CN104928228A - 一种提高乳杆菌抗氧化能力的方法及其乳杆菌饮料 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提高乳杆菌抗氧化能力的方法及其乳杆菌饮料，提高乳杆菌抗氧化能力的方法是其在培养基中添加NaCl以产生应激反应，从而提高乳杆菌抗氧化能力，包括，乳杆菌的培养：将乳杆菌37℃倒置培养至长出单菌落，挑单个菌落接种到液体MRS培养基，37℃静置培养12h，获得种子液；将上述种子液以2％接种量接种到含有NaCl的MRS培养基，37℃静置培养12h；离心，收集菌体，用所获得的菌体进行抗氧化实验。本发明以乳杆菌为材料，通过在含有NaCl的培养基中培养菌体，从而显著提高乳杆菌抗氧化的能力，对增强其在胃肠道中的存活率及产品开发具有重要的指导意义，且其能够有效解决山药成分饮料易沉淀易氧化褐变的问题。

Description

一种提高乳杆菌抗氧化能力的方法及其乳杆菌饮料

技术领域

本发明属于微生物技术领域，更具体地，本发明涉及一种提高乳杆菌抗氧化能力的方法及其乳杆菌饮料。

背景技术

在生物体体内存在着促氧化和抗氧化的动态平衡，当促氧化和抗氧化的动态平衡被打破并偏向于促氧化方向时，生物体形成的活性氧会针对性地破坏细胞膜、线粒体双层膜等不同生物膜脂质磷脂中的不饱和脂肪酸，形成不同高反应活性的氧化产物，如脂质过氧化物和丙二醛等，进一步作用于细胞的核酸和蛋白质，破坏细胞的正常功能，从而产生不同程度的氧化损伤。研究证实，氧化应激参与许多疾病的发病机理，一些人类疾病如高血脂、癌症、肺气肿、糖尿病、过度肥胖、动脉粥样硬化、肝硬化、关节炎、心血管疾病等都和氧化应激与自由基的作用有关，氧化还原代谢失衡已经成为许多疾病发生和发展的一个重要的基础病理过程。因此，机体氧化应激的干预和氧化还原失衡的重建成为了国内外研究的热点。

由于具有特定的生理功能和适宜生物加工的属性，乳酸菌已经成为食品与药物等相关产品的主要配料。乳酸菌虽然无法直接到达氧化应激部位与活性氧发生反应而起到抗氧化的作用，但是，国内外很多体内与体外实验研究证明，乳酸菌细胞和无细胞提取物在体外具有类似抗氧化剂的活性，在体内，摄入乳酸菌对机体活细胞的氧化应激具有显著的调节作用。目前公开的关于增加乳酸菌抗氧化能力的专利文献十分有限。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

鉴于上述和/或现有提高乳杆菌抗氧化能力的方法中存在的问题，提出了本发明。

因此，本发明的一个目的是提供一种提高乳杆菌抗氧化能力的方法，通过菌体在含有NaCl的培养基中培养能够显著提高乳杆菌的抗氧化能力。

为解决上述技术问题，本发明是提供如下技术方案：一种提高乳杆菌抗氧化能力的方法，其在培养基中添加NaCl以产生应激反应，从而提高乳杆菌抗氧化能力，包括，乳杆菌的培养：将乳杆菌37℃倒置培养至长出单菌落，挑单个菌落接种到液体MRS培养基，37℃静置培养12h，获得种子液；将上述种子液以2％接种量接种到含有NaCl的MRS培养基，37℃静置培养12h；离心，收集菌体，用所获得的菌体进行抗氧化实验。

作为本发明所述的提高乳杆菌抗氧化能力的方法的一种优选方案，其中：乳杆菌在含NaCl培养基中培养，所述含NaCl培养基浓度为1％～11％NaCl。

作为本发明所述的提高乳杆菌抗氧化能力的方法的一种优选方案，其中：所述离心，其速度为4500rpm。

本发明另一个目的是提供一种富含抗氧化能力强的乳杆菌饮料，其能够有效解决山药淀粉多饮料易沉淀以及易氧化褐变的问题。

根据本发明的一个方面，本发明提供了如下技术方案：一种乳杆菌饮料，其包括，打浆：将山药与水溶液按照质量体积比1﹕2～4添加，打浆10～20min，并过滤；酶解液化：将山药过滤液边搅拌边加热至65～75℃，随后加入淀粉酶，其加酶量按山药质量计分别为0.1～0.4mL/kg，同时按照每2℃/min的升温速度加热混合液，使温度从首次加热后的温度升至100℃，而后将混合液瞬时高温灭酶3～5s，冷却至35～45℃，得到液化后的山药液；发酵：将液化后的山药液按山药液质量的2～5％接种如权利要求1～3任一所述的提高抗氧化能力的乳杆菌，在30～40℃恒温下，发酵10～20h，当pH为5.0以下时发酵结束，过滤，制得山药汁发酵液；调配：按山药汁发酵液质量百分比的10～20％加入糖；均质：将调配后的山药过滤液于30～40MPa下均质、脱气、分装；灭菌：将分装后的均质液于90℃下杀菌30min，即得山药发酵饮料。

作为本发明所述乳杆菌饮料的一种优选方案，其中：所述发酵中接种量为按山药液质量的2～3％。

作为本发明所述乳杆菌饮料的一种优选方案，其中：所述酶解液化中，加入淀粉酶包括第一淀粉酶和第二淀粉酶，其加酶量按山药质量分别为0.1～0.3mL/kg和0.2～0.4mL/kg，所述第一淀粉酶最适温度为70～75℃，所述第二淀粉酶最适温度为90～95℃。

作为本发明所述乳杆菌饮料的一种优选方案，其中：所述第一淀粉酶和第二淀粉酶分别为中温α-淀粉酶和耐高温α-淀粉酶。

作为本发明所述乳杆菌饮料的一种优选方案，其中：所述酶解液化中，利用超声波辅助酶解，其超声波功率500～1000w，频率为15～25kHz，超声时间4～8min，当升至100℃后保温5min。

作为本发明所述乳杆菌饮料的一种优选方案，其中：所述发酵，在35～40℃恒温下，一并采用功率300～1000w，频率20kHz的低频超声波辅助发酵1～2h后，继续发酵10～20h。

本发明通过对乳杆菌在含NaCl的培养基中培养，通过体外实验发现在含有NaCl培养基中培养后提高了乳杆菌抗氧化的能力，为了解盐应激及其产生的协同保护在乳杆菌益生功能中发挥的作用提供了依据。且本发明制备的乳酸菌发酵液被直接食用后，经过胃肠道环境后，最终在肠道中的活菌数比未在含有NaCl培养基中培养的乳杆菌多，可以达到更佳的保健效果，且其能够有效解决山药成分饮料易沉淀易氧化褐变的问题。

附图说明

图1是不同NaCl浓度培养下植物乳杆菌TH103对DPPH自由基的清除率示意图；

图2是不同NaCl浓度培养下植物乳杆菌TH103对HO自由基的清除率示意图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面通过具体实施方式做详细的说明。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。

实施例1、菌种的培养

1、将乳杆菌在De Man，Rogosa and Sharpe medium(MRS)固体平板上划线，37℃倒置培养至长出单菌落，挑单个菌落接种到液体MRS培养基，37℃静置培养12h；

2、上述培养液以2％接种量接种到含有1％～11％NaCl及不含有NaCl的MRS培养基，37℃静置培养12h后得到不同NaCl浓度下含有乳杆菌的培养液。

实施例2、乳杆菌体外耐受过氧化氢

取1mL在含有及不含有NaCl(选取的NaCl浓度为：不含盐、2％、4％、6％、8％、10％)培养基中培养的乳杆菌细胞悬液，分别加入到9mL不同浓度的过氧化氢溶液(终浓度分别为0、0.5、1.0、1.5、2.0mmol/L)中，37℃下孵育1min后取0.1mL样品加入到9.9mL过氧化氢酶溶液(0.2g/L)中以终止过氧化氢对细胞的作用，然后采用平板计数方法对样品中残留的活细胞进行计数，根据初始菌数计算存活率(％)。植物乳杆菌TH103抗氧化存活率见表1。

表1植物乳杆菌TH103抗氧化存活率(％)

ND：表示未检出

由表1可知，在含有NaCl的培养基中培养的乳杆菌菌体抗氧化性能明显高于在不含NaCl的培养基中培养的菌体，且随着NaCl浓度的增加乳杆菌的抗氧化能力也随之提高。

实施例3、乳杆菌体外清除两种自由基能力的测定

乳杆菌完整细胞悬液和乳杆菌无细胞提取物的制备：

将在不同NaCl浓度培养基中培养的植物乳杆菌TH103培养物在4℃4000r/min下离心10min，收集菌体，用无菌去离子水洗涤三次，然后用无菌去离子水将植物乳杆菌TH103细胞重新悬浮，调节植物乳杆菌TH103细胞终浓度为1.0×10⁸cfu/mL，得到不同NaCl浓度培养下的植物乳杆菌TH103完整细胞悬液。将制备得到不同NaCl浓度培养下的完整细胞悬液在超声波破碎仪(Sonics&Materials公司，VCX500型)，功率为280W条件下，冰浴中每超声处理5s、间隔5s，超声粉碎10min，并经显微镜下检查没有完整细胞菌体，然后4℃6000r/min离心10min，弃沉淀，上清部分即为不同NaCl浓度培养下的植物乳杆菌TH103无细胞提取物。

1、乳杆菌清除自由基(DPPH·)能力的测定

分别取不同NaCl浓度培养下的植物乳杆菌TH103完整细胞悬液(IC)和无细胞提取物(CFE)样品各2mL，加入1mLDPPH·溶液(0.2mmol/L，使用无水乙醇配置)，混合均匀后置于室温温度下遮光反应30min，然后6000r/min离心10min，取上清部分，测定样品在波长517nm处的吸光度，测3次平行值。空白组样品以等体积无水乙醇样品代替DPPH·无水乙醇溶液，对照组样品以等体积蒸馏水代替样品溶液，并分别用等体积蒸馏水和无水乙醇混合液空白调零。清除率按公式(a)计算：其中A0为对照组吸光度，Ai为样品组吸光度，Aj为空白组吸光度。

不同NaCl浓度培养下的植物乳杆菌TH103悬液和无细胞提取液对DPPH自由基的清除率见图1。由图1可以看出，在含有NaCl培养基培养的乳杆菌对DPPH自由基的清除率高于在不含有NaCl培养基培养的乳杆菌；而且随着NaCl浓度的增加，植物乳杆菌TH103悬液和无细胞提取液对DPPH自由基的清除率也随之增加，当NaCl达到6％时，乳杆菌对DPPH自由基的清除率超过了60％。

2、乳杆菌清除HO·羟自由基能力的测定

向具塞试管中依次加入1mL硫酸亚铁(FeSO4)溶液(5mmol/L)，1mL水杨酸-乙醇溶液(5mmol/L)，1mL过氧化氢溶液(3mmol/L)，混合均匀，然后向上述体系中加入1mL不同NaCl浓度培养下的植物乳杆菌TH103的IC和CFE样品，37℃恒温水浴中反应15min后6000r/min离心10min，以双重蒸馏水作参比，在波长510nm下测定吸光度A_510nm，吸光值数据平行测定3次。清除率计算按照公式(b)进行，其中A₀为对照样品在510nm的吸光度，A_x为加入待测的不同NaCl浓度培养下的植物乳杆菌TH103样品后在510nm的吸光度。不同NaCl浓度培养下的植物乳杆菌TH103悬液和无细胞提取液对DPPH自由基的清除率见图2。

由图2可以看出，在含有NaCl培养基培养的乳杆菌对HO.自由基的清除率高于在不含有NaCl培养基培养的乳杆菌；而且随着NaCl浓度的增加，植物乳杆菌TH103悬液和无细胞提取液对HO·自由基的清除率也随之增加，当NaCl达到6％时，乳杆菌对HO·自由基的清除率超过了70％。

实施例4、乳杆菌螯合亚铁离子和铜离子能力的测定

1、植物乳杆菌TH103螯合亚铁离子能力的测定

将0.5mL不同NaCl浓度(选取的NaCl浓度为：不含盐、2％、4％、6％、8％、10％)培养下的植物乳杆菌TH103无细胞提取物与0.1mL抗坏血酸溶液(10g/L)、0.1mL硫酸亚铁溶液(4g/L)和1mL氢氧化钠溶液(0.2mol/L)混合，37℃水浴20min，然后加入0.2mL三氯乙酸(10％)，3000r/min离心10min，上清液中加入0.5mL邻菲罗啉(1g/L)溶液，反应10min后在510nm波长下测定吸光度。植物乳杆菌TH103螯合亚铁离子能力见表2。

2、植物乳杆菌TH103螯合铜离子能力的测定

将0.1mL不同NaCl浓度(选取的NaCl浓度为：不含盐、2％、4％、6％、8％、10％)培养下的植物乳杆菌TH103无细胞提取物,0.1mLCuSO4溶液(100μmol/L)，0.2mL盐酸(0.02mol/L)和0.1mLHOCl(0.5g/dL)混合，37℃孵育20min，加入吡咯烷二硫代甲酸铵盐(APDTC，0.1g/dL)反应5min，然后加2mL入氯仿，剧烈震荡1min得到提取液，在269波长下测定提取液的吸光值。植物乳杆菌TH103螯合铜离子能力见表2。

表2不同NaCl浓度培养下的植物乳杆菌TH103对亚铁离子和铜离子的螯合(mg/kg)

由表2可以看出，不同NaCl浓度培养下的植物乳杆菌TH103螯合亚铁离子和铜离子的能力存在差异，在含有NaCl培养基培养的乳杆菌螯合亚铁离子和铜离子的能力高于在不含有NaCl培养基培养的乳杆菌。随着盐浓度的增加，植物乳杆菌TH103螯合亚铁离子和铜离子的能力也随之增加，在8％NaCl培养下植物乳杆菌TH103螯合亚铁离子和铜离子的能力达到最高，在10％NaCl培养下植物乳杆菌TH103螯合亚铁离子和铜离子的能力与在8％NaCl培养下没有显著差异。

实例5、山药乳杆菌饮料的制备

选取新鲜、球茎完好和无病虫害的山药50kg，经流水清洗3遍。立刻放入100L水中，打浆20min，并经200目不锈钢网筛过滤。将滤液泵入液化罐中，边搅拌边加热至70℃，随后加入中温α-淀粉酶5mL和耐高温α-淀粉酶10mL。按照每5min升高10℃的升温速度加热山药液，使温度从70℃升到100℃，此过程中利用超声辅助酶解，超声功率1000w，频率为20kHz，超声时间8min，当升至100℃后保温5min，总共耗时20min。将料液瞬时高温灭酶3s，冷却至40℃。将液化后的山药液泵入无菌发酵罐中，按山药液重量的3％接种已经提高抗氧化能力的乳杆菌。然后，在38℃下恒温发酵，初期采用功率1000w，频率20kHz的低频超声辅助发酵累计时间2h，随后停止超声继续发酵10h，当pH为4.0时发酵结束，过滤，制得山药汁发酵液。按发酵滤液重量百分比的10％加入白砂糖，搅拌均匀后，于均质机40MPa下均质2次，脱气，分装，于90℃下杀菌30min，即得山药发酵饮料。

实验采用单因素试验设计，选用20只体重相近的6周龄BABC/L雄性小鼠，随机分为2组，对照组饲喂基础饲粮，每天灌胃1mL未经抗氧化能力提高的山药乳杆菌饮料；实验组饲喂基础饲粮，每天灌胃1mL富含抗氧化能力的乳杆菌饮料。实验组每天每组3个重复，每个重复3只小鼠，饲喂1个月后处死小鼠，解剖，取盲肠，手术线将两端扎紧，立即送入实验室进行大肠杆菌及乳杆菌数量测定。用1g肠道内容物中细菌数量的对数表示，即log cfu/g。

表1富含抗氧化能力的山药乳饮料对小鼠肠道菌群数量的影响

*：同列不同的字母代表差异显著(p≤0.05)。

产品实验测定：

所得产品感官正常，每100g鲜山药含碳水化合物占18.5g，蛋白质4.6g，膳食纤维1.4g，乳杆菌的数量由原来的7.6±0.2log cfu/g增加为9.5±0.1logcfu/g，且存储实验证明，富含抗氧化能力提高的乳杆菌的山药乳饮料，存储20～35天饮料不发生沉淀以及变色，而没有富含抗氧化能力提高的乳酸菌的山药乳饮料2天左右即开始变黄变褐。

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (9)

1.一种提高乳杆菌抗氧化能力的方法，其特征在于：在培养基中添加NaCl以产生应激反应，从而提高乳杆菌抗氧化能力，包括，

乳杆菌的培养：将乳杆菌37℃倒置培养至长出单菌落，挑单个菌落接种到液体MRS培养基，37℃静置培养12h，获得种子液；

将上述种子液以2％接种量接种到含有NaCl的MRS培养基，37℃静置培养12h；

离心，收集菌体，用所获得的菌体进行抗氧化实验。

2.根据权利要求1所述的提高乳杆菌抗氧化能力的方法，其特征在于：乳杆菌在含NaCl培养基中培养，所述含NaCl培养基浓度为1％～11％NaCl。

3.根据权利要求1所述的提高乳杆菌抗氧化能力的方法，其特征在于：所述离心，其速度为4500rpm。

4.一种乳杆菌饮料，其特征在于：包括，

打浆：将山药与水溶液按照质量体积比1﹕2～4添加，打浆10～20min，并过滤；

酶解液化：将山药过滤液边搅拌边加热至65～75℃，随后加入淀粉酶，其加酶量按山药质量计分别为0.1～0.4mL/kg，同时按照每2℃/min的升温速度加热混合液，使温度从首次加热后的温度升至100℃，而后将混合液瞬时高温灭酶3～5s，冷却至35～45℃，得到液化后的山药液；

发酵：将液化后的山药液按山药液质量的2～5％接种如权利要求1～3任一所述的提高抗氧化能力的乳杆菌，在30～40℃恒温下，发酵10～20h，当pH为5.0以下时发酵结束，过滤，制得山药汁发酵液；

调配：按山药汁发酵液质量百分比的10～20％加入糖；

均质：将调配后的山药过滤液于30～40MPa下均质、脱气、分装；

灭菌：将分装后的均质液于90℃下杀菌30min，即得山药发酵饮料。

5.根据权利要求4所述的乳杆菌饮料，其特征在于：所述发酵中接种量为按山药液质量的2～3％。

6.根据权利要求4所述的乳杆菌饮料，其特征在于：所述酶解液化中，加入淀粉酶包括第一淀粉酶和第二淀粉酶，其加酶量按山药质量分别为0.1～0.3mL/kg和0.2～0.4mL/kg，所述第一淀粉酶最适温度为70～75℃，所述第二淀粉酶最适温度为90～95℃。

7.根据权利要求4所述的乳杆菌饮料，其特征在于：所述第一淀粉酶和第二淀粉酶分别为中温α-淀粉酶和耐高温α-淀粉酶。

8.根据权利要求4或5所述的乳杆菌饮料，其特征在于：所述酶解液化中，利用超声波辅助酶解，其超声波功率500～1000w，频率为15～25kHz，超声时间4～8min，当升至100℃后保温5min。

9.根据权利要求4～6任一所述的乳杆菌饮料，其特征在于：所述发酵，在35～40℃恒温下，一并采用功率300～1000w，频率20kHz的低频超声波辅助发酵1～2h后，继续发酵10～20h。