAJCZANUQH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 3
- 241000965254 Apostichopus japonicus Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 2
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 2
- 235000017709 saponins Nutrition 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 102400000344 Angiotensin-1 Human genes 0.000 description 1
- 101800000734 Angiotensin-1 Proteins 0.000 description 1
- 102400000967 Bradykinin Human genes 0.000 description 1
- 101800004538 Bradykinin Proteins 0.000 description 1
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 241000251730 Chondrichthyes Species 0.000 description 1
- 244000000626 Daucus carota Species 0.000 description 1
- 241000258955 Echinodermata Species 0.000 description 1
- QXZGBUJJYSLZLT-UHFFFAOYSA-N H-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg-OH Natural products NC(N)=NCCCC(N)C(=O)N1CCCC1C(=O)N1C(C(=O)NCC(=O)NC(CC=2C=CC=CC=2)C(=O)NC(CO)C(=O)N2C(CCC2)C(=O)NC(CC=2C=CC=CC=2)C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(O)=O)CCC1 QXZGBUJJYSLZLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 description 1
- 102000005741 Metalloproteases Human genes 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 244000131316 Panax pseudoginseng Species 0.000 description 1
- 235000005035 Panax pseudoginseng ssp. pseudoginseng Nutrition 0.000 description 1
- 235000003140 Panax quinquefolius Nutrition 0.000 description 1
- 241000251555 Tunicata Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- ORWYRWWVDCYOMK-HBZPZAIKSA-N angiotensin I Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C(C)C)C1=CC=C(O)C=C1 ORWYRWWVDCYOMK-HBZPZAIKSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 235000005770 birds nest Nutrition 0.000 description 1
- 229910021538 borax Inorganic materials 0.000 description 1
- QXZGBUJJYSLZLT-FDISYFBBSA-N bradykinin Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N1[C@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)CCC1 QXZGBUJJYSLZLT-FDISYFBBSA-N 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 230000009084 cardiovascular function Effects 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 150000002270 gangliosides Chemical class 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 235000008434 ginseng Nutrition 0.000 description 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 238000000819 phase cycle Methods 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 210000004896 polypeptide structure Anatomy 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 230000005588 protonation Effects 0.000 description 1
- 230000036454 renin-angiotensin system Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000013535 sea water Substances 0.000 description 1
- 235000014102 seafood Nutrition 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000010339 sodium tetraborate Nutrition 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N trisodium borate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]B([O-])[O-] BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005526 vasoconstrictor agent Substances 0.000 description 1
- 235000005765 wild carrot Nutrition 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/10—Tetrapeptides
- C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
- C07K5/1016—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aromatic or cycloaliphatic
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/12—Antihypertensives
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
本发明公开了一种降血压海参肽及其制备方法和应用，该方法包括将海参加水均质，得到海参匀浆；向海参匀浆加入中性蛋白酶和胰蛋白酶进行酶解、离心，取上清液；将上清液超滤，收集分子量≤1000Da的海参肽；将分子量≤1000Da的海参肽过SephadexG‑15凝胶色谱柱，再利用RP‑C18反相高效液相色谱纯化分离，得到降血压海参肽。该方法制得的多肽的含量纯度高于80％，远高于相关技术提取的多肽含量，使得该方法可适合大规模工业生产、制备；该海参肽经分子对接、体外酶活验证得到其具有降低ACE酶活的功效。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种降血压海参肽及其制备方法和应用。
背景技术
海参，又名刺参、海鼠、沙噀、海黄瓜等，是指棘皮动物门、海参纲的物种，水产上的海参系指可供食用的海参。海参体壁厚而柔软，富含胶质，与燕窝、鲍鱼、鱼翅齐名，属于海味“八珍”之一，是一种名贵的水产动物。自古以来，就有“陆有人参，海有海参”之称。海参中含有许多具有重要生物学活性的物质，包括海参毒素、海参多糖、海参皂苷、海参活性肽、脂肪酸、海参神经节苷脂等，其中海参多糖和海参皂苷具有抗癌防癌、抗肿瘤、增强机体免疫力、抗凝血、延缓衰老和抗病毒等功效，也是研究最多的两种提取自海参的活性物质。
高血压是一种常见的心血管疾病，发病率高，其对心脏、脑、肾脏等靶器官具有严重损害，治疗和预防高血压是当前社会十分重要的课题。肾素-血管紧张素系统活性异常是高血压发病的主要原因，血管紧张素转换酶(angiotensinconvertingenzyme,ACE)对机体血压和心血管功能起到重要的调节作用。ACE在人体内的作用是把血管紧张素I(Angiotensin I Converting Enzyme)转化成血管紧张素II(Angiotensin II ConvertingEnzyme)，同时还会使血管舒缓激肽失活，而血管紧张素II为强烈的血管收缩物质，从而使体内血压升高。ACE是一种金属肽酶，含有1个结合Zn2+的位点，这是与底物结合的必须结合位点。Zn2+结合位点是ACE催化反应的活性基团所在部位，各种ACE抑制物的共同作用是与ACE活性部位的Zn2+结合，使之失活。天然蛋白质酶解产生的活性肽是ACE抑制物的主要来源，源于天然蛋白的ACE抑制物作为降压药物有着良好的应用前景。
相关技术中从海参中提取多肽的方法较为繁琐，海参多肽的含量较低，使得其不适合大规模工业生产、制备。
发明内容
为解决上述问题，本发明的实施例在第一方面提出了一种降血压海参肽的制备方法，其包括以下步骤：
(1)海参加水均质，得到海参匀浆；
(2)根据3500U/g向海参匀浆加入中性蛋白酶和胰蛋白酶，调节pH到6-8，在50℃水温酶解6h，酶解时间结束后，沸水浴中灭酶15min，迅速冷却至室温，置于离心机中，以4000r/min离心15min，取上清液；
(3)将上清液超滤，收集分子量≤1000Da的海参肽；
(4)分子量≤1000Da的海参肽过SephadexG-15凝胶色谱柱，洗脱液为去离子水，流速为0.5mL/min，通过对各组分ACE酶活性抑制试验进行筛选，收集具有最佳降血压活性洗脱峰对应的组分，再利用RP-C18反相高效液相色谱纯化分离，上样量为100μL，流速为1mL/min，检测波长为215nm，洗脱液自含100％乙腈开始，至10％乙腈和90％0.1％三氟乙酸-水v/v的混合液结束，进行梯度洗脱，收集52％乙腈和48％0.1％三氟乙酸-水v/v处的洗脱峰对应的组分，即为降血压海参肽。
根据本发明实施例的一种降血压海参肽的制备方法，该方法通过酶解、超滤和凝胶柱层析法从海参中制备多肽，制得的多肽的含量纯度高于80％，远高于相关技术提取的多肽含量，使得该方法可适合大规模工业生产、制备；该海参肽经分子对接、体外酶活验证得到其具有降低ACE酶活的功效。
可选地，步骤(1)中，中性蛋白酶和胰蛋白酶的比例为1:1.5。
本发明的实施例在第二方面提出了一种上述的降血压海参肽的制备方法制得的降血压海参肽，其氨基酸序列为FVAP。
根据本发明的实施例，该海参肽经分子对接、体外酶活验证得到其具有降低ACE酶活的功效。
根据本发明的实施例，本发明还提出上述的降血压海参肽在制备降血压药物中的应用，以实现海参高附加值的综合利用。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1为根据本发明实施例的降血压肽的高效液相色谱图；
图2为根据本发明实施例的降血压肽和ACE分子对接结果示意图；
图3为根据本发明实施例的降血压肽ACE抑制活性图。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的技术方案。应理解，本发明提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤；还应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。
为了更好的理解上述技术方案，下面更详细地描述本发明的示例性实施例。虽然显示了本发明的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。
实施例1
(1)称取10g海参，进行清洗后均质，加入蒸馏水定容到50mL，根据3500U/g加入中性蛋白酶和胰蛋白酶(1.5:1)，调节pH到6，然后在50℃水温酶解6h，酶解时间结束后，沸水浴中灭酶15min，然后迅速冷却至室温，置于离心机中，以4000r/min离心15min，取上清液备用。
(2)利用膜过滤系统对海参活性肽溶液进行超滤分离，利用分子量截留范围不同的超滤膜对酶解产物进行分离，得到不同分子量的活性肽，包括≥3000Da，1000-3000Da，≤1000Da等组分。测定结果为≤1000Da活性肽降血压活性最好。
(3)凝胶柱层析：收集≤1000Da的活性组分，再用Sephadex LH-20(长100cm，直径2.6cm)凝胶色谱进行分离，洗脱液为去离子水，流速为0.5mL/min，通过对各组分ACE酶活性抑制试验进行筛选；收集具有最佳降血压活性洗脱峰对应的组分，利用RP-C18反相高效液相色谱进行再进一步的分离，所用色谱柱为Gemini 5μC18，上样量为100μL，流速为1mL/min，检测波长为215nm。洗脱液自含100％乙腈开始，至10％乙腈和90％0.1％三氟乙酸-水(v/v)的混合液结束，进行梯度洗脱，收集52％乙腈和48％0.1％三氟乙酸-水(v/v)处的洗脱峰对应的组分，得到高纯度的降血压海参活性肽组分0.301g。如图1所示，C峰为该降血压活性肽的色谱峰，得到高纯度的降血压海参活性肽。
实施例2
(1)称取10g海参，进行清洗后均质，加入蒸馏水定容到50mL，根据3500U/g加入中性蛋白酶和胰蛋白酶(1:1)，调节pH到7，然后在50℃水温酶解6h，酶解时间结束后，沸水浴中灭酶15min，然后迅速冷却至室温，置于离心机中，以4000r/min离心15min，取上清液备用。
(2)利用膜过滤系统对海参活性肽溶液进行超滤分离，利用分子量截留范围不同的超滤膜对酶解产物进行分离，得到不同分子量的活性肽，包括≥3000Da，1000-3000Da，≤1000Da等组分。测定结果为≤1000Da活性肽降血压活性最好。
(3)凝胶柱层析：收集≤1000Da的活性组分，再用Sephadex LH-20(长100cm，直径2.6cm)凝胶色谱进行分离，洗脱液为去离子水，流速为0.5mL/min，通过对各组分ACE酶活性抑制试验进行筛选；收集具有最佳降血压活性洗脱峰对应的组分，利用RP-C18反相高效液相色谱进行再进一步的分离，所用色谱柱为Gemini 5μC18，上样量为100μL，流速为1mL/min，检测波长为215nm。洗脱液自含100％乙腈开始，至10％乙腈和90％0.1％三氟乙酸-水(v/v)的混合液结束，进行梯度洗脱，收集52％乙腈和48％0.1％三氟乙酸-水(v/v)处的洗脱峰对应的组分，得到高纯度的降血压海参活性肽组分0.312g。如图1所示，C峰为该降血压活性肽的色谱峰，得到高纯度的降血压海参活性肽。
实施例3
(1)称取10g海参，进行清洗后均质，加入蒸馏水定容到50mL，根据3500U/g加入中性蛋白酶和胰蛋白酶(1:1.5)，调节pH到8，然后在50℃水温酶解6h，酶解时间结束后，沸水浴中灭酶15min，然后迅速冷却至室温，置于离心机中，以4000r/min离心15min，取上清液备用。
(2)利用膜过滤系统对海参活性肽溶液进行超滤分离，利用分子量截留范围不同的超滤膜对酶解产物进行分离，得到不同分子量的活性肽，包括≥3000Da，1000-3000Da，≤1000Da等组分。测定结果为≤1000Da活性肽降血压活性最好。
(3)凝胶柱层析：收集≤1000Da的活性组分，再用Sephadex LH-20(长100cm，直径2.6cm)凝胶色谱进行分离，洗脱液为去离子水，流速为0.5mL/min，通过对各组分ACE酶活性抑制试验进行筛选；收集具有最佳降血压活性洗脱峰对应的组分，利用RP-C18反相高效液相色谱进行再进一步的分离，所用色谱柱为Gemini 5μC18，上样量为100μL，流速为1mL/min，检测波长为215nm。洗脱液自含100％乙腈开始，至10％乙腈和90％0.1％三氟乙酸-水(v/v)的混合液结束，进行梯度洗脱，收集52％乙腈和48％0.1％三氟乙酸-水(v/v)处的洗脱峰对应的组分，得到高纯度的降血压海参活性肽组分0.333g。如图1所示，C峰为该降血压活性肽的色谱峰，得到高纯度的降血压海参活性肽。
实施例4
取上述实施例1-3的海参多肽样品，用Folin-酚法检测其多肽含量；三个实施例的海参多肽得率及多肽含量如表1。
表1：海参中海参多肽得率及多肽含量
与现有技术相比，本申请的海参多肽提取率较高，而且多肽的含量远高于现有技术，纯度接近80％，证明其可适合大规模工业生产、制备。
实施例5
将实施例3的降血压海参肽用蛋白质固相序列分析仪(Applied BiosystemsModel 476A,Perkin ElmerCo.MA,U.S.A)测定，得知该降血压海参肽的氨基酸全序列为FVAP。
基于分子对接使用软件Autodock(version 4.2)对实施例3的降血压海参肽进行分子模拟对接分析，多肽的空间结构由ChemDraw 11.0(Cambridge Soft Corporation,Cambridge,Massachusetts,USA)软件绘制。使用Open Babel GUI将多肽结构保存为mol2格式，以Tripos力场能量最小化原则构建多肽分子结构。在Autodock中进行质子化状态和氢取向的优化，并保存为pdbqt文件作为配体文件。采用Lamarkian genetic algorithm(LGA)进行对接的计算，并设置energy range＝4.0，exhaustiveness＝9.0，num modes＝30.0。
对接前，从蛋白数据库(PDB)中获取ACE的晶体结构(PDB:1J38)，并构建了蛋白肽的结构。利用Autoduck 4.2软件对活性肽在结合位点进行灵活对接，探索其相互作用机制。。
结果如图2所示，活性肽能够有效锚定在ACE的活性中心，并且占据活性空腔，活性肽主要与氨基酸残基ARG51、ALA338、TYR507、ALA340产生氢键，并且苯环与HIS367存在π-π共轭作用，能够有效抑制ACE的活性。
实施例6
将实施例3制备的降血压海参肽进行ACE抑制活性的测试
将50μL样品与50μL ACE溶液混合，在37℃下预孵育5min。然后，在混合物中加入125μL底物(8.3mM HHL在50mM硼酸钠缓冲液中，含0.5M NaCl，pH 8.3)启动反应。孵育60min后，加入125μL 1M HCl终止反应，再加入750μL乙酸乙酯提取所产生的马尿酸(HA)。离心(1000g，5min)后转移上层(500μL)，室温真空蒸发，直至乙酸乙酯完全脱除。然后将提取的HA溶解在1.5mL蒸馏水中，用紫外分光光度计在228nm处测定吸光度。ACE抑制活性的计算公式如下:
抑制ACE活性(％)＝(A1-A2)/(A1-A0)％；
式中，A1和A2表示在没有使用ACE抑制剂和使用ACE抑制剂时产生的HA含量，A0表示在没有使用ACE时产生的HA含量。
结果如图3所示，FVAP降血压海参肽抑制ACE活性效果显著，具有明显的抑制ACE活性的作用。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不应理解为必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例进行接合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (4)
1.一种降血压海参肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)海参加水均质，得到海参匀浆；
(2)根据3500U/g向海参匀浆加入中性蛋白酶和胰蛋白酶，调节pH到6-8，在50℃水温酶解6h，酶解时间结束后，沸水浴中灭酶15min，迅速冷却至室温，置于离心机中，以4000r/min离心15min，取上清液；
(3)将上清液超滤，收集分子量≤1000Da的海参肽；
(4)分子量≤1000Da的海参肽过SephadexG-15凝胶色谱柱，洗脱液为去离子水，流速为0.5mL/min，通过对各组分ACE酶活性抑制试验进行筛选，收集具有最佳降血压活性洗脱峰对应的组分，再利用RP-C18反相高效液相色谱纯化分离，上样量为100μL，流速为1mL/min，检测波长为215nm，洗脱液自含100％乙腈开始，至10％乙腈和90％0.1％三氟乙酸-水v/v的混合液结束，进行梯度洗脱，收集52％乙腈和48％0.1％三氟乙酸-水v/v处的洗脱峰对应的组分，即为降血压海参肽。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，中性蛋白酶和胰蛋白酶的比例为1:1.5。
3.如权利要求1或2所述的降血压海参肽的制备方法制得的降血压海参肽，其特征在于，其氨基酸序列为FVAP。
4.如权利要求3所述的降血压海参肽在制备降血压药物中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310674697.XA CN116478233A (zh) | 2023-06-08 | 2023-06-08 | 降血压海参肽及其制备方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310674697.XA CN116478233A (zh) | 2023-06-08 | 2023-06-08 | 降血压海参肽及其制备方法和应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116478233A true CN116478233A (zh) | 2023-07-25 |
Family
ID=87214107
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310674697.XA Pending CN116478233A (zh) | 2023-06-08 | 2023-06-08 | 降血压海参肽及其制备方法和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116478233A (zh) |
-
2023
- 2023-06-08 CN CN202310674697.XA patent/CN116478233A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN110655556B (zh) | 一种免疫调节肽的制备及方法 | |
| CN109320588B (zh) | 一种刺参来源的ace抑制活性肽 | |
| CN110590907B (zh) | 一种免疫调节肽的制备及分离纯化方法 | |
| CN104131055B (zh) | 一种藻红蛋白ace抑制肽的制备方法 | |
| WO2021197063A1 (zh) | 一种具有降血压功效的寡肽及其制备方法与应用 | |
| CN113248568A (zh) | 具有神经元保护功能的富硒蛹虫草活性硒肽及其制备方法和应用 | |
| CN103204904A (zh) | 一种抗前列腺癌赤魟软骨蛋白多肽及其制备方法和用途 | |
| CN105200108A (zh) | 一种海马血管紧张素转化酶抑制肽的制备方法 | |
| CN111995659B (zh) | 一种来源于牡丹籽粕的ace抑制肽 | |
| CN106589068B (zh) | 一种鲷鱼抗氧化多肽及其制备方法 | |
| CN116478233A (zh) | 降血压海参肽及其制备方法和应用 | |
| CN109810177A (zh) | 一种具有ace抑制活性的核桃粕多肽及其制备方法和应用 | |
| CN113845565B (zh) | 一种地龙生物活性小肽及其制备方法和应用 | |
| CN113480597B (zh) | 一种来源于紫苏籽粕的ace抑制肽及其制备方法与应用 | |
| CN109748951A (zh) | 一种当归抗氧化多肽及其制备方法与应用 | |
| CN112028970B (zh) | 一种牡丹籽粕ace抑制肽及其制备方法与应用 | |
| CN111825754B (zh) | 一种从芝麻蛋白中获得的具有降血压与降血糖活性的多肽 | |
| CN109694409B (zh) | 一种血管紧张素转化酶抑制活性功能肽及其应用 | |
| CN114032267A (zh) | 一种活性肽的制备方法和应用 | |
| CN112442112A (zh) | 一种银杏蛋白源ace抑制肽组合物及其制备方法和应用 | |
| CN117567562B (zh) | 南极磷虾ace抑制肽及其制备方法和应用 | |
| CN104877009B (zh) | 一种赤魟软骨多肽类血管生成抑制因子 | |
| CN118108795A (zh) | 一种白乌鱼ace抑制肽的制备方法及其应用 | |
| CN112961212B (zh) | 一类ace抑制肽及其制备方法和应用 | |
| CN113801195B (zh) | 一种金枪鱼鱼卵降血压肽及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |